Penurunan Level Protein C dan Protein S pada Pasien PPOK dan Emboli Paru

Luis Maldonado Noriega1 dan Raúl Barrera Rodríguez*,2

1Escuela Superior de Medicina, Instituto Politécnico Nacional, México

2Depto. de Bioquímica y Medicina Ambiental, Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias-SSA, Clza. Tlalpan, 4502, Col Sec. XVI. México, D.F., 14080, México

Abstrak: Introduksi: Emboli paru (EP) menjadi ancaman utama pada pasien PPOK dan 13% diantaranya menderita emboli. Ada beberapa penyebab terjadinya trombofilik pada PPOK, diantaranya adalah abnormalitas kaskade koagulasi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui frekuensi abnormalitas protein anti-pembekuan pada pasien PPOK yang memiliki riwayat EP.

Metode: Empat puluh tiga pasien PPOK/EP diteliti dan dilakukan perbandingan level protein anti-pembekuan dengan 40 pasien PPOK murni

Hasil: Dijumpai adanya pengurangan protein anti-pembekuan sekitar 23% (10/43) pada pasien PPOK/EP, namun tidak satupun pasien PPOK menunjukkan hal ini. Pada kelompok PPOK/EP, 8 pasien memiliki pengurangan signifikan protein C (mean 27 ± 8%), dan 5 pasien menunjukkan pengurangan level protein S (mean 28 ± 7%). Menariknya, berkurangnya level protein C dan S dijumpai pada 3 diantaranya. Tidak satupun pasien PPOK/Ep menunjukkan adanya bukti terganggunya fungsi resistensi protein C yang teraktivasi

Kesimpulan: Data penelitian menunjukkan tingginya angka frekuensi gangguan pada sistem protein antikoagulan endogen pasien PPOK/EP. Diperlukan penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengidentifikasi pasien-pasien yang beresiko tinggi

Kata kunci: Resistensi protein C yang teraktivasi, antitrombin III, penyakit paru obstruksi kronis, emboli paru, protein S, protein C

INTRODUKSI

Penyakit paru obstruksi kronis (PPOK) merupakan masalah kesehatan dunia dengan meningkatnya morbiditas dan mortalitas [1,2]. Gejala klinis PPOK dengan komplikasi emboli paru terdapat sekitar 10-27% [3,4] pasien dan berhubungan dengan angka kematian [5,7].

Telah diketahui bahwa pasien PPOK eksaserbasi akut memiliki resiko moderat untuk menjadi EP, akibat adanya faktor resiko, seperti imobilisasi, superinfeksi bronkial, gagal ventrikel kanan dan stasis vena. Selain itu, kejadian trombotik dapat disebabkan oleh lesi vaskular dan alveolar [8,9]. Sebagai tambahan, beberapa penelitian secara tidak langsung menunjukkan perubahan platelet atau abnormalitas komponen koagulasi [10-13] yang menyebabkan protrombotik dan meningkatkan resiko tromboemboli pada pasien PPOK [14]. Sebagai contoh, kondisi eksaserbasi PPOK lebih parah pada pasien dengan kadar kompleks trombin-

antitrombin III (TAT) atau kompleks aktivator plasminogen jaringan-inhibitor plasminogen jaringan (tPA-PAI) [15]. Penelitian lain menyebutkan bahwa PPOK eksaserbasi akut berhubungan dengan peningkatan level fibrinogen plasma.

Mengingat pentingnya untuk mengetahui lebih lanjut mengenai faktor-faktor yang terkait dengan kejadian trombotik pada pasien PPOK, dan sedikitnya informasi mengenai hal ini, maka kami meneliti frekuensi kejadian kelainan protein anti-pembekuan pada pasein PPOK dengan EP.

