483 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015

KARAKTERISASI SECARA MORFOLOGI DAN BIOMOLEKULER BAKTERIPENYEBAB VIBRIOSIS PADA UDANG PENAEID

Ince Ayu Khairana Kadriah, Koko Kurniawan, dan Muharijadi AtmomarsonoBalai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Payau

Jl. Makmur Dg. Sitakka No. 129, Maros 90512, Sulawesi SelatanE-mail: inceayu@gmail.com

ABSTRAK

Pendekatan konvensional untuk karakterisasi, dan identifikasi bakteri Vibrio berpendar antara lain didasarkanpada karakterisasi sifat-sifat fenotipik yang berbasis kultur. Karakterisasi yang berbasis biomolekuler dilakukandengan mengamati karakterisasi gen 16S-rRNA isolat berbasis PCR dan dilanjutkan dengan analisis urutanbasa-basanya dengan metode sekuensing. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis keragaman morfologidan genetik bakteri Vibrio. sp. berpendar yang diisolasi dari tambak-tambak udang di Maros, Takalar danPinrang serta dari panti pembenihan di Barru, Banyuwangi dan Bali. Karakteristik morfologi yang diamatiadalah bentuk, warna, bau dan kemampuan pendaran koloni. Perbedaan karakteristik kemudian dikonfirmasisecara biomolekuler berdasarkan sekuensing gen 16S-rRNA yang selanjutnya disejajarkan dengan sekuenbakteri yang terdeposit pada NCBI. Hasil pengamatan morfologi menunjukkan bakteri Vibrio patogen memilikikarakteristik morfologi warna koloni hijau, bentuk koloni bundar dengan elevasi cembung dan dapatmemendarkan cahaya bila diamati di ruang gelap. Tiga isolat Vibrio patogen (By-1, M-120 dan P-275)teridentifikasi secara biomolekuler sebagai V. harveyi berdasarkan sekuensing gen 16Sr-RNA. Sedangkanisolat T-170 teridentifikasi sebagai V. parahaemolyticus.

KATA KUNCI: karakter morfologi, biomolekuler, gen 16S-rRNA, vibriosis

PENDAHULUAN

Kejadian serangan vibriosis yang sering mematikan benur pada panti-panti pembenihan secaramassal biasanya diawali dengan fenomena air bercahaya. Pendaran cahaya yang terlihat di air dan dibenur disebabkan adanya infeksi bakteri Vibrio berpendar. Bakteri Vibrio berpendar ini biasanyamenyerang sistem pembenihan baik telur, larva maupun lingkungan pemeliharaan (Baticados et al.,1990). Populasi bakteri Vibrio yang sudah mencapai quorum bisa berubah sifatnya dari saprofit menjadipatogen dan kemudian bersepakat untuk bersama-sama “menyalakan lampu (biolumenescence)” sambilmelepaskan toksin yang dapat mematikan udang dengan cepat.

Pada studi mengenai infeksi bakteri patogen terhadap udang, kegiatan pertama yang biasadilakukan jika terjadi serangan adalah melakukan analisis gejala klinis hewan budidaya yang terserangpenyakit. Setelah itu dilanjutkan dengan analisis patologi anatomi. Analisis ini penting untukmengetahui jenis bakteri yang menyerang dari ciri-ciri morfologi udang yang terserang maupun ciri-ciri morfologi koloni bakteri yang diisolasi dari air, sedimen dan udang sakit.

Pesatnya perkembangan teknik biologi biomolekuler menawarkan peluang baru yang signifikanuntuk penelitian diagnosis penyakit ikan. Menggunakan asam nukleat sebagai target, dan metodebaru yang menganalisis polimorfisme dalam asam nukleat, dapat meningkatkan spesifisitas,sensitivitas dan kecepatan diagnosis serta menawarkan cara baru untuk memeriksa hubungan antaragenotip dan fenotip dari berbagai patogen. Kemajuan dalam teknik PCR sangat membantu studiepidemiologi serta identifikasi penyebab wabah penyakit atau deteksi patogen (Cunningham, 2002).

