BAB 1

TINJAUAN PUSTAKA

1.1 Pendahuluan Interferon (IFN)

IFN ditemukan pertama kali pada tahun 1957 oleh Isaacs dan Lindeman yang melakukan

pengamatan terhadap sel ayam yang diinkubasi dengan virus influenza inaktif dimana

ternyata dihasilkan suatu faktor yang dapat melindungi sel dari infeksi virus lain.

Fenomena ini dinamakan fenomena interferensi dan subtansi aktif yang dihasilkan

kemudian dinamakan IFN.

IFN adalah kelompok sitokin yang memiliki aktivitas antivirus, imunomodulasi, dan

antiproliferatif. Protein ini disintesis oleh sel sebagai respons terhadap berbagai

penginduksi seperti partikel virus, antigen, asam nukleat asing,dan sebagainya. IFN

penting digunakan sebagai terapi untuk pengobatan berbagai jenis tumor, kanker dan

penyakit kelainan darah yang mematikan. IFN menghambat replikasi virus tidak hanya

pada sel yang memproduksi IFN, tetapi juga terhadap sel di sekelilingnya (Jonasch and

Haluska, 2001).

1.1.1 Klasifikasi dan Karakteristik IFN

IFN digolongkan terutama berdasarkan aktivitas biologi, jenis reseptor, komponen

penginduksi dan urutan asam-asam amino. IFN dapat diklasifikasikan menjadi dua

kelompok utama berdasarkan kemampuan masing-masing jenis IFN untuk berikatan

dengan tipe reseptor tertentu yang terdapat di permukaan membran sel. IFN tipe I berikatan

dengan reseptor IFN tipe I, sedangkan IFN tipe II berikatan dengan reseptor IFN tipe II.

IFN tipe I meliputi IFN, , , dan sedangkan IFN adalah satu-satunya IFN tipe II.

4

IFN tipe I termasuk keluarga sitokin monomer dengan kemiripan asam amino 30-80%

dengan struktur tiga dimensi 5-alpha heliks (Jonasch and Haluska, 2001). Untuk IFN tipe I,

ada 2 sub unit reseptor yang sudah dikenali, yaitu IFNAR-1 dan IFNAR-2 yang terikat

dengan molekul JAK (Janus Activated Kinase), Tyk2 (tyrosin kinase2) dan JAK1,

sedangkan untuk IFN tipe II ada dua sub unit reseptor yang sudah dikenali, yaitu IFNGR-1

dan IFNGR-2. Sampai saat ini baru ditemukan satu jenis dari IFNAR1 yang telah berhasil

diidentifikasi. Sebaliknya, untuk IFNAR2 telah ditemukan 3 jenis, yaitu IFNAR2c dan 2

isoform pendek IFNAR2b dan IFNAR2a. IFNAR2c terlibat di dalam proses transduksi

sinyal dan pengikatan ligan. IFNAR2a dan IFNAR2b merupakan inhibitor kompetitif

IFN untuk berikatan dengan IFNAR2c.

IFN tipe I dihasilkan oleh hampir semua sel, terutama leukosit dan fibroblas untuk IFN

dan . Produksi IFN dan oleh sel diinduksi secara langsung oleh partikel virus, asam

nukleat asing, dan polipeptida. IFN yang dihasilkan kemudian bersirkulasi di dalam tubuh

dan menyebabkan sel-sel sehat mengekspresikan mekanisme antivirus yang kemudian

akan menghambat penyebaran dan replikasi virus. IFN dihasilkan terutama oleh sel T

yang telah tersensitisasi dan sel natural killer (NK). Aktivitas antivirus IFN lebih rendah

daripada IFN dan , tetapi IFN memiliki aktivitas imunomodulasi yang lebih besar,

meliputi aktivasi makrofag, ekspresi MHC kelas II, dan memediasi pembentukan respon

inflamasi lokal (Jonasch and Haluska, 2000).