METODE

Kami mempelajari 43 pasien PPOK stabil dan terbukti memiliki EP, sesuai dengan Thrombophilic Research Group dari Institute of Respiratory Disease di Meksiko. Definisi PPOK sesuai dengan konsensus American Thoracic Society [18]. Pasien memiliki riwayat batuk produktif kronis atau berulang selama > 2 tahun dan mengalami penurunan aliran ekspirasi maksimal, yang telah berlangsung secara perlahan-lahan maupun ireversibel. Penyakit paru lainnya atau penyakit jantung yang menyebabkan kondisi tersebut diseleksi dengan menggunakan pemeriksaan klinis dan radiologi. Kriteria pemilihan pasien: (i) semua pasien PPOK stabil: analisa gas darah dan rasio FEV1/FVC tidak menunjukkan perubahan signifikan dalam 6 buan terakhir; (ii) pasien dengan EP (dibuktikan dari scanning perfusi paru, dapat menunjukkan gambaran oklusi arteri pulmonali kanan dengan tepat [19]).

Pasien dengan penyakit inflamasi akut, asidosis metabolik, penyakit imunologis, kanker, hipertensi, diabetes melitus, pembedahan, imobilisasi, hamil, trauma pascapartus, konsumsi kontrasepsi oral, penyakit ginjal ataupun yang mengonsumsi anti-platelet atau antikoagulan (warfarin) selama 20 hari sebelumnya, tidak digunakan sebagai objek penelitian. Nama, usia, jenis kelamin, lama menderita penyakit dan radiografi dada dicatat. Seluruh pasien PPOK/EP masih merupakan perokok aktif. Sementara itu, 40 pasien PPOK stabil juga dipilih dengan kriteria yang sama dengan kelompok sebelumnya dan kadar protein koagulan digunakan sebagai perbandingan.

Pengumpulan Darah dan Tes Koagulasi

Sampel darah dikumpulkan dalam tabung vakum yang mengandung 0.129 mol/L trisodium sitrat dan disentrifugasi pada 2000 g selama 15 menit untuk mendapatkan platelet dengan plasma seminimal mungkin. Sampel ini dibekukan dan disimpan pada suhu -20oC sampai dilakukan pengujian. Plasma yang dipilih sebagai parameter koagulometric adalah Protein C (STACLOT PROTEIN C), protein S (STACLOT PROTEIN S), waktu protrombin (PT): (Start ® - NEOPLASTINE CL), kaolin-aktifasi parsial waktu tromboplastin (APTT): (CK PREST), dan resistensi protein C yang diaktivasi (reistensi APC) (STACLOT APC-R) yang diukur dengan tes pembekuan. Tes pembekuan dilakukan dengan koagulometer (STAcompact® Hemostasis System, Diagnostica, Stargo, France). Antitrombin II (AT-III) ditentukan berdasarkan colorimetric (STACROM AT III). Semua parameter diperoleh dari DIAGNOSTICA Stago, Asnieres, Perancis. Untuk mengurangi kesalahan pengukuran, semua tes dilakukan dua kali dan nilai rata-rata dihitung untuk setiap sampel. Variasi koefisien intra-uji dan inter-uji berkisar 2-6%.

Analisis Statistik

Analisis data dilakukan dengan program komputer (Sigma Stat untuk Windows Versi 3.5). Data dinyatakan sebagai mean ± SD. Perbedaan proporsi diuji dengan uji T. Nilai p<0,001 dianggap sebagai signifikan.

Tabel 1. Karakteristik Umum dan Kadar Plasma Faktor Koagulasi pada pasien PPOK vs PPOK/EP

PPOK (n=40) PPOK/EP (n=43)

Karakteristik UmumGender (L/P) 26/14 17/26Umur (rentang) 69 ± 8 (53-90)

thn56 ± 12 (40-83)

thnDVT 32 (80%) 34 (79 %)Luka pada ekstremitas bawah

0 (0%) 8 (18.6 %)

Obesitas 16 (40 %) 31(72 %)Perokok 40 (100%) 43 (100%)Protein Plasma Pembekuan

Nilai Normal Nilai P

Prot C (%) 117.8 ± 21.6 91.4 ± 34.3 70-130 *0.0001Prot S (%) 115.2 ± 26.2 83.5 ± 24.2 65-140 *0.0001AT III (%) 97.6 ± 13.4 94.0 ± 8.0 80-120 TSAPCR (%)¶ 161.8 ± 18.4 165.8 ± 23.9 TSPT (INR) 1.3 ± 0.1 1.2 ± 0.2 1.0-1.3 TSAPTT (sec) 35.8 ± 4.1 38.1 ± 4.4 26.5-40 TS

