Analisa karbohidrat di dalam hidangan dengan menggunakan kapiler elektroforesis dengan precolumn derivatisasi dan detektor UV

AbstrakKita menjelaskan suatu metoda elekrtroforesis kapiler selektif yang menggunakan derivatisasi pre-kolom dan detektor UV pada 280 nm untuk menentukan karbohidrat di dalam hidangan. Tiga karbohidrat, glukosa, maltose dan maltotriose, diteliti. Reagen penanda adalah p-aminobenzoic acid (PABA). Di bawah kondisi optimal reaksi penanda mengambil 1 jam pada 40 C dari 250 mM larutan PABA dan 20% asam cuka. Suatu silika dipadukan di kolom kapiler digunakan bersama-sama dengan suatu medium elektroforesis dari 20 mM bufer borat ( pH 10.2). Analisa selesai kurang dari 12 menit. Pendeteksian dibatasi untuk ke tiga analisis pada rentang 3,824,14 mgL-1. Metode dapat diterapkan bagi analisa karbohidrat di dalam beberapa hidangan. Persiapan sampel minimal, terdiri atas hanya degassification, dilution dan/atau filtration.1. PengenalanKarbohidrat seperti glukosa, maltose dan maltotriose ditemukan secara luas di dalam makanan dan hidangan sering digunakan sebagai aditip makanan di mana pemantauan karbohidrat di dalam sampel makanan adalah sangat penting dari bidang ilmu gizi, biologi dan ilmu pengetahuan makanan.Banyak perbedaan metoda analitis, terutama yang didasarkan pada teknik kromatografi, khususnya kromatografi cair kenerja tinggi ( HPLC), penggunaan berbagai detektor berbeda yang telah diuji kadar logamnya.Sebagai suatu alternatif kromatografi, elektroforesis kapiler ( CE) adalah suatu teknik separasi kuat yang menyediakan hasil resolusi tinggi dan menjadi suatu alat standar untuk analisa banyak komponen. Satu perbedaan antara CE dan HPLC adalah CE menggunakan suatu tabung terbuka kapiler untuk menggantikan kolom kromatografi. Beberapa metode CE dikembangkan untuk analisis karbohidrat. sejak karbohidrat kekurangan dan kekuatan kromophor UV kebanyakan dari metoda yang diuraikan di dalam literatur bersandar pada beberapa macam teknik derivatisasi. metoda ini didorong kearah pengurangan resolsi dan kepekaan, kompleksitas pendeteksian sangat ditingkatkan. Beberapa metoda lain msengatasi permasalahan ini, seperti menggunakan didalam kolom derivatisasi dengan 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazole ( PMP), dengan kombinasi dari penanda oleh reductive amination yang menggunakan amina aromatis dan mengurangi bahan reagen atau dengan cuka p-aminobenzoic ( PABA).Tujuannya adalah untuk mengevaluasi berbagai kemungkinan dari elektroforesis kapiler sebagai suatu alternatif HPLC di dalam analisa karbohidrat dengan memanfaatkan teknik derivatisasi pre-kolom yang dikombinasikan dengan p-aminobenzoic acid (PABA) sebagai reagen penanda yang untuk kontrol kualitas.2. Bahan dan metodea. Standar dan reagenGlukosa, maltosa, maltotriosa, matotetraosa, maltopentaosa, maltohexaosa dan maltoheptaosa dibeli dari Sigma Co Kimia. ( St. Louis, MO, AS). larutan baku standar sebanyak 10 mg ml-1 dari tiap analit telah disiapkan di dalam deionized air ganda suatu Milli-Q Sistem ( Millipore, Bedford, BU, AS). Asam p-Aminobenzoic ( PABA) dan sodium cyanoborohydride ( Nabh CN) juga berasal dari Sigma Co Kimia ( St. Louis, MO, AS) dan digunakan sebagai diterima. metil alkohol (Meoh), 99.9% tingkat spectrophotometric, berasal dari Aldrich Co Kimia., Inc. ( Milwaukee, AS). Asam asetat (Acoh) dan hidroksida sodium ( Naoh) berasal dari MERCK ( Darmstadt, Negara Jerman). buffer penyangga telah disiapkan dengan melarutkan sejumlah sodium borat ( Sigma Co Kimia.) di dalam deionized air ganda untuk memperoleh konsentrasi akhir 100 mM, dengan pH nya yang disesuaikan ke 10.2.