Gen pengkode IFN dan terletak pada kromosom manusia nomor 9, tidak mengandung

intron dan mengkode rantai polipetida yang mengandung sekitar 165-166 residu asam

amino (kekurangan aspargin yang dapat berikatan dengan oligosakarida melalui

pembentukan ikatan N-glikosida)(Ferencik, 1993). Hal ini menyebabkan sebagian besar

dari IFN tidak memiliki rantai samping karbohidrat, walaupun beberapa adalah

5

glikoprotein dengan derajat glikosilasi berbeda. IFN yang mengalami glikosilasi adalah

IFN14c dan IFN2b. IFN14c mengalami N-glikosilasi pada asam amino aspargin posisi

ke 72, sedangkan IFN2b mengalami O-glikosilasi pada asam amino treonin posisi ke 106

(Nyman et al., 1998).

1.1.2 Produksi IFN Tipe I (/) di dalam Tubuh

Ekspresi gen pengkode IFN tipe I diinduksi terutama karena adanya virus. Promotor pada

gen pengkode IFN tipe I memiliki sisi pengikatan terhadap beberapa faktor transkripsi

seperti kelompok faktor peregulasi IFN (IRF-3 dan 7) serta faktor transkripsi yang umum

seperti NF-B dan AP1 (Gambar 1.1).

Gambar 1.1 Produksi IFN oleh induksi virus (Weber, Kochs, and Haller, 2004)

IRF-3 dan NF-B pada kondisi normal berada di dalam sitoplasma dalam bentuk tidak

aktif dan masuk ke dalam nukleus dimana mereka membentuk kompleks multikomponen

pada keadaan teraktivasi. IRF-3 harus mengalami fosforilasi terlebih dahulu untuk menjadi

bentuk aktif. IRF-3 difosforilasi oleh kinase jenis IKK dan TBK. IRF-3 yang sudah

mengalami fosforilasi kemudian masuk ke dalam nukleus, berikatan dengan koaktivator

transkripsi p300dan protein pengikat CREB (CBP) yang kemudian akan menginisiasi

sintesis mRNA IFN (Weber, Kochs, and Haller, 2004). Hasil akhir dari proses ini adalah

terbentuknya IFN.

6

1.1.3 Mekanisme Kerja IFN

IFN yang dihasilkan oleh sel terinfeksi berikatan dengan reseptor IFN tipe I pada

permukaan membran sel (Gambar 1.2). Proses pengikatan ini menyebabkan terjadinya

heterodimer dan perubahan konformasi sub unit IFNAR serta aktivasinya jalur JAK-STAT.

Aktivasi jalur JAK-STAT menyebabkan fosforilasi sub unit IFNAR1 dan IFNAR2 oleh

JAK1 dan kinase tirosin 2 (Tyk2). IFNAR1 yang terfosforilasi memiliki sisi pengikatan

untuk domain homologi 2 Src-mengandung transduser sinyal dan aktivator faktor

transkripsi (STAT2)- yang kemudian terfosforilasi oleh JAK1 atau Tyk2 pada residu tirosin

690 (Gao, Hong, and Radaeva, 2004).

STAT yang lain seperti STAT1, STAT3, dan STAT 5 mengalami proses aktivasi yang sama

dengan STAT2. STAT1 dan STAT2 yang teraktivasi akan dilepaskan kembali ke dalam

sitosol dimana mereka membentuk heterodimer dan bergabung dengan protein regulator

IFN faktor9 (IRF9)/p48 untuk membentuk komples faktor transkripsi yang aktif yang

dikenal dengan sebutan faktor gen terstimulasi IFN3 (ISGF3). Kompleks ISGF3

heterotrimer ini kemudian mengalami translokasi ke dalam nukleus dan berikatan dengan

respon elemen terstimulasi IFN (ISRE) pada daerah promotor dari gen terstimulasi IFN

(ISGs) dan selanjutnya akan menginduksi proses transkripsi (Gao, Hong, and Radaeva,

2004).