¶Waktu pembekuan setara atau lebih tinggi dari 120 detik dinyatakan negatif untuk resistensi APC. Data mean ± SD. *p<0,001, dibandingkan dengan kelompok PPOK.TS: tidak signifikan

HASIL

Empat puluh tiga pasien dengan diagnosis PPOK/EP dan PPOK stabil diteliti. Setelah analisis, didapati: pada PPOK/EP, 26 diantarnya perempuan dan 17 laki-laki, sedangkan pada kelompok PPOK didominasi oleh laki-laki.

Tabel 1 menunjukkan karakteristik utama pada kedua kelompok: usia rata-rata untuk PPOK/EP adalah 56 ± 12 (kisaran 40-83 tahun), sedangkan untuk pasien PPOK adalah 69 ± 8 (kisaran 53-90 tahun). Dapat dilihat bahwa kelompok PPOK/EP sedikit lebih muda daripada kelompok PPOK dan juga menunjukkan jumlah penderita obesitas yang lebih tinggi, terutama perempuan.

Dalam penelitian kami, kedua kelompok menunjukkan angka kejadian yang sama dari deep vein trombosis (DVT), masing-masing 80 dan 79%. Telah diketahui sebelumnya bahwa PPOK beresiko lebih tinggi menderita DVT dan dalam penelitian yang lain melaporkan bahwa kejadian DVT pada pasien PPOK berkisar 20-60% [20]. Selain itu, emboli paru juga

merupakan komplikasi DVT. Mekanisme yang mendasari terjadinya peningkatan resiko tromboemboli vena tidak diketahui, namun mungkin berkaitan dengan perubahan fungsi dan integritas endotel, dan induksi hiperkoagulasi akibat perubahan pro- dan anti-koagulan terkait proses inflamasi maupun terapinya.

Penentuan kadar protein anti-pembekuan memiliki beberapa perbedaan. Sebagai contoh, kadar persen median protein C pada PPOK/EP lebih rendah daripada PPOK (9,14 ± 34,3 vs 117,8 ± 21,6%). Pasien PPOK/EP juga menunjukkan penurunan yang signifikan pada protein S (83,5 ± 24,2 vs 115,2 ± 26,2%) (Tabel 1).

Meskipun kadar protein anti-pembekuan pada PPOK/EP masih dalam batas normal; penurunan ini pada hakekatnya menunjukkan fenomena luar biasa.

Dari 43 pasien PPOK/EP, 23% (10/43) menunjukkan penurunan kadar anti-pembekuan. Delapan pasien menunjukkan penurunan yang signifikan pada protein C sedangkan 5 pasien menunjukkan penurunan protein S (27 ± 8 dan 28 ± 7%). Tiga pasien menunjukkan penurunan kadar protein C dan S (N8, N27, N41) (Tabel 2). Mereka juga menunjukkan sedikit perpanjangan dari PT dan 2 diantaranya menunjukkan perpanjangan APTT.

Gambar (1) menunjukkan bukti yang jelas bahwa pasien PPOK/EP menunjukkan penuruan 2 protein antikoagulan endogen (PC dan PS), tetapi tidak ada perbedaan untuk protein anti-pembekuan AT-III. Meskipun kadar protein C dan S yang lebih rendah ditemukan pada beberapa pasien PPOK/EP, PT dan APTT pada PPOK/EP secara statistik tidak memiliki perbedaan dengan PPOK. Demikian halnya juga dengan resistensi APC.

DISKUSI

EP mungkin memicu eksaserbasi PPOK menyebabkan ketidakpastian diagnosis dengan gejala yang tumpang tindih. Faktor resiko EP meliputi terganggunya aliran balik vena, disfungsi atau cedera endotel, dan gangguan hiperkoagulabilitas.

