Memantine, sebuah Antagonis dari NMDA GlutamatReseptor, Mempengaruhi Sel Proliferasi, Diferensiasi dan

Siklus intraseluler dan Menginduksi Apoptosis diTrypanosoma cruzi

AbstrakPenyakit Chagas disebabkan oleh protozoa parasit Trypanosoma yang cruzi dan mempengaruhi sekitar 10 juta orang didaerah endemik dari Meksiko dan Amerika Tengah dan Selatan. Saat kemoterapi tersedia terbatas untuk dua senyawa: Nifurtimox dan Benznidazole. Kedua obat mengurangi gejala penyakit dan kematian di antara terinfeksi individu ketika digunakan selama fase akut, tetapi keberhasilan mereka selama fase kronis (dimana mayoritas kasus yang didiagnosis) masih kontroversial. Selain itu, obat ini memiliki beberapa efek samping. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi pengaruh Memantine, antagonis reseptor glutamat dalam SSP mamalia, pada siklus hidup T.cruzi. Memantine menunjukkan efek trypanocidal, menghambat proliferasi epimastigotes (IC50 172,6 mM). Selanjutnya,senyawa ini mengganggu metacyclogenesis (pengurangan sekitar 30%) dan mempengaruhi metabolisme energi dari parasit. Selain itu, Memantine memicu mekanisme yang menyebabkan kematian sel apoptosis seperti dari epimastigotes, dengan paparan ekstraselular phosphatidylserine, peningkatan produksi spesies oksigen reaktif, penurunan kadar ATP, peningkatan Ca2 + intraseluler dan perubahan morfologi. Selain itu, Memantine mengganggu siklus intraseluler dari parasit, khususnya tahap amastigote (IC50 31 mM). Menariknya, tahapan siklus hidup parasit yang memerlukan lebih banyak energi (epimastigote dan amastigote) lebih terkena dampak seperti proses diferensiasi dan invasi sel.

PengantarTrypanosoma cruzi adalah agen etiologi penyakit Chagas,yang mempengaruhi sekitar 10 juta orang yang tinggal di endemik daerah Meksiko dan Amerika Tengah dan Selatan, dengan 28 juta orang pada risiko infeksi [1]. T. cruzi memiliki siklus hidup yang kompleks yangbergantian antara vektor serangga dan mamalia reduviid host (manusia di antara mereka). Selama siklus biologis, parasit membedakan beberapa kali antara infektif, bentuk non-pemisah dan membagi bentuk yang tidak efisien atau tidak dapat menginfeksi sel mamalia. Epimastigotes, bentuk replikatif di serangga vektor, menjajah saluran pencernaan dan berdiferensiasi menjadi metacyclic trypomastigotes, bentuk infektif serangga yang diturunkan, di terminal midgut. Selama makan darah pada host mamalia, seranggabuang air besar dan menyetorkan formulir ini dengan kotoran, yang diinternalisasi oleh host mamalia dan menyerang sel-sel di mana mereka berdiferensiasi menjadi tahap amastigote replikatif dalam sitoplasma. Amastigotes mereplikasi dengan pembelahan biner sampai membedakan ke mamalia yang diturunkan trypomastigotes, melewati transien epimastigote-seperti panggung [2,3]. Trypomastigotes ini menginduksi lisis sel inang, meledak ke dalam lingkungan ekstraseluler mana mereka menyerang sel-sel baru atau mencapai aliran darah. Parasit menyebarkan seluruh mamalia yang terinfeksi melalui darahdan akhirnya dapat diambil oleh serangga reduviid baru selama makan darah. Di midgut, yang trypomastigotes tertelan membedakan ke epimastigotes, yang meniru, sehingga menjajah baru serangga vektor [3].Evolusi klinis penyakit Chagas 'pada manusia dapatdibagi menjadi dua fase: akut dan kronis. Fase akut adalah biasanya tanpa gejala dengan parasitemia paten dan non-spesifik gejala. Fase kronis ditandai oleh jaringan jarangparasitisme dan subpatent parasitemia yang berlangsung selama kehidupan tuan rumah.

Kebanyakan pasien dalam fase kronis (60-70%) tidak akan pernah mengembangkan penyakit klinis jelas. Namun, sekitar 30-40% pasien kronis akan mengembangkan fisiologis penting perubahan: jantung dipengaruhi, dengan hipertrofi dan dilatasi, dan selanjutnya, saluran pencernaan, terutama kerongkongan dan usus besar, yang terpengaruh, dengan dilatasi dan munculnya megaviscera [4-6] sebagai Ulasan di referensi [7].Kemoterapi bergantung pada dua obat yang ditemukan sekitar 40 tahun yang lalu: Nifurtimox dan Benznidazole. Kedua obat yang efektif untuk mengobati fase akut dari penyakit.