b. InstrumenSemua percobaan CE telah dibuat dengan Beckman P/ACE TM MDQ instrumen elektroforesis kapiler. Sistem mencakup 0-30 kV tegangan tinggi built-in persediaan tenaga, dilengkapi dengan suatu detektor array dioda, dan perangkat lunak GOLD untuk sistem kontrol dan penanganan data. Semua kapiler (dipadukan dengan silika) yang memiliki diameter internal 75 m dan 57 cm keseluruhan panjangnya ( Beckman Instrumen Inc., Fullerton, CA, AS). Temperatur dikendalikan penggunaan suatu cairan pendingin fluorocarbon.

c. Prosedur elektroforesisbuffer penyangga adalah 20 mM Na2B4O ( Ph 10.2); sampel disuntik dengan hydrodynamically 8 s pada 0.5 psi. Pendeteksian dilakukan oleh on-column pengukuran UV penyerapan pada 280 nm. Voltase Separasi 20 kV pada temperatur tetap 25 C. kapiler dibilas dengan 0.1 M Naoh untuk 1 min yang dilanjutkan dengan air 1 min dan kemudian equilibrated dengan buffer 3 min.

d. Reaksi labellarutan reagen PABA disiapkan sebelum derivatisasi dengan melarutkan 20 mg Nabh3Cn di dalam 1 ml larutan methanolic yang berisi 250 MM PABA dan 20% Acoh. larutan ini ditambahkan untuk campuran karbohidrat pada konsentrasi 20 mg l-1 di dalam tabung test kecil. Reaksi label diberikan pemutaran lambat untuk 5 min. Hasilkan solusi telah dijaga untuk 1 h pada 40 C dan setelah mendingin suhu diturunkan 1:10 dengan air untuk analisa electrophoretic kapiler.

e. Analisis hidanganUntuk analisis bir, sampel di degassed sebelum menjadi derivatized dan diencerkan 1:20 dengan air dan dilalui sampai 0,22 m membran penyaring utama untuk injeksi. Puncak diidentifikasi dengan membandingkan waktu perpindahan dengan sampel baku.Sejak soft drink diuji kadar logamnya yang dimasukkan lebbih besar jumlahnya dari glukosa, pertama diencerkan 1:50 dengan air Milli-Q, derivatized, diencerkan 1:20 dan dilalui sampai 0,22 m membran penyaring utama unjuk injeksi.

3. Hasil dan diskusia. Umumelektroperogram optimal dari suatu campuran standar tujuh PABA-turunan karbohidtrat ( glukosa, maltose, maltotriose, maltoretraose, maltopentaose, maltohexaose dan maltoheptaose), sebagai hasil waktu analisis kurang dari 12 min, menunjukkan perbedaan sangat tinggi antar puncak (gam. 1)

Gambar 1. Separasi dari tujuh campuran standar PABA-turunan karbohidrat oleh CE dengan deteksi UV pada 280 nm. catatan Puncak: ( 1) glukosa, ( 2) maltose, ( 3) maltotriose, ( 4) maltotetraose, ( 5) maltopentaose, ( 6) maltohexaose, ( 7) maltoheptaose dan R, derivatisasi bahan reaksi ( cuka p-aminobenzoic). Konsentrasi 20 mgl-1, kondisi-kondisi operasioan: 20 mM tetraborat sodium, pH 10.2, L1=57 kapiler Cm, Ld=50 Cm, I.D.=75 Im; 20 KV, 8 s injeksi hydrodynamie