Dalam studi ini, kami menemukan bahwa 23% pasien PPOK stabil dan EP menunjukkan penurunan baik protein C atau S, namun tidak ada pasien PPOK yang mengalami hal ini.

Gambar (1). Kadar protein C, protein S, antitrombin III pada pasien PPOK/EP dan PPOK. Garis menunjukkan nilai rata-rata dari seluruh data.

Terjadinya penurunan protein C pada PPOK/EP adalah 18% (8/43), persentase ini lebih tinggi dibandingkan dengan prevalensi defisiensi protein C heterozigot yang dilaporkan pada donor darah sehat (0,1-0,4%) [21], pasien yang tidak dipilih (3,7%) atau psien trombotik (4,8%) [22-25]. Selain itu, penurunan protein S juga ditemukan pada 11% (5/43) pasien PPOK/EP penelitian ini. Penurunan protein S memiliki prevalensi lebih tinggi daripada pasien yang tidak dipilih (2,3%) atau pasien trombosis (4,3%), namun tidak berbeda jauh dengan laporan penelitian lainnya yang menggambarkan defisiensi protein S yang simtomatis pada warga Itali (14%) dan 1-13% pada pasein trombofilik dengan VTE.

Latar belakang genetik perubahan molekul Protein C dan Protein S adalah heterogen. Dengan demikian, diagnosis defisiensi PC dan PS memiliki tantangan tersendiri, tes fungsional dipengaruhi oleh faktor-faktor pra-analisis dan faktor analitikal, dan diagnosis menggunakan genetika molekular juga memiliki kesulitan khusus [28]. Misalnya, defisiensi Protein C Tipe II, molekul disfungsional yang didiagnosis sekitar 5-15% kasus. Dalam penelitian kami, rendahnya tingkat protein anti-pembekuan menunjukkan penurunan aktivitas namun tidak penurunan protein. Oleh karena itu, frekuensi kelainan PC dan PS pada PPOK / PE pasien harus dipertimbangkan dengan hati-hati.

Hal ini juga diketahui bahwa frekuensi perubahan sistem protein pembekuan secara signifikan lebih tinggi pada sampel yang tidak dipilih dengan penyakit trombotik dibandingkan pada subyek sehat. Perbedaan mencolok pada pasien yang dipilih dengan penyakit trombotik, berdasarkan klinis, memiliki trombofilia. Perubahan Protein C dan protein S pada PPOK/EP juga dimasukkan sebagai kriteria inklusi (yaitu tromboemboli paru) digunakan juga untuk pasien PPOK. Namun, karena ketidak-mungkinan untuk mendapatkan

karakterisasi genetik setiap pasien dan kerabat pertama diagnostik dari trombofilia tidak bisa disimpulkan.

Tabel 2. Nilai Individual dari Sepuluh Pasien PPOK/EP dengan Gangguan Sistem Koagulasi

No.Pasien

Gender Umur Prot-C (%)

Prot-S (%)

AT-III (%)

PT (INR)

APTT (sec)

N2 L 73 24 82 96 1.4 35N6 P 62 36 82 83 1.3 41N8 P 40 21 31 104 1.5 41N12 P 56 127 37 93 1.3 35N16 P 44 26 75 88 1.3 40N17 L 66 112 32 88 1.3 40N21 P 48 25 75 95 1.3 40N27 L 55 17 21 109 1.5 46N36 P 72 25 70 87 1.3 42N41 P 68 43 21 82 2.7 54

Reference Values

70-130 65-140 80-120 1.0-1.3 26.5-40

Pada kebanyakan pasien dengan perubahan protein anti-pembekuan, terutama pada mereka dengan defisiensi protein C dan protein S, usia rata-rata untuk trombotik pertama terjadi sebelum usia 45 [29, 30]. Dalam penelitian kami, usia onset untuk gejala trombotik dalam kelompok PPOK / EP tidak diketahui. Namun, kelompok ini menunjukkan rata-rata berusia 56 ± 12 tahun, lebih muda dari usia rata-rata pasien PPOK (69 ± 8 tahun [p <0,001]) dan mirip dengan usia dilaporkan untuk kekurangan C protein atau protein S [29, 30].

