sel kanker serviks pada titanium nanotubular untuk pengobatan kanker serviks Jara Crear , Kim M Kummer , dan Thomas J Webster Penulis informasi ► Copyright dan informasi Lisensi ►

Abstrak

Kanker serviks dapat diobati dengan bedah reseksi, kemoterapi, dan / atau radiasi. Biomaterial titanium telah diusulkan sebagai alat untuk membantu dalam pengiriman lokal agen kemoterapi dan / atau radiasi ke situs kanker serviks. Namun, perangkat medis titanium saat ini digunakan untuk mengobati kanker serviks tidak dengan sendirinya memiliki apapun sifat antikanker; perangkat seperti bertindak sebagai pembawa untuk agen farmasi atau sumber radiasi dan bahkan memungkinkan untuk pertumbuhan sel-sel kanker. Berdasarkan studi, yang telah menunjukkan penurunan paru, fungsi payudara, dan sel kanker tulang pada berstrukturnano dibandingkan dengan polimer nanosmooth, tujuan masa kini in vitro studi adalah untuk mengubah titanium untuk memiliki fitur permukaan nanotubular dan menentukan adhesi sel kanker serviks setelah 4 jam . Di sini, titanium anodized untuk memiliki fitur permukaan nanotubular. Hasil menunjukkan kemampuan untuk mengurangi adhesi sel kanker serviks dengan sekitar setengah dari nanotubular dibandingkan dengan saat ini digunakan nanosmooth titanium (tanpa menggunakan kemoterapi atau radiasi), membuka berbagai kemungkinan penggunaan nanotubular titanium dalam pemberian obat atau radiasi pengobatan lokal kanker serviks.

Kata kunci: kanker, titanium, nanotubular, densitas sel serviks

Pengantar

Kanker serviks adalah neoplasma ganas yang timbul dari sel-sel yang berasal dari serviks uteri. 1 Pengobatan biasanya terdiri dari operasi pada tahap awal dan kemoterapi dan / atau radioterapi pada stadium yang lebih maju. 1 Pengobatan kanker serviks bervariasi di seluruh dunia terutama karena variasi dalam beban penyakit di negara-negara maju dan berkembang, akses ke ahli bedah terampil dalam operasi panggul radikal, dan kebutuhan untuk tidak mengganggu organ reproduksi wanita di negara-negara atau budaya tertentu. Karena kanker serviks yang radiosensitive, radiasi dapat digunakan dalam semua tahap di mana pilihan operasi tidak ada. 1

Secara khusus, kanker serviks microinvasive (stadium IA) dapat diobati dengan histerektomi atau pengangkatan seluruh rahim termasuk bagian dari vagina. 1 Untuk tahap IA2, kelenjar getah bening yang dihapus juga. 1 Untuk 1A1 penyakit, biopsi kerucut dianggap kuratif . Tahap awal (IB1 dan IIA kurang dari 4 cm) dapat diobati dengan histerektomi radikal dengan pengangkatan kelenjar getah bening atau terapi radiasi. 1 Terapi radiasi baik diberikan sebagai balok radioterapi eksternal ke panggul atau internal (disebut brachytherapy). 1 Pasien yang diobati dengan operasi yang memiliki fitur berisiko tinggi ditemukan pada pemeriksaan patologis juga diberikan terapi radiasi dengan atau tanpa kemoterapi untuk mengurangi risiko kambuh. Tumor

tahap awal yang lebih besar (IB2 dan IIA lebih dari 4 cm) juga dapat diobati dengan terapi radiasi dan kemoterapi berbasis cisplatin, histerektomi (yang kemudian biasanya membutuhkan terapi radiasi adjuvant), atau kemoterapi cisplatin dilanjutkan dengan histerektomi. 1 Terakhir, tumor stadium lanjut (IIB-IVA) diperlakukan dengan terapi radiasi dan kemoterapi berbasis cisplatin. 1