b. Optimalisasi dari reaksi penandaParameter optimum dari reaksi penanda yang dibentuk menggunakan signal glukosa, maltosa dan maltotriosa karena tiga karbohidrat itu sangat mewakili yang biasa digunakan di industri bahan makanan. Reaksi penanda dari karbohidrat dengan derivatisasi reagen PABA didasarkan pada reaksi amina primer dengan reduksi karbohidrat, membentuk dasar shiff yang sesudah itu direduksi oleh NaBH3CN untuk menghasilkan suatu amina sekunder yang stabil.Perbedaan reagen penanda yang telah diuji dan PABA yang dipilih untuk memperoleh hasil yang paling reproducible. Satu dari variabel yang paling utama untuk mengoptimalkan suatu derivatisasi reaksi adalah konsentrasi dari reagen penanda. Dengan reaksi pengujian kadar logam pada konsentrasi PABA yang berkisar antara 0 sampai 450 nM. Konsentrasi minimum dari 150 mM diperlukan untuk melengkapi reaksi tetapi satu dari 250 mM yang ideal ditemukan untuk menjaminketepatan alat ukur dari area puncak untuk pemilihan karbohidrat (gam. 2a) maka kita gunakan konsentrasi ini untuk sisa dari percobaan.Karena dasar Shiff yang terbentuk sepanjang tahap pertama dari reaksi penanda dibutuhkan untuk reduksi lebih lanjut, agen pereduksi diperlukan, itu lebih sering digunakan NaBH3CN. Efek perbedaan konsentrasi dari reagen ini di dalam larutan reaksi dari karbohidrat diuji dikisaran 0-60 mg. Sedikitnya 10 mg dibutuhkan untuk menyelesaikan tahap kedua dari reaksi penanda selagi konsentrasi lebih tinggi daripada 60 mg menyebabkan penurunan area puncak (gam. 2b). Kita pilih menggunakan 20 mg untuk memastikan keduanya reaksi selesai dan kepekaan yang tinggi dari detektor.Karena reagen derivatisasi yang dipersiapkan di dalam asam asetit (AcOH) yang kita pelajari berpengaruh ketika area puncak dari persentase berbeda dari bahan pelarut di reaksi penanda dan ditemukan tidak penting dengan analisis yang dipelajari. Dengan begitu kita memilih menggunakan 20% AcOH, yang menyajikan tingkatan daya larut terbaik untuk tujuan kita.Parameter lain yang cenderung mempengaruhi reaksi derivatisasi adalah waktu pemanasan dan temperatur. Temperatur dimodifikasi antara 30 dan 90 C diatas 2 jam. Area yang paling tinggi untuk analisis yang diperoleh setelah 1 jam pada 40 C.Setelah pemanasan untuk waktu pencampuran reaksi yang didinginkan ke suhu ruangan dan kemudian diencerkan 1;10 dengan air sebelum analisis dengan CE.

Gam. 2 optimalisasi dari kondisi percobaan dari reaksi label : (a) konsentrasi PABA; (b) kuantitas NaBH3CN; (c) persentase AcOH. Suhu reaksi: 40 C, waktu 60 menit. Kondisi elektroforesis (1) glukosa, (2) maltosa, (3) maltotriosa.

c. Separasi karbohidrat dengan CESeparasi dari standar PABA-turunan karbohidrat dilakukan dengan zona elektroforesis kapiler (CZE), didasarkan pada perbandingan antara muatan elektrik dan ukuran molekul. Pendeteksian dilakukan pada 280 nm dan diidentifikasi.Konsentrasi buffer juga harus optimal karena berpengaruh pada kedua arus elektroosmotik dan mobilitas elektroforesis di CE. Itu juga mempengaruhi simetri dari puncak. Jika konsentrasi dari ion analit lebih tinggi dari ion buffer, medan listrik di kapiler menjadi menyimpang, mendorong ke arah puncak yang irreguler (tidak beraturan). Efek dari konsentrasi buffer pada mobilitas dan resolusi karbohidrat diselidiki dengan menggunakan konsentrasi sodium-tertaborat larutan buffer karbohidrat yang berbeda pada pH 10,2. Walaupun resolusi dapat ditingkatkan dengan meningkatkan konsentrasi batas ke konsentrasi buffer yang tinggi karena Pemanasan Joule. Mempertimbangkan semua efek, kita memutuskan konsentrasi 20 mM.Di antara instrumen parametertal, efek voltase yang berbeda dari 5 ke 30 kV ketika kapiler separasi elektroforesis diuji. Diharapkan, mobilitas dari PABA- turunan karbohidrat dikurangi secara serentak dengan penurunan voltase. Voltase 20 kV yang dikerjakan.Waktu injeksi adalah parameter instrumental lain yang penting di dalam separasi elektroforesis kapiler. Kita mencoba waktu antara 4 dan 16 s dan memperoleh hasil terbaik pada 8 s.