Di antara pasien dengan penyakit trombotik, defisiensi ganda sering diamati [31]. Dalam banyak laporan, defisiensi yang sering dikaitkan dengan perubahan Protein C: yaitu resistensi APC dan defisiensi Protein C atau Protein S dan mutasi AT-III [32, 33]. Dalam penelitian kami, 7% dari pasien PPOK/PE menunjukkan penurunan aktivitas protein C dan protein S.

Hal ini juga diketahui bahwa pada orang yang lebih muda, defek dalam sistem pembekuan memiliki risiko yang lebih tinggi terhadap trombosis. Pasien dengan gejala defisiensi Protein S juga terjadi mutasi FV Leiden; untuk pasien, usia rata-rata onset adalah 27 (10-60 tahun), mirip dengan subjek defisiensi protein C dan mutasi FV Leiden [30]. Dalam penelitian kami, 3 pasien PPOK/EP dengan penurunan aktivitas Protein C dan Protein S berusia lebih tua (54 ± 14 tahun). Salah satu alasan yang mungkin untuk perbedaan ini, PPOK berkembang perlahan-lahan selama bertahun-tahun, sehingga sebagian besar orang setidaknya 40 tahun ketika gejala mulai terjadi.

Resistensi APC adalah defek paling umum dari sistem koagulasi yang diketahui sampai saat ini, sekitar 21 sampai 60% dari pasien trombotik, dan 3 sampai 7% dari kontrol yang sehat [34]. Selain itu, di antara pasien defisiensi Protein C atau Protein S yang menderita trombosis vena, prevalensi FV Leiden lebih tinggi (40%) [26, 29, 30]. Ketika kami menganalisis pasien PPOK/EP, kami tidak menemukan bukti perubahan fungsional dalam resistensi APC. Data

kami tampaknya sesuai dengan beberapa laporan yang menyebutkan prevalensi yang rendah resistensi APC atau mutasi FV Leiden pada pasien dengan emboli paru [35]. Selain itu, diketahui bahwa prevalensi resistensi APC pada penyakit trombotik berbeda pada populasi yang beragam [12] dan hanya 10% dari mestizo Meksiko dengan fenotip resistensi APC telah ditemukan pada mutasi FV Leiden [36, 37].

Penentuan koagulometrik dari PT dan APTT, antara kedua kelompok pasien PPOK tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan. Namun, pasien PPOK/EP dengan penurunan ganda menunjukkan perpanjangan dalam waktu pembekuan dimediasi oleh prothrombin, dan 2 dari mereka juga menunjukkan perpanjangan APTT. Sebaliknya, tidak satupun dari pasien menunjukkan bukti peristiwa perdarahan. Perpanjangan waktu pembekuan pada pasien ini tampaknya bukan karena penyakit hati atau koagulasi intravaskular diseminata (DIC), karena ATIII normal. Eksperimen campuran untuk menyingkirkan inhibitor dan tes faktor individu diperlukan untuk memperjelas hal ini. Selain itu, kami tidak dapat menemukan data dalam literatur tentang berapa lama setelah penghentian warfarin tingkat pembekuan dinormalisasi. Interval 20 hari adalah cukup secara klinis, tapi kami benar-benar tidak tahu dari studi observasi yang sebenarnya bahwa itu sudah cukup.

Akhirnya, untuk menjawab pertanyaan apakah kelainan pada Protein C dan Protein S adalah bawaan atau diperoleh, maka diperlukan juga kelompok EP tanpa PPOK pada interval waktu yang sama sebagai pembanding kelompok EP/PPOK.

Hasil penelitian kami menunjukkan frekuensi yang lebih tinggi dari perubahan protein pembekuan pada pasien dengan emboli paru dan PPOK. Protein C dan protein S adalah defisiensi utama yang ditemukan, sedangkan tidak ada bukti resistensi APC yang dapat dikonfirmasi.

Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengklarifikasi penyebab penurunan anti-pembekuan pada pasien PPOK/EP dan untuk menentukan apakah dan kapan profilaksis terhadap EP harus dimulai, terutama selama penyakit aktif, untuk mengurangi risiko yang fatal pada pasien PPOK.

KONFLIK KEPENTINGAN

Para penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.

KONTRIBUSI PENULIS

Semua penulis memberikan kontribusi sama untuk pekerjaan ini.

UCAPAN TERIMA KASIH

Untuk Ms Manuel Azgard Contreras Estrada untuk revisi naskah dan Dr Madrid-Marina untuk kritikan.

SINGKATAN

APTT = kaolin-activated partial thromboplastin time

AT-III = Antithrombin III

DVT = Deep vein thrombosis

EP = Emboli paru FEV1/FVC = Proporsi forced vital capacity exhaled in the first second

PC = Protein C

PPOK = Penyakit paru obstruksi kronis

PS = Protein S

PT = Prothrombin time

Resistansi APC = Resistansi activated protein C

VTE = Venous thromboembolism.

REFERANSI

[1] ATS statement. Standards for the diagnosis and care of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 1995; 152: s77-121.

[2] Tobin MJ. Chronic obstructive pulmonary disease, pollution, pulmonary vascular disease, transplantation, pleural disease, and lung cancer in AJRCCM 2003. Am J Respir Crit Care Med 2004; 169: 301-13.

[3] Tillie LI, Marquette CH, Perez T, et al. Pulmonary embolism in patient with unexplained exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease: prevalence and risk factors. Ann Intern Med 2006; 144: 390-6.

[4] Erelel M, Cuhadarolu C, Ece T, Arseven O. The frequency of deep venous thrombosis and pulmonary embolus in acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. Respir Med 2002; 96: 515-8.

[5] Ambrosetti M, Ageno W, Spavenello A, Salerno M, Pedretti RF. Prevalence and prevention of venous thromboembolism in patients with acute exacerbations of COPD. Thrombosis Res 2003; 112: 203-7.

[6] Laack TA, Goyal DG. Pulmonary embolism: an unsuspected killer. Emerg Med Clin North Am 2004; 22: 961-83.

[7] Moua T, Wood K. COPD and PE: a clinical dilemma. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 2008; 3: 277-84.

[8] Nakstad B, Lyberg T, Skjonsberg OH, Boye NP. Local activation of the coagulation and fibrinolysis systems in lung disease. Thromb Res 1990; 57: 827-38.

[9] Rostagno C, Prisco D, Boddi M, Poggesi L. Evidence for local platelet activation in pulmonary vessels in patients with pulmonary hypertension secondary to chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J 1991; 4: 147-51.

[10] De Stefano V, Finazzi G, Mannucci PM. Inherited thrombophilia: pathogenesis, clinical syndromes, and management. Blood 1996; 87: 3531-44.

[11] Schafer AI, Levine MN, Konkle BA, Kearon C. Thrombotic disorders: diagnosis and treatment. Hematology 2003; 2003: 520-39.

[12] Zöller B, Garcia de FP, Hillarp A, Dahlback B. Thrombophilia as a multigenic disease. Haematologica 1999; 84: 59-70.

[13] Margaglione M, Brancaccio V, De Lucia D, et al. Inherited thrombophilic risk factors and venous thromboembolism. Chest 2000; 118: 1405-11.

[14] Alessandri C, Basili S, Violi F, Ferroni P, Gazzaniga PP, Cordova C. Hypercoagulability state in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Thromb Haemost 1994; 72: 343-6.

[15] Ashitani J, Mukae H, Arimura Y, Matsukura S. Elevated plasma procoagulant and fibrinolytic markers in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Intern Med 2002; 41: 181-5.

[16] Wedzicha JA, Syndercombe CD, Tan KC. Increased platelet aggregate formation in patients with chronic airflow obstruction and hypoxaemia. Thorax 1991; 46: 504-7.