Gambar 1.2 Mekanisme kerja IFN/ (Weber, Kochs, and Haller, 2004)

7

IFN tipe I dapat mengaktivasi ekspresi lebih dari 300 ISG yang memiliki aktivitas antivirus,

antiproliperatif, dan imunomodulator. Tiga jenis protein antivirus yang paling penting yang

dihasilkan adalah kelompok protein MxGTPase, 25-oligoadenilat sintetase

[2-5OAS]/RnaseL dan protein kinase R (PKR) (Weber, Kochs, and Haller, 2004). Aktivitas

antivirus IFN ditunjukkan melalui proses inhibisi penetrasi/ pelepasan virus, inhibisi

translasi dan sintesis protein serta inhibisi pematangan virus.

Kelompok protein MxGTPase dalam kondisi normal tidak terdapat di dalam tubuh, tetapi

hanya dihasilkan jika jalur JAK-STAT teraktivasi oleh IFN/. Protein 2-5OAS dan PKR

secara alami terdapat di dalam tubuh dalam bentuk tidak aktif akan diaktivasi oleh

keberadaan RNA untai ganda. Kelompok protein Mx bekerja dengan cara menginhibisi

proses multiplikasi beberapa jenis virus RNA. Mekanisme kerja spesifik kelompok protein

Mx ini belum diketahui dengan pasti. 2-5OAS bekerja dengan cara mengkatalisis sintesis

25-oligoadenilat yang mengaktivasi endoribonuklease selular (RNaseL). RnaseL

menyebabkan terjadinya degradasi dari RNA virus. Protein kinase R (PKR) adalah kinase

serin-treonin yang secara selektif memfosforilasi dan menginaktivasi protein yang terlibat

dalam sintesis protein yaitu eIF-2 (faktor inisiasi eukariot-2) (Jonasch and Haluska, 2000).

Protein-protein lain yang memiliki potensi penting sebagai antivirus adalah ISG20, P56,

dan ADAR1. P56 berikatan dengan eIF3e (sub unit dari eIF3) dan berfungsi sebagai

penghambat inisiasi translasi sehingga translasi virus RNA menurun. ADAR1

mengkatalisis reaksi deaminasi dari adenosin pada RNA rantai ganda target dan

menyebabkan pembentukan struktur sekunder yang tidak stabil. Protein PML terlibat di

dalam proses apoptosis dan penghambatan transkripsi. IFN juga mengaktivasi

fosfodiesterase yang memotong tRNA sehingga tidak dapat terjadi pemanjangan peptida

(Jonasch and Haluska, 2000).

8

1.2 Peranan IFN dalam Pengobatan Hepatitis B dan C

IFN digunakan untuk pengobatan terhadap hepatitis B dan C kronis. Hepatitis B dan C

adalah virus yang spesifik menginfeksi hepatosit. Ada sekitar 4 juta orang di Amerika dan

170 juta orang di seluruh dunia yang menderita infeksi kronis Hepatitis B dan C . Hepatitis

B dan C kronis dapat mengakibatkan sirosis hati yang kemudian berkembang menjadi

kanker hati (hepatocellular carcinoma). Hepatitis C kronis ini sangat penting karena

20-50% dari penderita yang terinfeksi akan berlanjut ke sirosis dan kanker hati (Gao, Hong,

and Radaeva, 2004).

1.2.1 Mekanisme Kerja IFN pada Penderita Hepatitis B dan C

IFN yang digunakan untuk pengobatan hepatitis B dan C adalah IFN dari tipe I (). Secara

umum mekanisme kerja IFN di hati pada penderita hepatitis adalah sama dengan

mekanisme kerja umum IFN yang telah dibahas pada bagian sebelumnya. Sel hepatosit

manusia banyak mengandung IFNAR1 dan IFNAR2c. IFNAR1 dan IFNAR2c penting

untuk proses transduksi sinyal yang kemudian melalui aktivasi jalur JAK-STAT akan

menghasilkan berbagai respon antivirus. STAT-STAT utama yang teraktivasi di sel

hepatosit manusia adalah STAT1, STAT2, STAT3, dan STAT5. Protein-protein antivirus

utama yang penting sebagai antivirus terhadap virus hepatitis adalah protein Mx, 2-5OAS,

dan PKR (Gao, Hong, and Radaeva, 2004). IFN juga menginduksi sintesis protein oleh

sel hati yang memiliki aktivitas antivirus atau imunoregulator. Protein-protein yang

dihasilkan adalah imunoproteosom, protein mirip ubiquitin, chemokines, dan protein

pengikat guanosin 5trifosfat. IFN juga menstimulasi sistem imun melalui induksi gen

yang terlibat di dalam aktivasi sel T dan pemrosesan antigen (Gao, Hong, and Radaeva,

2004).