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jenis bakteri Vibrio berpendar yang sering ditemukanmenjadi penyebab utama Vibriosis di tambak-tambak budidaya udang penaeid di Indonesia khususnyadi Sulawesi Selatan. Karakterisasi jenis bakteri Vibrio dilakukan dengan dengan mengamati morfologidan dilanjutkan uji biomolekuler berbasis gen 16S-rRNA.

484Karakterisasi secara morfologi dan biomolekuler ..... (Ince Ayu Khairana Kadriah)

METODE PENELITIAN

Isolasi Bakteri Vibrio Berpendar

Sebelum dilakukan uji karakterisasi morfologi bakteri, terlebih dahulu dilakukan isolasi kolonibakteri Vibrio berpendar dari kejadian penyakit di tambak udang dan panti pembenihan. BakteriVibrio diisolasi dari air laut, air tambak, sedimen tambak dan udang sakit. Sampel air diambil denganmenggunakan botol steril kemudian dibawa ke laboratorium. Sedangkan sampel sedimen diambilmenggunakan sudip steril dan dibawa ke laboratorium menggunakan botol steril. Isolasi bakteriVibrio dilakukan dengan cara mengambil 1 mL air sampel dan 1 g sedimen tambak kemudiandiencerkan secara bertingkat dalam 9 mL larutan fisiologis (Benson 1985) dan dikultur pada mediaTCBSA (Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose Agar). Bakteri juga diisolasi dari benur sakit yang digeruskemudian dikultur pada media agar. Koloni bakteri berpendar yang tumbuh kemudian dimurnikandengan cara ditanam kembali pada media TCBSA dalam cawan petri serta pada media TSA (TrypticSoy Agar) dalam tabung reaksi dengan metode gores dan diinkubasi pada suhu 280C.

Karakterisasi Secara Morfologi

Isolat terpilih kemudian diamati karakter morfologinya dengan mengamati bentuk koloni, warna,bau dan kemampuan berpendarnya. Pengamatan karakter morfologi isolat bakteri dilakukanmenggunakan agar TCBS. Seleksi awal isolat bakteri dilakukan berdasarkan pertumbuhan dankemampuan pendarannya. Isolat bakteri yang tetap dapat tumbuh dengan baik serta tetap berpendarsetelah diremajakan kemudian dipilih untuk uji karakterisasi secara biomolekuler.

Karakterisasi Secara Biomolekuler

Karakterisasi secara biomolekuler dilakukan dengan membandingkan sekuen gen 16S-rRNA isolatbakteri dengan sekuen gen 16S-rRNA yang terdeposit di NCBI. Pada uji karakterisasi dengan teknikbiomolekuler ini dilakukan pengujian untuk tujuan identifikasi spesies. Pada tahap ini diketahuikarakter gen 16S-rRNA dari isolat bakteri Vibrio patogen yang diisolasi dari lokasi berbeda berdasarkanurutan DNA hasil sekuensing yang dilanjutkan dengan uji BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).Hasil alignment kemudian dibuat pohon filogeninya menggunakan perangkat lunak dari situs EuropeanBioinformatics Institute (EBI) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2) untuk mengetahui kekerabatanisolat bakteri koleksi dengan bakteri sejenis yang terdeposit pada NCBI (National Center for BiotechnologyInformation) (Gambar 1).