Untuk membantu pengobatan kanker serviks, biomaterial telah digunakan sebagai pembawa agen farmasi serta bahan yang memancarkan energi radiasi pengion lokal. 2 Dengan demikian, biomaterial tersebut sering dimasukkan ke lokasi anatomi yang tepat untuk melepaskan obat-obatan atau radiasi. Sel-sel yang sehat juga akan terpengaruh oleh radiasi, tetapi mereka biasanya cukup kuat untuk memperbaiki diri dan memulihkan siklus hidup normal. Karena biokompatibilitas dan digunakan secara luas dalam industri perangkat medis, titanium telah sering digunakan dan diusulkan untuk pengobatan kanker serviks. 2 - 4 Secara khusus, titanium saat ini secara klinis digunakan untuk mengurangi artefak pencitraan resonansi magnetik dan distorsi untuk diagnosis kanker serviks dan saat ini sedang diusulkan sebagai pembawa untuk obat-obatan dan radiasi untuk pengobatan kanker serviks. Namun, titanium memiliki kemampuan untuk menurunkan fungsi sel kanker kecuali radiasi atau obat-obatan yang dirilis dan, pada kenyataannya, titanium bahkan dapat meningkatkan pertumbuhan sel kanker serviks pada permukaannya.

Karena penelitian sebelumnya yang telah menunjukkan penurunan tulang, paru-paru, dan kanker payudara fungsi sel pada polimer dengan pilih fitur permukaan nano, 5 - 7 tujuan dari penelitian ini adalah untuk membuat fitur permukaan nano titanium dan menentukan untuk pertama kalinya, kanker serviks respon sel. Hasil menunjukkan cara cepat dan mudah untuk memodifikasi titanium untuk memiliki fitur permukaan nano yang dapat menurunkan adhesi sel kanker serviks dan mungkin obat atau radiasi pembawa lebih baik dari titanium dimodifikasi.

Bahan dan metode

Persiapan bahan

Nanotubular titanium disintesis menggunakan 99,5% titanium murni foil (0,25 mm; AlfaAesar, Ward Hill, MA, USA) dipotong menjadi 0,8 × 0,8 mm kuadrat. Sampel titanium yang terhubung ke sel elektrokimia dengan konfigurasi dua elektroda. Sebuah platinum mesh (AlfaAesar) digunakan sebagai katoda dan spesimen titanium digunakan sebagai anoda. Platinum dan titanium Sampel ini terhubung ke catu daya DC (3645A DC power supply, Spesialis Circuit Inc, Mesa, AZ, USA) melalui kabel tembaga (AlfaAesar).

Dalam rangka menciptakan nanotubular titanium dengan 20, 40, 60, dan 80 nm diameter tabung, tegangan anodization diterapkan diubah menjadi 5, 10, 15, dan 20 V, masing-masing, dalam asam fluorida 0,5% (HF) larutan elektrolit untuk waktu anodization dari 30, 30, 20, dan 15 menit, masing-masing. Setelah ini selesai, sampel anodized disterilisasi dengan berkumur dengan aseton, etanol 70%, dan DDH 2 O selama 10 menit setiap. Setelah sampel disterilkan, mereka kemudian hidrotermal diperlakukan (perlakuan panas) dalam tungku (Lindberg / Biru tungku; VWR, Radnor, PA, USA) pada 500 ° C selama 2 jam dengan pemanasan / laju pendinginan dari 3 ° C / menit pada tekanan ambien karena penelitian sebelumnya telah menunjukkan

penghapusan fluor melalui proses tersebut. 8 Terakhir, sebelum percobaan sel, sampel anodized dan sampel titanium konvensional (diobati) disterilisasi menggunakan proses autoclave.

Karakterisasi material

Pemindaian mikroskop elektron (SEM)

Karakterisasi permukaan spesimen dilakukan dengan menggunakan LEO 1530 VP FE-4800 mikroskop lapangan emisi elektron scanning (Zeiss, Peabody MA, USA). Sebuah mempercepat tegangan 5 kV dipilih untuk analisis SEM dan mikrograf ditangkap menggunakan elektron sekunder yang dikumpulkan dengan detektor di-lensa. Tidak ada sputtering digunakan untuk gambar permukaan substrat titanium konvensional atau anodized.