Ringkasan Penulis

Trypanosoma cruzi adalah parasit ditularkan ke mamalia host oleh vektor serangga yang dikenal sebagai ciuman bug. Spesies ini dapat mengakibatkan patogen bagi manusia, menyebabkan penyakit Chagas ' di Amerika. Pengobatannya bergantung pada dua obatditemukan lebih dari 40 tahun yang lalu. Selain toksisitas mereka, kelemahan utama obat ini adalah kenyataan bahwa mereka sangat efisien hanya selama fase akut dariinfeksi. Namun karena kurangnya gejala tertentu, fase akut infeksi sebagian besar tidak terdiagnosis. Di Bahkan, sebagian besar pasien yang didiagnosis pada tahap kronis,di mana perawatan yang tidak memuaskan. Dalam pandangan itu, sangat mendesak untuk mencari obat baru dengan toksisitas rendah dan mampu untuk membunuh parasit pada pasien kronis. Atas dasar Temuan sebelumnya, kami mencari obat terhadap glutamatmengenali molekul permukaan, menjaga perhatian khusus pada orang-orang yang sudah digunakan pada manusia untuk lainnya tujuan (strategi ini disebut reposisi obat, danmemungkinkan untuk menghemat waktu dan uang dalam uji klinis: beberapa parameter seperti keracunan, farmakokinetik, efek samping pada manusia sudah dikenal). Di sini kita melaporkan bahwa Memantine, sebuah glutamat NMDA reseptor antagonissudah digunakan untuk mengobati penyakit Alzheimer, hadiah perspektif yang menarik sebagai obat trypanocidal.

Namun, keberhasilan mereka dalam mengobati tahap kronis, ketika sebagian besar pasien didiagnosis, adalah kontroversial [7]. Selain itu, kekurangan untuk kedua obat telah dilaporkan, seperti efek samping yang serius beracun dan baru-baru, munculnya parasit yang resistan terhadap obat.Fakta-fakta ini menggarisbawahi kebutuhan mendesak untuk mengintensifkan pencarian obat baru melawan T. cruzi [7,8].Kelompok kami telah menjelajahi strategi reposisi obat,yang sedang banyak digunakan untuk penemuan novelstrategi terapi untuk mengobati penyakit tropis [9,10]. Ini Strategi mencari penggunaan baru untuk obat yang sudah disetujui untuk pengobatan penyakit pada manusia. Paveto dan rekan memiliki menyarankan bahwa T. epimastigotes cruzi memiliki N-metil-Daspartate (NMDA) -jenis L-glutamat reseptor yang terlibat dalam kontrol Ca2 + sitosol tingkat, fungsional analog dengan dilaporkan dalam sel saraf [11]. Selain itu, kelompok kami ditandai transporter glutamat [12] yang mampu mengikat NMDA, berperilaku sebagai reseptor glutamat (data tidak dipublikasikan). Tambahan lagi, analog dari amantadine dan Memantine (1,2,3,5,6,7-hexahydro- 1,5: 3,7-dimethano-4-benzoxonin-3-il) amina dengan reseptor NMDA Kegiatan antagonis juga ditunjukkan untuk memiliki signifikan Kegiatan trypanocidal terhadap Trypanosoma brucei [13]. Data ini mendorong kami untuk berhipotesis bahwa kegiatan trypanocidal hadir di Senyawa diarahkan terhadap reseptor glutamat mamalia. DiPada penelitian ini, kami menguji anti-T. Kegiatan cruzi tiga senyawa yang memiliki efek antagonis pada reseptor NMDA: Amantadine dan Memantine, amina trisiklik dengan rendah-tomoderate afinitas untuk reseptor NMDA dan digunakan untuk pengobatan penyakit Alzheimer [14], dan MK-801, yang merupakan saat ini sedang diuji dalam studi praklinis

[15]. Memantine, sebuah blocker tidak kompetitif dari NMDA terus terlalu aktifreseptor dalam neuron, dipamerkan antiproliferatif tertinggi aktivitas di epimastigotes dan efek trypanocidal relevan terhadap bentuk-bentuk infektif dari T. cruzi. Percobaan kami menunjukkan bahwa Memantine memobilisasi intraseluler Ca2 + dan menginduksi apoptosis,yang mendukung kehadiran reseptor dengan aktivitas mirip dengan reseptor glutamat NMDA yang dapat digunakan sebagai target obat terhadap parasit ini.