Sebelum dilakukan karakterisasi secara biomolekuler dengan amplifikasi DNA menggunakanmetode PCR, terlebih dahulu dilakukan isolasi genom menggunakan metode Phenol-Chloroform yangtelah dikembangkan oleh Parenrengi et al. (2000). Tahapan ekstraksinya diawali dengan kultur bakteri.Bakteri dikultur di dalam Nutrient broth selama 4 jam kemudian dipanen dengan cara sentrifugasi.Sebanyak 1 mL biakan bakteri dipindahkan kedalam tabung mikro steril 1,5 mL dan disentrifugasi(6.000 rpm selama 10 menit). Proses sentrifugasi diulang sebanyak dua kali dan kemudian dilakukanpencucian dengan larutan fisiologis juga dengan sentrifugasi. Pelet bakteri yang dihasilkan kuranglebih 50 mg kemudian dicampur dengan 500 µL lysis bufer, 20 µL proteinase-K (stok 20 mg/mL) dan40 µL sodium dodecyl sulfate (SDS) 10%. Setelah itu, biakan bakteri diinkubasi dalam waterbathselama 1–3 jam pada suhu 550C. Penambahan 12,5 µL RNAse dilakukan sebelum biakan disimpanpada suhu ruang selama 15-30 menit. Selanjutnya ditambahkan Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol(PCIA 25:24:1) sebanyak 500 µL. Tabung mikro divortex secara perlahan sampai homogen dan disimpanpada suhu ruang selama 10 menit. Selanjutnya disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 8menit. Lapisan paling atas diambil dan dipindahkan ke tabung mikro baru dan dilakukan penambahanPCIA seperti sebelumnya. Setelah lapisan paling atas dipindahkan ke tabung mikro baru, dilakukanpenambahan satu bagian larutan Chloroform:Isoamyl alcohol (CIA 24:1) dan disentrifugasi selama 4menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Lapisan paling atas dipindahkan ke tabung mikro baru secarahati-hati dengan menghindari interphase. Kemudian dua bagian ethanol absolut dingin ditambahkanke dalam tabung mikro yang berisi larutan DNA dan dicampur perlahan sampai homogen. Dilakukansentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 30 menit. Cairan dibuang kemudian pellet DNA

485 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015

dicuci dengan 1 mL ethanol 70% kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 15menit. Pelet DNA dikeringkan selama satu malam dan setelah kering ditambahkan 100 µL Bufer Tris-Etilen Diamin Tetra Aceticacid (EDTA) (TE) dan selanjutnya disimpan pada suhu -200C sampaidigunakan. Kualitas DNA genom hasil ekstraksi dapat dilihat melalui analisis elektroforesis pada gelagarosa 0,8%.

Setelah genom bakteri berhasil diisolasi, proses selanjutnya adalah amplifikasi gen 16S-rRNA dariisolat bakteri hasil koleksi dengan metode PCR. Proses PCR dilakukan menggunakan Kit PCR Ready ToGo (RTG) dengan pasangan primer 0008F dan 1492RH (Yuhana, 2008). Proses PCR untukmemperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus suhu yang berulang dan masing-masing siklusterdiri atas tiga tahapan yaitu denaturasi, annealing dan elongasi.

HASIL DAN BAHASAN

Isolasi dan Karakterisasi Secara Morfologi Bakteri Vibrio Berpendar

Proses isolasi bakteri Vibrio yang dilakukan dari sampel benur sakit, sedimen tambak, air tambakdan air laut di sekitar Sulawesi Selatan, Banyuwangi dan Bali menghasilkan 35 isolat Vibrio berpendaryang dapat terus tumbuh dengan baik tanpa mengalami kontaminasi dan perubahan morfologi(Tabel 1). Koloni tunggal isolat Vibrio ditumbuhkan pada media agar TSA miring dan disimpan padasuhu 370C. Bakteri hasil isolasi ditumbuhkan pada media selektif Vibrio (TCBSA) untuk diamatikarakteristik morfologinya. Koloni bakteri hijau dengan bentuk bundar, tidak beraturan, elevasicembung dan agak rata, tepian licin dan berlekuk (Gambar 2). Morfologi koloni bakteri Vibrio patogenyang menyerang pada kasus Vibriosis umumnya berwarna hijau (green colony) jika ditumbuhkan dimedia agar-agar TCBS dengan bentuk koloni bulat, cembung mengkilap, elevasi rata dan terlihatmemendarkan cahaya bila diamati di ruang gelap (Moriarty, 1998).

Seleksi awal isolat bakteri dilakukan berdasarkan pertumbuhan dan kemampuan pendarannya.Isolat bakteri yang tetap dapat tumbuh dengan baik serta tetap berpendar setelah diremajakankemudian dipilih untuk uji karakterisasi secara biomolekuler. Dari 35 isolat bakteri Vibrio berpendaryang diisolasi dan diamati karakter morfologinya, dipilih 12 isolat untuk diuji karakterisasinya secarabiomolekuler.