9

1.2.2 Mekanisme Virus Hepatitis dalam Melawan Sistem IFN

Virus dapat mengembangkan berbagai macam mekanisme untuk melawan aktivitas

antivirus yang dimediasi dan diaktivasi oleh keberadaan IFN. Virus dapat secara langsung

menghambat sintesis IFN, mengikat dan menginaktivasi molekul IFN, menghambat jalur

transduksi sinyal, atau mengganggu aktivitas dari protein antivirus. Virus Hepatitis C

(HCV) dapat menghasilkan protease NS3/4A yang mencegah fosforilasi dari IRF-3

sehingga sintesis IFN terhambat. Selain itu, HCV dapat mengganggu jalur transduksi

sinyal untuk mencegah expresi ISG sehingga produksi protein antivirus terhambat. Jalur

transduksi sinyal diganggu dengan cara menginaktivasi protein STAT atau menginduksi

degradasi protein STAT (Weber, Kochs, and Haller, 2004).

Aktivitas antivirus sistem IFN juga dapat dihambat secara langsung dengan menghambat

aktivitas protein antivirus (PKR, Mx, dan 2-5OAS). Virus hepatitis C menghasilkan protein

E2 yang berfungsi sebagai pseudosubstrat dari PKR. Berikatannya protein E2 dengan PKR

menyebabkan inaktivasi PKR (Weber, Kochs, and Haller, 2004). Berbagai mekanisme

yang dikembangkan virus menyebabkan pengobatan hepatitis dengan IFN menjadi tidak

efektif.

1.2.3 Pengobatan Hepatitis dengan IFN

IFN yang digunakan untuk pengobatan hepatitis B dan C adalah IFN2a dan 2b. IFN2a

digunakan untuk pengobatan hepatitis C, sedangkan IFN2b telah digunakan untuk terapi

pengobatan akibat infeksi hepatitis B maupun C. Keberhasilan terapi dinyatakan dengan

tidak terdeteksinya RNA HCV dan DNA virus hepatitis B (HBV) pada akhir follow up.

10

Pemberian IFN melalui rute oral tidak memungkinkan, karena IFN yang merupakan

protein akan mengalami degradasi oleh enzim proteolitik yang ada di saluran pencernaan.

Injeksi secara subkutan maupun intramuskular dari IFN menunjukkan tingkat absorpsi

yang tinggi, yaitu lebih besar dari 80%. IFN memiliki waktu paruh eliminasi yang

beragam dari 4-16 jam, dan 1-2 jam untuk IFN.

Terapi menggunakan IFN memiliki banyak efek samping. Ada 4 jenis kelompok efek

samping yang utama, yaitu umum, neuropsikiatrik, hematologik, dan hepatik. Tingkat

keparahan efek samping yang timbul bergantung secara langsung terhadap dosis dan durasi

terapi IFN. Efek samping yang umum meliputi kelelahan, anoreksia, penurunan bobot

badan, demam, dan sakit kepala. Efek samping jenis neuropsikiatrik meliputi depresi

secara emosional, vertigo dan lain-lain.

1.2.4 IFN2 rekombinan

IFN2 rekombinan telah disetujui penggunaannya oleh Food and Drug Administration

(FDA) untuk pengobatan akibat infeksi kronis oleh virus hepatitis B dan C. IFN2a dan

2b memiliki tingkat kesamaan homologi yang tinggi, dan hanya berbeda satu asam amino

pada posisi 23. IFN2b diberikan dengan cara injeksi subkutan dengan dosis 5 juta unit per

hari atau 10 juta unit per tiga hari selama 16 minggu untuk infeksi karena hepatitis B.