Bahan dan metode

Reagen

Memantine dibeli dari TOCRIS; MK-801, MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyltretazolium bromida) dan kit untuk sel somatik bioluminescent yang dibeli dari Sigma- Aldrich (St Louis, MO, USA). Amplex merah, lobak peroksidase, Fluo-04:00 dan annexin V-FITC yang dibeli dari Invitrogen (Eugene, Oregon, USA). Budaya media dan betis janin serum (FCS) yang dibeli dari Cultilab (Campinas, SP, Brazil).

Sel dan parasit

Garis sel indung telur hamster Cina (CHO-K1) yang dibudidayakan dalam medium RPMI ditambah dengan 10% panas dilemahkan FCS, 0,15% (b / v) NaCO3, 100 unit mL21 penisilin dan 100 mg mL21 streptomisin di 37uC dalam suasana lembab yang mengandung 5% CO2. T. cruzi CL regangan clone 14 epimastigotes [16] yangdipertahankan pada fase pertumbuhan eksponensial oleh subkultur setiap 48 jam dalam hati Infusion Tryptose (LIT) menengah ditambah dengan 10% FCS di 28uC. Trypomastigotes diperoleh dengan infeksi sel CHO-K1 dengan trypomastigotes seperti yang dijelaskan sebelumnya [17]. Trypomastigotes dikumpulkan dari ekstraseluler yang menengah lima atau enam hari setelah infeksi.

Tes hambatan pertumbuhan

T. cruzi epimastigotes pada fase pertumbuhan eksponensial (5.0-6,06107 sel mL21) dikultur dalam medium LIT segar. Sel-sel diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda dari obat-obatan atau tidak diobati (kontrol negatif). Kombinasi Rotenone (60 mM) danAntimycin (0,5 mM) digunakan sebagai kontrol positif untuk penghambatan sebagai dijelaskan sebelumnya [5]. Sel-sel (2,56106 mL21) dipindahkan untuk pelat budaya 96-baik dan diinkubasi pada 28uC. Sel proliferasi dihitung dengan membaca kepadatan optik (OD) di 620 nm selama delapan hari. OD itu dikonversi ke kepadatan sel nilai (sel per ml) menggunakan persamaan regresi linier sebelumnya diperoleh di bawah kondisi yang sama. Konsentrasi senyawa yang menghambat 50% proliferasi parasit (IC50) ditentukan selama fase pertumbuhan eksponensial (lima hari) oleh pas data ke kurva sigmoidal dosis-respons yang khas menggunakan OriginPro8. Senyawa dievaluasi dalam rangkap empat disetiap percobaan. Kecuali jika dinyatakan, untuk eksperimen tujuan epimastigotes (1,06106 sel mL21) dikultur di LIT dan diperlakukan dengan konsentrasi yang sesuai dengan IC50(172,6 mM) Memantine atau tidak dirawat (control). Sebelum melakukan percobaan, epimastigotes dicuci dua kali dalam PBS dan disuspensi kembali dalam 50 ml buffer mengikat (10 mM HEPES, 140 mM NaCl dan 2,5 mM CaCl2, pH 7.4). Hasil yang ditunjukkan di sini sesuai dengan tiga percobaan independen.

Analisis paparan phosphatidylserine ekstraseluler.

Parasit diobati dengan Memantine selama empat hari atau tidak diperlakukan (kontrol). Annexin V-FITC dan propidium iodida yangditambahkan ke konsentrasi akhir yang ditunjukkan oleh produsen. Sel-sel dianalisis dengan sitometri pada cytometer Guava (General Electric).

Produksi hidrogen peroksida.

Epimastigote diobati dengan Memantine selama 24 jam, dicuci dan diresuspensi dalam PBS (5 mM suksinat). Sel-sel diinkubasi dengan 12 mM amplex merah dan 0,05 U mL21 peroksidase lobak. Fluoresensi dipantau di lexcitation sebuah dari 563 nm dan lemission dari 587 nm pada Spectra Max M3 fluorometer (Perangkat Molekuler). Kalibrasi dilakukan dengan menggunakan hidrogen peroksida sebagai standar.

Analisis intraseluler Ca2 + tingkat

Parasit (1,06108 sel) diperlakukan Memantine selama empat hari berada diinkubasi dengan 5 mM Fluo-04:00 (Invitrogen) selama satu jam pada 28uC. Setelah periode ini, sel-sel dicuci dua kali dengan HEPESglucose (50 mM HEPES, 116 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, 5.5 mM glukosa dan 2 mM CaCl2, pH 7,4), disuspensi dalam buffer yang sama dan didistribusikan ke piring 96-baik (2,56107 per baik) dalam rangkap tiga. Pembacaan dilakukan pada Spectra Max M3 fluorometer menggunakan lexcitation dari 490 nm dan lemission dari 518 nm.