Gambar 1. Alur penelitian karakterisasi isolat bakteri secara biomolekuler

486Karakterisasi secara morfologi dan biomolekuler ..... (Ince Ayu Khairana Kadriah)

Karakterisasi Secara Biomolekuler Bakteri Vibrio Berpendar

Karakterisasi secara biomolekuler dilakaukan dengan membandingkan sekuen gen 16S-rRNA isolatbakteri dengan sekuen gen 16S-rRNA yang terdeposit di NCBI. Hasil penelusuran sekuen gen Vibriopatogen di NCBI akan dijadikan rujukan untuk menentukan spesies dari koloni bakteri yang dikoleksi.Pada Tabel 2 ditampilkan hasil penelusuran di laman NCBI berupa beberapa sekuen gen 16S-r RNAspesies bakteri Vibrio. Hasil alignment dari 12 isolat terpilih digunakan untuk membuat pohon filogenidari isolat bakteri Vibrio berpendar menggunakan perangkat lunak EBI (Gambar 3 dan Tabel 3). PadaGambar 3 dapat dilihat 5 isolat teridentifikasi sebagai V. harveyi (isolat-isolat: By-1, P-275, M-120, T-672, dan T-673), 1 isolat V. campbelli (isolat Nb-2) dan 6 isolat diidentifikasi sebagai V. parahaemolyticus

Kode Isolat Asal Daerah Jenis SampelBy-1 Banyuwangi Benur sakitNb-2 Negara-Bali Benur sakitGb-3 Gondol-Bali Benur sakit

T-109 Takalar Air tambakT-110 Takalar Air tambakT-111 Takalar Air tambakM-112 Maros Sedimen tambakM-114 Maros Air LautM-115 Maros Air tambakM-116 Maros Air tambakM-119 Maros Air tambak M-120 Maros Air tambakM-128 Maros Air tambakM-130 Maros Air tambakM-133 Maros Air tambakM-137 Maros Air tambakM-139 Maros Air tambakM-144 Maros Air tambakM-145 Maros Air tambakM-154 Maros Air tambakM-159 Maros Air tambakT-671 Takalar Air tambakT-672 Takalar Air tambakT-673 Takalar Air tambakT-675 Takalar Air tambakT-676 Takalar Air tambak

M-5575 Maros Air tambakM-5582 Maros Sedimen tambakM-5584 Maros Sedimen tambakM-5585 Maros Sedimen tambakT-168 Takalar Air tambakT-170 Takalar Air tambakT-173 Takalar Air tambakP-275 Pinrang Air tambakP-276 Pinrang Sedimen tambak

Tabel 1. Isolat bakteri Vibrio berpendar yang diisolasi dari berbagai daerah

487 Prosiding Forum Inovasi Teknologi Akuakultur 2015

Gambar 2. Karakterisasi morfologi bakteri Vibrio patogen padamedia TCBSA. V. harveyi, B. V. campbelli

(isolat-isolat: Gb-3, M-109, M-154, M-5582, T-168 dan T-170) (Tabel 3). Hasil karakterisasi secaramolekuler memperlihatkan adanya beberapa perbedaan spesies bakteri yang diperoleh dengan hasilidentifikasi spesies dari uji biokimia. Beberapa spesies bakteri yang memiliki kekerabatan genetikyang cukup dekat dengan V. harveyi seperti V. parahaemolyticus, V. alginolyticus dan V. campbellii sulituntuk dibedakan dengan menggunakan metode uji biokimia (Kita-Tsukamoto et al., 1993). Identifikasi

No. Kode Spesies1. HM749745VcomCAIM1816 V. parahaemolyticus2. VhLB15 V. harveyi3. FJ3869581VpAn3 V. parahaemolyticus4. D11309Vnat V. natriegens5. D11308Vmi V. mimicus6. EF467290Vpar V. parahaemolyticus7. JN5957861VpES05 V. parahaemolyticus8. SG358 V. campbelli9. Vcam16S V. campbelli