[17] Wedzicha JA, Seemungal TA, MacCallum PK, et al.Acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease are accompanied by elevations of plasma fibrinogen and serum IL-6 levels. Thromb Haemost 2000; 84: 210-5.

[18] American Thoracic Society: Standards for the diagnosis and care of patients with chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 1995; 152: 77-120.

[19] Lee RW. Pulmonary embolism. Chest Surg Clin N Am 2002; 2: 417-37.

[20] Lesser BA, Beeper KV, Stein PD, et al.The diagnosis of acute pulmonary embolism in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Chest 1992; 102: 17-22.

[21] Miletich J, Sherman L, Broze GJ. Absence of thrombosis in subjects with heterozygous protein C deficiency. N Engl J Med 1987; 317: 991-6.

[22] Gladson CL, Scharrer I, Hach V, Beck KH, Griffin JH. The frequency of type I heterozygous protein S and protein C deficiency in 141 unrelated young patients with venous thrombosis. Thromb Haemost 1988; 59: 18-22.

[23] Tabernero MD, Tomas JF, Alberca I, et al.Incidence and clinical characteristics of hereditary disorders associated with venous thrombosis. Am J Hematol 1991; 36: 249-54. [24] Pabinger I, Brucker S, Kyrle PA, et al.Hereditary deficiency of antithrombin III, protein

C and protein S: prevalence in patients with a history of venous thrombosis and criteria for rational patient screening. Blood Coagul Fibrinolysis 1992; 3: 547-53.

[25] Melissari E, Monte G, Lindo VS, et al.Congenital thrombophilia among patients with venous thromboembolism. Blood Coagul Fibrinolysis 1992; 3: 749-58.

[26] Koeleman BPC, van Rumpt D, Hamulyák K, Reitsma PH, Bertina RM. Factor V Leiden: an additional risk factor for thrombosis in protein S deficient families? Thromb Haemost 1995; 74: 580-3.

[27] ten Kate MK, van der Meer J. Protein S deficiency: a clinical perspective. Haemophilia 2008; 14: 1222-8.

[28] Bereczky Z, Kovács KB, Muszbek L. Protein C and protein S deficiencies: similarities and differences between two brothers playing in the same game. Clin Chem Lab Med 2010; 48 (Suppl 1): S53-66.

[29] Zöller B, Berntsdotter A, Garcia de FP, Dahlbäck B. Resistance to activated protein C as an additional genetic risk factor in hereditary deficiency of protein S. Blood 1995; 85: 3518-23.

[30] Koeleman BPC, Reitsma PH, Allaart CF, Bertina RM. Activated protein C resistance as an additional risk factor for thrombosis in protein C-deficient families. Blood 1994; 84: 1031-5.

[31] Seligsohn U, Zivelin A. Thrombophilia as a multigenic disorder. Thromb Haemost 1997; 78: 297-301.

[32] Griffin JH, Evatt B, Wideman C, Fernandez JA. Anticoagulant protein C pathway defective in majority of thrombophilic patients. Blood 1993; 82: 1989-93.

[33] Zöller B, Dahlbäck B. Linkage between inherited resistance to activated protein C and factor V gene mutation in venous thrombosis. Lancet 1994; 343: 1536-8.

[34] Svensson PJ, Dahlbäck B. Resistance to activated protein C as a basis for venous thrombosis. N Engl J Med 1994; 330: 517-22.

[35] Desmarais S, de Moerloose P, Reber G, Minazio P, Perrier A, Bounameaux H. Resistance to activated protein C in an unselected population of patients with pulmonary embolism. Lancet 1996; 347: 1374-5.

[36] Ruiz-Argüelles GJ, Gonzalez ES, Garces EJ, Ruiz AA. Primary thrombophilia in Mexico: a prospective study. Am J Hematol 1999; 60: 1-5.

[37] Ruiz-Argüelles GJ, Garces EJ, Reyes NV, Ramirez-Cisneros FJ. Primary thrombophilia in Mexico. II. Factor V G1691A (Leiden), prothrombin G20210A, and methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism in thrombophilic Mexican mestizos. Am J Hematol 2001; 66: 28-31.