Penentuan T. cruzi tingkat ATP intraseluler

Tingkat ATP intraseluler diukur dalam diobati (atau tidak bentuk epimastigote. Untuk menilai efek dari Memantine pada tingkat intraseluler ATP, kit untuk sel somatik bioluminescent dibeli dari Sigma-Aldrich digunakan sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, 50 ml PBS ditambahkan ke100 ml seluler ATP-releasing reagen dan ditambahkan ke 50 ml suspensi parasit mengandung 5,06106 diobati atau tidak diobati (kontrol) sel mL21. Konsentrasi ATP ditentukan menggunakan kurva standar konsentrasi yang berbeda dari ATP. Pendaran diperoleh dengan reaksi antara luciferase dan ATP yang dirilis setelah lisis sel. Tingkat emisi cahaya diukur pada Lumat LB 9507 luminometer di 570 nm.

Pengaruh Memantine pada metacyclogenesis

Epimastigotes (5,06106 sel mL21) ditumbuhkan di LIT menengah, dipindahkan ke Grace menengah [19] dan diperlakukan atau tidak diperlakukan (kontrol) dengan 172,6 mM Memantine (nilai IC50). dihari keenam, setelah transfer, parasit dihitung dalam Neubauer ruang, dan persentase bentuk metacyclic ditentukan.

pengaruh Memantine pada viabilitas sel mamalia

Sel CHO-K1 (5,06105 sel mL21) yang diunggulkan di 24 sumur piring di media RPMI dilengkapi dengan FCS (10%) dengan konsentrasi yang berbeda dari obat-obatan atau tidak diobati (kontrol). Sel viabilitas dievaluasi 48 jam setelah mulai pengobatan dengan menggunakan uji MTT [20]. IC50 ditentukan dengan pas data untuk kurva dosis-respons khas sigmoidal menggunakan OriginPro8.

Pengaruh Memantine pada invasi trypomastigote

Sel CHO-K1 (5,06104 per sumur) yang dipelihara di 24 sumur piring di media RPMI ditambah dengan 10% FBS dan dipertahankan pada 37uC. Setelah 24 jam, sel-sel yang terinfeksi bentuk trypomastigote (2,56106 per sumur) dan diperlakukan dengan berbeda konsentrasi Memantine (50-300 mM) selama empat jam. Setelah periode ini, parasit gratis dan Memantine telah dihapus. The sel yang terinfeksi dicuci dua kali dengan PBS. The RPMI menengah adalah diganti, dan piring diinkubasi pada 33uC. Trypomastigotes dikumpulkan dari media ekstraseluler pada kelima hari dan dihitung dalam ruang Neubauer.

Pengaruh Memantine pada meledak trypomastigote

Sel CHO-K1 (5,06104 per sumur) yang dipelihara di 24 sumur piring di media RPMI ditambah dengan 10% FBS dan dipertahankan pada 37uC. Setelah 24 jam, sel-sel yang terinfeksi bentuk trypomastigote (2,56106 per sumur) selama empat jam. Sesudah ini periode, parasit bebas telah dihapus. Sel-sel yang terinfeksi adalah dicuci dua kali dengan PBS, media RPMI diganti, dan sel disimpan dalam budaya di hadapan konsentrasi yang berbeda dari Memantine (5-300 mM). Lempeng kemudian diinkubasi di 33uC. Trypomastigotes dikumpulkan dari ekstraseluler yang media pada hari kelima dan dihitung dalam ruang Neubauer.

Pengaruh Memantine pada tahap intraseluler

Sel CHO-K1 (5,06104 per sumur) yang dipelihara di 24 sumur piring di media RPMI ditambah dengan 10% FBS dan diinkubasi pada 37uC. Setelah 24 jam, sel-sel yang terinfeksi bentuk trypomastigote (2,56106 per sumur) selama empat jam. The sel yang terinfeksi dicuci dua kali dengan PBS, media RPMI adalah diganti, dan sel-sel diperlakukan pada waktu yang berbeda selama invasi, setelah 24 jam (tahap amastigote) dan setelah 60 h (epimastigote- seperti panggung) dengan 31 mM Memantine (sesuai dengan IC50 nilai yang diperoleh untuk pengobatan sel yang terinfeksi). Plat diinkubasi pada 33uC. Trypomastigotes dikumpulkan dari media ekstraseluler pada hari kelima dan dihitung dalam Neubauer chamber.