Tabel 2. Sekuen DNA gen 16S r-RNA dari NCBI yang menjadi rujukanpada Gambar 3

No.Isolat Asal Kerabat terdekat hasil Alignment (BLAST)By-1 Banyuwangi V. harveyiNb-2 Negara-Bali V. campbelliGb-3 Gondol-Bali V. parahaemolyticus

M-109 Takalar V. parahaemolyticusM-5582 Maros V. parahaemolyticusM-120 Maros V. harveyiM-154 Maros V. parahaemolyticusT-672 Takalar V. harveyiT-673 Takalar V. harveyiT-168 Takalar V. parahaemolyticusT-170 Takalar V. parahaemolyticusP-275 Pinrang V. harveyi

Tabel 3. Hasil identifikasi spesies isolat secara molekuler dengan gen 16S-rRNA

488Karakterisasi secara morfologi dan biomolekuler ..... (Ince Ayu Khairana Kadriah)

spesies dilakukan berdasarkan hasil pensejajaran sekuen DNA isolat bakteri uji dengan sekuen DNAyang terdeposit pada NCBI.

Hasil uji BLAST yang dilanjutkan dengan pembuatan pohon filogeni (Gambar 3) menunjukkanada lima grup bakteri. Grup 1 menunjukkan isolat Nb-2 secara genetik memiliki kedekatan dengan V.campbelli. Pada grup 2 terlihat bahwa isolat Gb-3 memiliki kedekatan dengan V. parahaemolyticus.Pada grup 3 isolat-isolat P-275, By-1, T-672, dan T-673 teridentifikasi memiliki kedekatan secaragenetis dengan bakteri V. harveyi. Pada grup 4 isolat-isolat T-170, M-5582, M-154 dan 6iL (isolatVibrio patogen dari ikan kerapu) teridentifikasi memiliki kedekatan secara genetik dengan bakteri V.parahaemolyticus. Sedangkan grup 5 isolat 4us dan 2us terlihat memiliki kedekatan dengan V. natriegensdan V. mimicus.

KESIMPULAN

Karakterisasi secara morfologi tidak dapat membedakan antara beberapa spesies bakteri Vibrioberpendar patogenik. Hasil uji karakterisasi secara biomolekuler menunjukkan terdapat 5 kelompokspesies Vibrio berdesarkan kedekatannya secara genetis. Terdapat hubungan kekerabatan yang cukupdekat antara V. harveyi (673) yang diisolasi dari Maros dengan V. harveyi yang diisolasi dari Banyuwangi.Demikian pula dengan V.parahaemolyticus yang diisolasi dari Gondol dengan V.parahaemolyticus yangdiisolasi dari Maros (109).

DAFTAR ACUAN

Baticados, MCL., Lavilla-Pitogo, C.R., Cruz-Lacierda, E.R., de la Pena, L.D., & Sunaz, N.A. (1990). Studieson the chemical control of luminous bacteria Vibrio harveyi and V. splendidus isolated from diseasedPenaeus monodon larvae and rearing water. Dis Aqua Org, 9, 133-139.

Cunningham, C.O. (2002). Molecular diagnosis of fish and shellfish diseases: present status andpotential use in disease control. Aquaculture, 20, 19-55.

Kita-Tsukamoto, K., Oyaizu, H., Nanba, K., & Simidu, U. (1993). Phylogenetic relationships of marinebacteria, mainly members of the family Vibrionaceae, determined on the basis of 16S rRNA sequences.Int J Syst Bacteriol, 43, 8–19.

Moriarty, D.J.W. (1998). Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds. Aquaculture,168, 351-358.

Parenrengi, A. (2000). Studies on genetic variability of groupers (Genus: Epinephelus) from Indo-Malaysianwaters using PCR-RAPD Analysis. [Thesis master of Science], Terengganu: Kolej UniversityTerengganu, Universiti Putra Malaysia.

Gambar 3. Pohon filogeni hasil alignment