Mikroskop kekuatan atom (AFM)

Untuk pengukuran kekasaran permukaan, Suaka Penelitian AFM (Santa Barbara, CA, USA) digunakan untuk memindai substrat titanium konvensional dan anodized. Setiap sampel dianalisis di udara ambien di bawah mode noncontact menggunakan kantilever silikon UltraSharp (radius ujung probe 10 nm, MikroMasch, Wilsonville, OR USA). 1 × 1 m dan 90 × 90 m AFM bidang dianalisis dan tingkat scan dipilih sebagai 1 Hz. Analisis citra perangkat lunak (IgorPro, Seattle, WA, USA) digunakan untuk menghasilkan mikrograf dan kuantitatif membandingkan akar kuadrat rata-rata kekasaran (RMS) yang konvensional dan substrat anodized titanium. RMS adalah estimasi standar deviasi dari distribusi Gaussian-jenis bidimensional ketinggian sekitar nilai rata-rata poin yang dikumpulkan.

Kimia dan analisis kristalinitas (ESCA dan XRD)

Untuk analisis kimia dari lapisan permukaan atas sampel titanium konvensional dan anodized, spektroskopi elektron untuk analisis kimia (ESCA) dilakukan dengan menggunakan Perkin Elmer 5500 Multitechnique Permukaan Analyzer System (Waltham, MA, USA). Aluminium K-alpha monochromatized sumber sinar-X digunakan untuk merangsang photoemission dari elektron kulit dalam pada permukaan. Energi dari elektron ini kemudian direkam dan dianalisis untuk semua substrat. Scan macam baik titanium konvensional dan anodized digunakan untuk menghasilkan spektrum resolusi rendah untuk mengidentifikasi dan mengukur persentase elemen yang berbeda hingga kedalaman 100 Å. Difraksi sinar-X (XRD) juga dilakukan dalam penelitian ini sesuai dengan prosedur standar. Tidak ada pembersihan menggerutu dilakukan ke salah satu sampel sebelum metode karakterisasi tersebut.

Analisis sudut kontak

Sudut kontak air diselidiki menggunakan bentuk penurunan analisis sistem (EasyDrop, Kruss, Hamburg, Jerman). Sudut kontak dari 3 mL tetesan sessile diukur di dua lokasi pada setiap titanium konvensional dan anodized nanotubular titanium substrat.

Studi sel

Sel-sel kanker serviks manusia (sel CCL-2 HeLa, jumlah populasi 3 dan 4; American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) dikultur dalam modifikasi media Eagle Dulbecco itu (DMEM), glukosa yang tinggi (HyClone, Gibco, Grand Island, NY , USA), ditambah dengan 10% serum janin sapi (FBS) dan 1% penisilin / streptomisin dalam 37 ° C, dilembabkan, 5% CO 2 lingkungan. Efek dari fitur permukaan nanotubular titanium pada adhesi sel HeLa ditentukan dengan menggunakan MTT (3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) bromide -2,5-difenil-2H-tetrazolium) assay (Invitrogen, Carlsbad, CA , USA). Sampel disterilkan dengan autoclave sterilisasi. Sebelum sel pembenihan, semua sampel dibilas dengan larutan buffer fosfat (PBS) selama lima menit. Sel unggulan pada 3500 sel / cm 2 per substrat dalam piring 24-baik dan diizinkan untuk mematuhi selama 4 jam dalam 37 ° C, dilembabkan, 5% CO 2 lingkungan. Setelah 4 jam, substrat dibilas di PBS untuk menghapus sel-sel nonadherent dan dipindahkan ke media segar dalam piring 24-baik bersih. Selanjutnya, 150 uL larutan MTT ditambahkan ke setiap baik dan diinkubasi selama 4 jam. Sel-sel yang layak mengurangi tetrazolium kekuningan menjadi tidak larut kristal formazan ungu yang kemudian dilarutkan dengan 1 mL dari isopropanol / larutan HCl. Setelah 12 jam inkubasi, solusi dipindahkan ke piring 96-baik bersih dan absorbansi pada 570 nm dibacakan menggunakan pembaca lempeng (Softmax Pro, Minneapolis, MN, USA) untuk mendapatkan kepadatan optik. Kurva standar dibuat untuk menentukan jumlah sel dari nilai adsorben MTT.