Analisis statistik

ANOVA satu arah diikuti oleh Tukey post-test digunakan untuk Analisis statistik. T test digunakan untuk menganalisis perbedaan antara kelompok. P, 0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Gambar kurva 1. Pertumbuhan bentuk epimastigote dari Trypanosoma cruzi. Kurva pertumbuhan dengan adanya konsentrasi yang berbeda: kiri senyawa. Perawatan dengan (A) Memantine (MM), (B) MK-801, (C) Amantadine (AMT); di 28uC dan 7,4 pH: hitam persegi: 0 mM; hitam up-pointing segitiga: 30 mM (MM atau AMT), 100 mM (MK); hitam bawah-menunjuk segitiga: 60 mM (MM), 90 mM (AMT), 200 mM (MK); hitam kiri menunjuk segitiga: 90 mM (MM), 150 mM (AMT), 300 mM (MK); hitam kanan menunjuk segitiga: 120 mM (MM), 250 mM (AMT), 400 mM (MK); diamond hitam: 150 mM (MM), 400 mM (AMT), 500 mM (MK); hitam pentagon: 180 mM (MM), 500 mM (AMT), 600 mM (MK); segi enam hitam: 210 mM (MM), 700 mM (AMT atau MK); bintang Hitam:250 mM (MM), 1.000 mM (AMT), 800 mM (MK); terbalik lingkaran putih: 300 mM (MM), 1 mM (MK); lingkaran hitam: kontrol Penghambatan (0,5 mM antimycin dan 60 mM rotenone). Kanan: kurva dosis-respons.

HasilMemantine mempengaruhi pertumbuhan bentuk epimastigote Untuk menyelidiki kemungkinan adanya target untuk mamalia NMDA inhibitor reseptor glutamat, yang mengarah ke sebuah trypanocidal aktivitas, Amantadine, Memantine dan MK-801 dievaluasi. Sebuah skrining awal untuk kemampuan senyawa ini untuk menghambat Pertumbuhan epimastigote dilakukan. T. cruzi epimastigotes yang dikultur dalam medium LIT dengan konsentrasi yang berbeda dari obat yang dipilih atau tidak ada obat (kontrol). Amantadine, Memantine dan MK-801 menghasilkan penghambatan tergantung dosis dari epimastigote pertumbuhan di 28uC dan pH 7,5, kondisi pertumbuhan yang optimal untuk sel-sel ini. Perbedaan pertumbuhan yang diamati antara diperlakukan sel dan kontrol yang signifikan secara statistik (p, 0,05), dan IC50 bertekad untuk menjadi 172,6 mM untuk Memantine, 300 mM untuk MK-801 dan 451,2 mM untuk Amantadine (Gambar 1A, 1B dan 1C,masing-masing). Meskipun menjadi IC50 relatif tinggi ketika dibandingkan dengan yang diperoleh di sini untuk Benznidazole, (yang mengakibatkan menjadi 7 mM, lihat Gambar S1), fakta bahwa Memantine adalah dianggap sebagai obat yang aman bagi manusia (beberapa efek samping telah dilaporkan) pada dosis yang relatif tinggi (hingga 20 mg / hari kg), bersama-sama dengan fakta-fakta yang tersedia secara komersial dan murah, yang dipimpin kita untuk pilihan untuk studi lebih lanjut dengan menyelidiki dampaknya pada proses biologis dari T.cruzi.