IFN2b secara umum diproduksi dengan teknologi rekombinan, dimana cDNA inteferon

2b yang disintesis dari mRNA IFN2b hasil isolasi dari sel leukosit manusia dikloning ke

dalam vektor yang sesuai dan ditransformasikan ke dalam sel E. coli. Glikosilasi pada

asam amino treonin posisi ke 106 dari IFN2b tidak berpengaruh terhadap aktivitas biologi,

tetapi ada kemungkinan berpengaruh terhadap farmakokinetik dan stabilitas protein

(Nyman et al., 1998). Oleh karena itu, IFN2b dapat tetap diproduksi di dalam sel E. coli

11

dalam bentuk yang tidak terglikosilasi. IFN2b rekombinan yang diproduksi menggunakan

sel E. coli memiliki kelemahan, yaitu waktu paruh eliminasinya pendek sehingga

konsentrasi obat dalam darah menjadi rendah.

Sampai saat ini telah dilakukan berbagai penelitian untuk meningkatkan profil

farmakokinetik dan farmakodinamik IFN2b, yang terutama adalah dengan memodifikasi

secara kimia IFN2b dengan PEG bobot molekul 12 kDa. Penggunaan IFN2b terpergilasi

mengurangi frekuensi pemberian dari 3 kali seminggu menjadi hanya 1 kali seminggu

(Wang et al., 2002).

1.3 Teknologi Sintesis Gen untuk Mensintesis Daerah Pengkode IFN2b

Saat ini, teknologi sintesis gen banyak digunakan untuk menggantikan gen yang diisolasi

secara langsung dari sel. Teknologi sintesis gen berkembang pesat sejak ditemukan metode

sintesis gen berbasis PCR sederhana, yaitu metode recursive PCR (Prodromou and Pearl,

1992). Metode recursive PCR adalah metode PCR biasa, dimana cetakan DNA diganti

dengan beberapa pasang oligonukleotida sintetis yang memiliki daerah tumpang tindih dan

memiliki urutan nukleotida yang sama dengan gen yang akan disintesis. Sintesis oleh DNA

polimerase menjadi gen yang diinginkan terjadi pada oligonukleotida yang saling

bertumpang tindih (Gambar 1.3). Perkembangan terbaru dari teknologi sintesis gen adalah

metode sintesis dua arah Thermodynamically Balanced Inside-out (TBIO).

12

Gambar 1.3 Metode recursive PCR (Prodromou and Pearl, 1992)

Metode TBIO sama dengan metode recursive PCR, yaitu tidak menggunakan cetakan

DNA, tetapi memiliki perbedaan dalam hal arah sintesis (Gao et al., 2004). Sintesis gen

pada metode TBIO berlangsung dari arah dalam menuju ke luar dan terjadi secara bertahap,

dimana hanya oligonukleotida hasil polimerisasi dengan urutan benar yang akan menempel

dengan pasangan oligonukleotida selanjutnya sampai terbentuk gen yang diharapkan.

Oligonukleotida yang digunakan memiliki gradien konsentrasi yang berbeda, dimana

konsentrasi terendah adalah pasangan oligonukleotida yang terdalam dan konsentrasi

tertinggi adalah pasangan oligonukleotida terluar.

Gambar 1.4 Metode sintesis dua arah TBIO

13

Keuntungan metode sintesis dua arah TBIO terletak pada spesifisitas produk akhir yang

dihasilkan lebih spesifik dibandingkan dengan produk akhir yang dihasilkan dengan

menggunakan metode recursive PCR. Daerah pengkode IFN2b telah disintesis

sebelumnya menggunakan metode sintesis gen yang berbeda baik dengan metode recursive

PCR maupun dengan metode sintesis dua arah TBIO, dan merupakan teknik yang tidak

efektif dan efisien dari segi ekonomis maupun pengerjaan di laboratorium (Neves et al.,

2004).