Analisis statistik

Semua eksperimen dilakukan dalam rangkap tiga dan diulang tiga waktu yang berbeda. Perbedaan antara cara yang ditentukan dengan menggunakan analisis varians diikuti oleh t -tests Student.

Hasil dan Diskusi

Karakterisasi material

Karakterisasi mikro dan struktur nano

Pemindaian mikroskop elektron (SEM) gambar titanium konvensional dan anodized titanium nanotubular ditunjukkan di bawah ini di Gambar 1 . Seperti yang diharapkan, karakterisasi SEM mengungkapkan bahwa diameter titanium nanotubular fitur bervariasi antara 20 dan 80 tabung diameter nm. Gambar AFM mengungkapkan tambahan perbedaan topografi yang berbeda antara beberapa substrat yang menarik dalam penelitian ini ( Gambar 2 ). Seperti yang diharapkan karena perubahan dalam fitur permukaan, RMS kekasaran lebih besar pada permukaan titanium nanotubular anodized. Scan AFM juga menunjukkan tinggi nilai-nilai RMS untuk anodized titanium untuk memiliki 20 nanotube diameter nm dibandingkan dengan kedua anodized titanium untuk memiliki 80 nm diameter nanotube dan titanium konvensional ( Gambar 2 ). Tabel 1 merangkum nilai-nilai RMS.

Gambar 1 SEM gambar titanium konvensional dan anodized titanium memiliki 20, 40, 60 dan 80 tabung diameter nm.

Gambar 2 Kekuatan mikrograf atom menunjukkan nanotopography dari (A dan B) konvensional, (C dan D) 20 nm, dan (E dan F) 80 nm titanium.

Tabel 1 Data kuantitatif diperoleh dari analisis kekuatan microcsopy atom menunjukkan bahwa substrat yang dibuat oleh anodization terkandung permukaan lebih nanofeatured dibandingkan dengan titanium konvensional

Analisis kimia permukaan (ESCA)

Dalam Tabel 2 , komposisi kimia dari konvensional dan sampel titanium nanotubular anodized yang digunakan dalam penelitian ini dibandingkan. Salah satu perbedaan yang signifikan antara sampel adalah kandungan karbon pada permukaan anodized titanium naotubular dan titanium konvensional. Lapisan karbon ini berasal dari hidrokarbon disimpan ke substrat titanium, yang tidak dihilangkan selama proses pembersihan kuat. Seiring dengan karbon, konsentrasi oksigen pada berbagai permukaan titanium nanotubular menunjukkan beberapa pola penting. Semua nanotubular anodized sampel titanium memiliki konsentrasi yang lebih tinggi dari oksigen dibandingkan dengan sampel konvensional. Dari hasil ESCA, dapat disimpulkan bahwa kimia permukaan sampel menunjukkan perbedaan penting yang mungkin telah memainkan peran dalam respon seluler yang akan dijelaskan di bawah ini. Selain itu, hasil ini menunjukkan bahwa tren berubah kimia permukaan titanium yang nanotubular mengubah dimensi perlu diselidiki lebih lanjut dalam studi masa depan.

Tabel 2 Persentase atom dari unsur yang diberikan oleh spektroskopi elektron untuk analisis kimia anodized sampel titanium nanotubular menarik bagi studi saat ini

Struktur kristal (XRD analisis)

Hasil XRD ditunjukkan pada Gambar 3 . titanium anodized untuk memiliki 80 nm diameter nanotube memiliki puncak anatase tetapi tidak menunjukkan puncak rutil, namun, sebagai diameter tabung menurun menjadi 20 nm, pembentukan rutil menjadi lebih signifikan. Bahkan, anodized titanium untuk memiliki 20 nm nanotube tidak menunjukkan indikasi fase anatase tetapi menunjukkan indikasi fase rutil kristal. The titanium anodized untuk memiliki 40 dan 60 nm diameter nanotube yang mirip dengan sampel 80 nm diameter titanium (data tidak ditampilkan).