Memantine mengarah ke produksi ROS,

peningkatan transien di intraseluler Ca2 + dan kematian sel terprogram (PCD) di bentuk epimastigote Kematian sel terprogram ditandai dengan morfologi dan perubahan biokimia. Sebuah perubahan besar yang diamati di sel yang mengalami PCD adalah paparan dari phosphatidylserine pada ekstraseluler yang wajah membran sitoplasma. Parasit diperlakukan yang diinkubasi dengan annexin V-FITC untuk menilai paparan eksternal phosphatidylserine (fitur dari PCD) dan propidium iodida untuk menilai kemungkinan pecahnya membran parasit (fitur nekrosis), dan selanjutnya dievaluasi oleh aliran cytometry. Seperti yang ditunjukkan (Gambar 2A), parasit yang tidak diobati (kontrol) menunjukkan 10% positif untuk paparan phosphatidylserine, sedangkan parasit diobati dengan Memantine menunjukkan 42% positif (Gambar 2B). Tipe lain dari Proses nekrotik dikeluarkan karena pemeliharaan parasit integritas membran dikonfirmasi oleh tidak adanya propidium pewarnaan iodida (Gambar 2C). Untuk mengkonfirmasi bahwa menginduksi Memantine apoptosis pada epimastigotes, keunggulan untuk proses ini di trypanosomatidsseperti peningkatan spesies oksigen reaktif (ROS), penurunan kadar ATP, peningkatan intraseluler Ca2 + tingkat dan sel susut [21-23], dieksplorasi. Untuk mengevaluasi produksi H2O2 di parasit diobati dengan Memantine, bentuk epimastigotediobati dengan 172,6 mM Memantine (konsentrasi yang sesuai dengan nilai IC50). Setelah pengobatan selama 24 jam, yang parasit diinkubasi dengan amplex merah dan lobak peroksidase. Seperti yang diamati, parasit diperlakukan menghasilkan sedikit peningkatan jumlah H2O2 dari parasit yang tidak diobati (Gambar 3A). Untuk menentukan konsentrasi intraselular Ca2 + , epimastigote bentuk diinkubasi dengan Memantine (172,6 mM) atau tidak ada obat (kontrol) selama empat hari. Setelah pengobatan, parasit yang diinkubasi dengan Fluo-4 dan dianalisis oleh fluorometry. Parasit diperlakukan dipamerkan lebih tinggi intraseluler Ca2 + konsentrasidibandingkan dengan parasit yang tidak diobati (Gambar 3B). Tingkat ATP intraseluler dalam sel dirawat dan diobati juga ditentukan dengan menggunakan alat tes bioluminescence. intraseluler ATPtingkat penurunan dalam parasit diobati dibandingkan dengan kontrol (parasit tidak diobati) (Gambar 3C), menunjukkan bahwa energi metabolisme parasit dipengaruhi oleh obat. Akhirnya, kami dievaluasi potensi perubahan morfologi di parasit diperlakukan dibandingkan dengan kontrol (Gambar 4). Epimastigotes diobati dengan Memantine pameran perubahan dramatis dalam morfologi (Gambar 4C- D), menghadirkan bentuk bulat karakteristik yang sesuai dengan penyusutan, sebuah

fitur yang juga dijelaskan untuk sel apoptosis termasuk trypanosomatids [23,24]. Perubahan ini tercermin oleh perubahan pada nilai-nilai yang diperoleh untuk maju dan sisi terang hamburan (Tabel1).

Pengaruh Memantine pada metacyclogenesis

Karena Memantine diproduksi aktivitas apoptosis di epimastigotes, kami mengevaluasi apakah obat bisa mengganggu parasit diferensiasi. Metacyclogenesis adalah proses yang ditandai di T. cruzi yang melibatkan modulasi sementara Ca2 + tingkat dan tergantung pada status metabolik parasit [25], yang keduanya dipengaruhi oleh Memantine. Atas dasar ini, kami mengevaluasi efek dari Memantine pada metacyclogenesis. Parasit memantine-diperlakukan menderita penurunan 30% dalam jumlah bentuk metacyclic dibandingkan dengan kontrol (tanpa perlakuan parasit) (Gambar 5).

Pengaruh Memantine pada invasi dan intraseluler yang siklus T. Cruzi

Untuk mengevaluasi efek pengobatan pada bentuk intraseluler parasit, pertama kita mengevaluasi toksisitas Memantine untuk mamalia sel CHO-K1 oleh MTT assay untuk menghindari dosis sitotoksik.Memantine ditahan dengan baik oleh sel CHO-K1, dengan IC50 624.5646 mM (Gambar 6A). Berdasarkan hasil ini, kami mengevaluasi Pengaruh Memantine pada infeksi parasit menggunakan konsentrasi sampai 0,4 mM (di bawah IC50 untuk sel CHO-K1). Untuk memverifikasi efek obat pada infektivitas trypomastigote, sel CHO-K1 terinfeksi dan diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda Memantine (mulai 50-400 mM) atau tidak dirawat (control). Parasit yang dirawat selama empat jam (interval sesuai dengan proses invasi sel). Sama sekali konsentrasi, penurunan yang signifikan dalam jumlah trypomastigotes dilepaskan dari sel diperlakukan segaris pada 5 hari setelah infeksi diamati dibandingkan dengan kontrol,menunjukkan bahwa Memantine mengganggu proses infeksi, dan IC50 bawah kondisi ini bertekad untuk menjadi 206,3 mM (Gambar 6B). Kami juga mengevaluasi efek pengobatan setelah invasi dari sel mamalia oleh T. cruzi. Semua perawatan menghasilkan penurunan yang signifikan dalam meledak trypomastigote pada hari 5 setelah infeksi dibandingkan dengan kontrol (Gambar 6C). Hasil ini menunjukkan Memantine yang juga mengganggu proses yang terlibat dalam siklus intraseluler. Dengan kondisi tersebut, nilai IC50 adalah 31 mM, kurang dari 20 kali IC50 untuk sel CHO-K1 (selektivitas Indeks: 20,13). Mengingat efek dari pengobatan sel yang terinfeksi di seluruh seluruh siklus infeksi, kami menentukan yang mementaskan dari siklus intraseluler (trypomastigote, amastigote atau epimastigotelike) lebih rentan terhadap pengobatan dengan Memantine. Untuk mengeksplorasi pertanyaan ini, kami mengambil keuntungan dari fakta bahwa CL14 yang regangan menghasilkan infeksi sinkronis dalam sel CHO-K1 sebagai dilaporkan sebelumnya [17]. Dalam percobaan ini, 31 mM Memantine(konsentrasi yang sesuai dengan nilai IC50 bila diterapkan seluruh infeksi) ditambahkan ke budaya yang terinfeksi di waktu yang berbeda: periode infeksi (empat jam), antara 24 dan 60 jam pasca infeksi (ketika parasit berada dalam sel inang- sitoplasma, sebagai amastigotes) dan antara 60 dan 96 jam postinfection (ketika sebagian besar populasi parasit intraseluler di tahap epimastigote-seperti dan membedakan ke trypomastigotes). Tahap yang paling rentan terhadap pengobatan adalah amastigote yang tahap (Gambar 6D), dengan penurunan 35% dalam jumlah egressed trypomastigotes dibandingkan dengan kontrol.