Gam. 3 elektroperogram PABA dari sampel bir yang berbeda

d. Linearitas dan kepekaanLinearitas dan kepekaan dari metode telah diuji terhadap glukosa, maltosa, dan maltotriosa, karbohidrat yang umum ditemukan di makanan dan minuman. Semua kurva kalibrasi menunjukkan linearitas yang baik dari 4 ke 60 mgl-1. Masing-masing poin dari plot kalibrasi diulang tiga kali di dalam larutan sendiri dengan cara yang sama. Plot kalibrasi menandai adanya korelasi yang baik antara are puncak dan konsentrasi PABA-turunan karbohidrat; koefisien kemunduran adalah 0,997 untuk ketiga campuran. Ketepatan pengukuran telah dicek untuk tiga penyuntikan untuk semua poin dari plot kalibrasi.

e. Aplikasi untuk sampel sesungguhnyaPengujian ini menunjukkan kemampuan dan potensial resolusi dari teknik separasi CE menggunakan pendekteksian UV untuk menentukan karbohidrat di dalam bir yang berbeda tipe (alkohol dan non-alkohol) dan minuman non-alkohol seperti jus buah dan soft drink.Ketiga analit yang diukur (glukosa, maltosa, dan maltotriosa) adalah fermentasi karbohidrat yang mana tergantung ragi yang digunakan. Kontribusi dari karbohidrat yang paling penting untuk pemanis dapat diukur (range ditemuakan di bir adalah 0,4-1,1 gl-1 untuk glukosa, 0,7-3,0 gl-1 untuk maltosa dan 0,4-3,4 gl-1 untuk maltotriosa). Jika karbohidrat terdiri lebih dari empat unit glikosil hidangan sukar manis. Seperti dapat dilihat di gam. 3, puncak maltotriosa tampak disemua tipe dari analisis bir, sedangkan maltosa terlihat di keduanya, bir spesil dan bir hitam spesial. Glukosa hanya terdeteksi di bir hitam spesial.Karbohidrat lain non-fermentasi seperti maltotetraosa, maltopentaosa, maltohexaosa dan maltoheptaosa juga terlihat di analisis sampel, seperti dapat terlihat di elektroperogram, tetapi mereka belum diukur.Juga dilakukan penelitian plum jus, seperti jus jeruk dan soft drink. Karbohidrat total yang terkandung di dalam plum dan jus jeruk adalah 4,5%. Elektropherogram untuk kesesuaian analisis untuk dua jus dan soft drink ditunjukkan di gam. 4. Seperti dapat kita lihat di elektropherogram, kita mendeteksi dan meneliti di dalam semua minuman glukosa (tab. 2). Dalam semua kasus kita mengecek hasil terhadap metode standar penambahan dari kalibrasi, memperoleh 1,50% dan 1,98% glukosa untuk plum dan jus jeruk, yang mana perbedaan dari kandungan ditunjukkan oleh manufakturer (4,5%) karena data ini sesuai dengan total isi karbohidrat.

Gambar 4. Elektroferogram dari PABA-turunan karbohidrat : (a) plum jus, (b) jus jeruk, (c) soft drink.

4. kesimpulanMetode PABA dapat digunakan untuk semua jenis turunan dari reduksi karbohidrat. Derivativenya dapat lebih efisien dipisahkan oleh CE. Penyerapan yang kuat di daerah UV memastikan aplikasi yang luas di dalam kontrol kualitas rutin yang cepat, analisa banyak sampel. Separasi oleh CE membuktikan menjadi alternatif HPLC dan akan menyediakan separasi yang lebih effisien untuk analisis makanan dimasa akan datang.