Gambar 3 X-ray difraksi spektrum titanium konvensional, 20 nm, dan 80 sampel nm.

Peneliti lain mengamati hasil yang sama untuk lapisan titanium oksida. 9 , 10 Misalnya, Gribb et al, mengamati peningkatan kinetika anatase untuk rutile fase transformasi ketika kristal anatase yang halus kristal, yaitu, kasar berbutir anatase tetap 100% anatase pada perlakuan panas pada 700 ° C selama 24 jam, namun, nanokristalin anatase berubah menjadi 80% rutile setelah 24 jam pada 525 ° C. 10 Gribb et al menjelaskan peningkatan dalam transformasi fasa dari anatase untuk rutile sebagai peningkatan nukleasi menguntungkan di kecil ukuran kristal. Mungkin fenomena yang sama terjadi untuk anodized titanium di sini dan ukuran fitur perbedaan ini transformasi fasa yang terkena, di mana kinetika transformasi yang jauh lebih cepat dari itu untuk 20 nm dibandingkan dengan 40, 60, dan 80 nm diameter nanotubular titanium. Alasan lain yang mungkin untuk ini transformasi fase kristal meliputi: (i) adanya senyawa titanium oksida yang berbeda pada permukaan, yang berpotensi memberikan struktur kristal yang berbeda pada suhu tinggi dan (ii) keberadaan [TiF6] 2- senyawa karena titanium anodization di HF; dekomposisi suhu tinggi tidak diselidiki di sini, tetapi harus menjadi fokus penelitian yang akan datang.

Selain itu, kinetika transformasi fasa bisa mengubah lapisan oksida ke dalam struktur kristal yang berbeda pada akhir pemanasan atau mungkin mengakibatkan transportasi oksigen lebih cepat selama perlakuan panas. 80 nm struktur diameter nanotubular dibandingkan dengan 20 nm diameter struktur nanotubular mungkin membusuk [TiF 6] 2- ke kimia oksida yang berbeda, yang selanjutnya bisa berubah menjadi anatase atau rutile; semua peristiwa ini bisa menjadi faktor yang berpengaruh yang mempengaruhi pembentukan fase kristal yang berbeda diamati dalam studi ini dan perlu dikaji lebih lanjut.

Analisis permukaan hidrofilisitas

Sudut kontak air yang digunakan untuk menilai hidrofilisitas sampel menarik untuk penelitian ini ( Gambar 4 ). Sampel yang paling hidrofobik adalah titanium konvensional dengan sudut kontak air yang tertinggi sementara semua anodized nanotubular sampel titanium menunjukkan sudut kontak di bawah 30 °. Sampel hidrofilik paling adalah titanium anodized untuk memiliki 20 nm diameter nanotube. Secara keseluruhan, sudut kontak tersebut berkorelasi dengan baik dengan hasil ESCA ditunjukkan di atas. Secara khusus, sebagai kandungan karbon meningkat dan kadar oksigen menurun pada permukaan nanotubular titanium konvensional dan anodized, ada peningkatan sudut kontak air.

Gambar 4 Kontak air sudut sampel yang digunakan dalam penelitian ini.

Respon sel kanker serviks

Terakhir, adhesi kanker serviks terendah diamati pada titanium dengan tabung 60 nm diameter, yang setengah dari yang dari semua substrat lain yang diuji dalam penelitian ini ( Gambar 5 ). Karena adhesi sel kanker merupakan prasyarat yang diperlukan untuk pertumbuhan dan migrasi mereka, hasil tersebut menunjukkan janji besar untuk sampel 60 nm anodized nanotubular titanium untuk mengurangi respon sel kanker serviks dibandingkan dengan titanium nanosmooth saat ini digunakan untuk lokal memberikan agen farmasi atau radiasi dan , dengan demikian, harus lebih dipertimbangkan untuk berbagai pengobatan antikanker.