Diskusi

Penemuan obat baru untuk penyakit diabaikan adalah suatu keharusan untuk pengembangan

kemoterapi lebih efisien. Namun, beberapa strategi alternatif harus diikuti secara paralel untuk mempercepat proses mengoptimalkan pengobatan ini penyakit. Dalam hal ini, pencarian untuk keperluan terapeutik baru (di hal ini, terhadap T. cruzi) obat terkenal sudah digunakan untuk manusia (seperti Memantine) dapat membantu mengurangi waktu dan sumber daya memakan langkah karena parameter untuk aplikasi mereka pada manusia (seperti farmakokinetik, toksisitas, ditoleransi maksimum dosis dan interaksi dengan obat lain) sudah baik ditandai [10,26]. Reposisi obat adalah tujuan utama karya ini. dari The kompetitif NMDA antagonis reseptor Amantadine, Memantine, dan MK-801, yang dijelaskan dalam farmakope yang sebagai antagonis dari reseptor NMDA glutamat, dipamerkan Kegiatan trypanocidal. Reseptor ini belum dijelaskan dalamT. cruzi pada tingkat molekuler, meskipun bukti keberadaan mereka di T. cruzi telah dilaporkan [11]. Semua tiga obat dievaluasi menghasilkan penghambatan tergantung dosis proliferasi dan kematian di T. cruzi epimastigotes. Menariknya, Amantadine dan Memantine, yang berbagi struktur dasar merekaterdiri dalam amina trisiklik (Gambar 7), yang kurang dan lebih antagonis yang efektif, masing-masing. Kehadiran dua metil kelompok di Memantine, yang absen di Amantadine, berkurang IC50 yang pertama sehubungan dengan kedua dengan faktor 2,5, menunjukkan bahwa sedikit modifikasi pada struktur pemimpin dapat mengakibatkan obat dioptimalkan. Untuk menyelidiki mekanisme kematian, beberapa parameter dievaluasi. Pertama, integritas sitoplasma yang membran dan eksposur phosphatidylserine pada Wajah ekstraseluler dievaluasi dan sangat disarankan PCD dengankarakteristik apoptosis. Jenis PCD telah dijelaskan untuk protista uniseluler, termasuk T. cruzi, Leishmania dan Plasmodium [27-30]. Mirip dengan metazoans, apoptosis dipicu oleh perubahan fungsi mitokondria. Peran mitokondria di proses PCD yang berbeda termasuk apoptosis baik ditandai [21-23]. Produksi ROS bersama dengan berkurangnya tingkat ATP intraseluler menyarankan organel ini sebagai aktor utama dalam gating proses ini. Kedua, peningkatan Ca2 + intraselulertingkat dan perubahan morfologi konsisten dengan kematian sel ini mekanisme. Secara bersama sama, hasil ini menunjukkan bahwa Memantine memicu PCD dengan karakteristik apoptosis.Mengingat bahwa Memantine mengubah epimastigote fisiologi, kami tertarik untuk menentukan apakah selain PCD, obat ini juga dapat mengganggu diferensiasi menjadi trypomastigotes metacyclic(metacyclogenesis).Proses ini biasanya terjadi di midgut terminal dari vektor serangga. Perlu dicatat bahwa diferensiasi memerlukan kondisi stres metabolik awal dan terutama penuh semangat didukung oleh asam amino hadir dalam reduviid urin dan feses, seperti proline, aspartat dan glutamat [31]. Asam amino ini memungkinkan parasit untuk membangun kembali intraseluler yang Tingkat ATP diperlukan untuk memberi energi metacyclogenesis [32]. Karena Memantine mengurangi tingkat ATP parasit, kami mengusulkan bahwa penghambatan metacyclogenesis terjadi sebagai akibat dari ATP rendah tingkat. Untuk mengevaluasi Memantine sebagai trypanocidal menarik untuk mengembangkan pengobatan baru terhadap infeksi T. cruzi, efeknya seluruh siklus hidup parasit dalam sel mamalia adalah dievaluasi. Memantine mempengaruhi infektivitas trypomastigotev bentuk, yang mengakibatkan berkurangnya jumlah trypomastigotes bursted dari sel inang yang terinfeksi. Selain itu, tahap amastigote terbukti menjadi tahap yang paling sensitif di antara mereka menginfeksi sel mamalia. Hal ini sangat menarik karena amastigotes adalah bentuk yang terlibat dalam pemeliharaan fase kronis infeksi. Secara bersama-sama, hasil ini menunjukkan prospek yang menjanjikan untuk penggunaan baru untuk Memantine, obat yang sudah disetujui untuk digunakan di manusia, sebagai anti-T. obat cruzi. Studi praklinis yang dilakukan untuk mendukung usulan ini.