Gambar 5 Penurunan adhesi sel kanker serviks pada 60 nm nanotubular titanium.

Hal yang menarik untuk bertanya-tanya mengapa titanium anodized untuk memiliki 60 tabung nm penurunan adhesi sel kanker serviks lebih dari sampel lainnya belajar di sini. Seperti disebutkan, penelitian sebelumnya telah menunjukkan janji untuk mengurangi respon sel kanker pada polimer dengan pilih fitur permukaan nano, struktur hemispherical khusus 23 diameter nm dibandingkan dengan mereka yang lebih besar dari 200 nm. 5 - 7 nanopatterned poli (laktat-co-glikolat asam) (PLGA ) permukaan dengan kimia permukaan yang sama tetapi berbeda topografi penurunan payudara dan densitas sel kanker paru-paru dan faktor sel endotel vaskular (VEGF, faktor pertumbuhan yang mempromosikan angiogenesis tumor) sintesis dibandingkan dengan nanosmooth atau sampel PLGA datar. Hal ini berbeda dengan payudara yang sehat dan densitas sel paru-paru yang lebih besar pada PLGA dengan 23 fitur permukaan nm dari pada datar PLGA. Peningkatan fungsi sel tulang yang sehat tetapi menurun fungsi sel osteosarcoma juga telah

diukur. Dengan cara ini, mereka studi ditambah dengan penelitian ini membuka kemungkinan menggunakan nanotopographies polimer tersebut untuk berbagai aplikasi antikanker termasuk obat dan radiasi pengiriman lokal.

Meskipun tidak diketahui pada saat ini bagaimana fitur permukaan nano menurunkan respon sel kanker, 60 nm permukaan tabung titanium dibuat di sini mungkin telah memiliki keterbasahan permukaan yang ideal untuk menarik adsorpsi awal protein dari serum yang menurunkan lampiran sel kanker. Mekanisme ini telah rinci untuk kemampuan nanotubular titanium untuk meningkatkan pertumbuhan tulang sebagai studi telah mengukur adsorpsi secara signifikan lebih besar dari vitronectin dan fibronektin pada permukaan nanotubular dibandingkan dengan titanium datar. 11 sifat permukaan lainnya, seperti kristalinitas diukur dengan XRD dan kimia diukur dengan ESCA , mungkin juga dipengaruhi energetika permukaan untuk mempromosikan adsorpsi protein tahu untuk menghambat adhesi sel kanker serviks. Meskipun studi di masa depan akan menentukan mekanisme yang tepat dimana pilih fitur nanosurface seperti menurunkan fungsi sel kanker serviks, studi ini menambah jumlah penelitian yang telah menunjukkan janji yang signifikan untuk penggunaan anodized titanium nanotubular dalam ortopedi, perangkat diamputasi, stent pembuluh darah, kandung kemih stent, dan aplikasi antibakteri. 11 - 17 Yang penting, dalam semua studi tersebut, peningkatan fungsi sel vaskular, sel kandung kemih, sel-sel tulang, dll telah diukur menunjukkan bahwa 60 struktur titanium tubular nm ini hanya dapat membahayakan sel-sel kanker serviks, namun sehat untuk sel-sel non-kanker lainnya.

Kesimpulan

Biomaterial titanium telah diusulkan sebagai alat untuk membantu dalam pengiriman lokal agen kemoterapi dan / atau radiasi ke situs kanker serviks. Namun, perangkat medis titanium saat ini digunakan untuk mengobati kanker serviks tidak dengan sendirinya memiliki apapun sifat antikanker dan bahkan memungkinkan untuk pertumbuhan sel-sel kanker. Hasil penelitian ini menunjukkan kemampuan untuk mengurangi adhesi sel kanker serviks setelah 4 jam dengan sekitar setengah dari anodized titanium nanotubular dibandingkan dengan saat ini digunakan nanosmooth titanium (tanpa menggunakan kemoterapi atau radiasi) membuka berbagai kemungkinan penggunaan nanotubular titanium di obat atau radiasi pengobatan lokal kanker serviks.