gambar 2. Analisis paparan phosphatidylserine ekstraseluler. Panel A: parasit yang tidak diobati. Panel B: diperlakukan parasit. Parasit yang diobati dengan Memantine (172,6 mM) atau tidak dirawat (control) selama 4 hari. Setelah periode ini, parasit diberi label dengan propidium iodida (PI) dan annexin V dan dianalisis oleh aliran cytometry. Panel C: analisis kuantitatif tiga percobaan independen (uji T-test).

Gambar 3. Kuantifikasi H2O2, Ca2 + dan ATP tingkat di T. cruzi. Panel A: tingkat H2O2, parasit diobati dengan Memantine (172,6 mM) atau tidak diperlakukan (kontrol) selama 24 jam. Setelah periode ini, parasit (1,06107) diinkubasi dengan 25 mM amplex merah, dan 0,05 U mL21 lobak peroksidase dan dianalisis pada fluorometer sebuah (lex 563 nm dan lem 587 nm). Panel B: tingkat Ca2 +, parasit dirawat selama 4 hari dan diinkubasi dengan Fluo-04:00 (5 mM) selama 1 jam pada 28uC, dicuci dua kali dalam HEPES-glukosa dan dievaluasi fluorometer sebuah (lex 490 nm dan lem 518 nm). Panel C: AT

P tingkat, parasit dirawat selama 30 jam, dan tingkat ATP dinilai menggunakan kit uji bioluminescent (Sigma-Aldrich) dan dianalisis pada luminometer (l 570 nm). Uji T: *: p, 0,05; **: P, 0,01; ***: P, 0,001.

Gambar 4. Trypanosoma cruzi bentuk epimastigote, 4 hari pertumbuhan. Panel A dan B: parasit yang tidak diobati. Panel C dan D, parasit diobati dengan Memantine (172,6 mM).

Gambar 5. Pengaruh Memantine pada metacyclogenesis. Epimastigote bentuk ditumbuhkan dalam medium LIT, dipindahkan ke medium Grace, dan diperlakukan dengan Memantine (172,6 mM) atau tidak diobati. Pada hari ke-9, jumlah bentuk metacyclic ditentukan dalam Neubauer chamber (uji T : ***: p, 0,001).

Gambar 6. Pengaruh Memantine pada siklus intraseluler Trypanosoma cruzi. Panel A: viabilitas sel CHO-K1 diobati dengan berbagai konsentrasi Memantine (kisaran 50 mM untuk 1 mM). Viabilitas dinilai dengan MTT assay. Panel B: efek pada infektivitas trypomastigotes diobati hanya selama periode infeksi (50-400 mM). Panel C: efek pengobatan setelah invasi parasit dalam sel CHO-K1 (5-300 mM). Panel D: Pengaruh Memantine pada tahap intraseluler. Sel dirawat di berbagai tahap dengan 31 mM Memantine (nilai IC50): T (trypomastigote invasi sel), A (amastigote) dan IE tahap (epimastigote seperti intraseluler). Dalam semua percobaan, kami mengevaluasi ledakan trypomastigotes pada postinfection hari kelima dengan menghitung parasit dalam ruang Neubauer. Uji Tukey: *: p, 0,05; **: P, 0,01; ***: P, 0,001.