Teknik isolasi mikroba yaitu inokulasi(penanaman) yang merupakan suatu teknik pemindahan suatu biakan tertentu dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tujuan untuk mendapatkan suatu biakan yang murni atau kultur murni yaitu tanpa adanya kontaminasi dari mikroba yang lain yang tidak diiinginkan . Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainyang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya. Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan secara individu karena terlalu kecil dan tidak tetap tinggal di tempatnya. Akan tetapi bila sel-sel itu dipisahkan dengan cara pengenceran, kemudian ditumbuhkan dalam media padat dan dibiarkan membentuk koloni, maka sel-sel tersebut selanjutnya dapat diisolasi dalam tabung-tabung reaksi atau cawan petri-cawan petri yang terpisah.Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikrobayaitu antara lain :1. Sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi2. Tempat hidup atau asal mikroba tersebut3. Medium pertumbuhan yang sesuai4. Cara menginokulasi mikroba;e) cara menginkubasi mikroba5. Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa kultur murni dansesuai dengan yang dimaksud6. Cara memelihara agar mikrobia yang telah diisolasi tetap merupakan kulturmurni.

Metode IsolasiMenurut Hadioetomo (1993), ada dua metode yang dilakukan untuk memperoleh biakan murni yaitu :1.Metode cawan goresMetode ini mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan waktu. Metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan.2.Metode cawan tuangCara lain untuk memperoleh koloni murni daripopulasi campuran mikroorganisme adalah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan (50oC) yang kemudian dicawankan. Karena konsentrasi sel-sel mikroba di dalam spesimen pada umunya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang-kurangnya satu di antara cawan tersebut mengandung koloni terpisah di atas permukaan ataupun di dalam agar.Metode ini memboroskan bahan dan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang tinggi.3. Teknik Sebar (spread plate)Teknik isolasi dan mikroba dengan cara menyebarkan mikroba pada permukaan media yang akan digunakan (Trianda, 2011). Cara taburan atau tuang Metode cawan sebar (spread plate) Teknik spread plate (lempeng sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau mengapuskannya di atas media agar yang telah memadat. Bedanya dengan pour plate adalah, pencampuran stok kultur bakteri dilakukan setelah media agar memadat sedangkan pour plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan media agar.

4.Teknik Pengenceran (dilution method)Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam spesies diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian di ambil kira- kira 1 mL untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam mdium tersebut, akan tetapi mungkin juga kita hanya akan memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika kita belum yakin, Bahwa koloni tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang murni, maka kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel (Trianda, 2011)5. Teknik MicromanipulatorMengambil satu bakteri dengan mikropipet yang ditempatkan dalam mikro manupulator, kemudian ditempatkan dalam mikromanupulator. Kemudian ditempatkan dalam medium encer untuk dibiakkan ( Trianda, 2011).Menurut Admin (2008), terdapat berbagai cara untuk mengisolasi mikroba yakni :1)Isolasi pada cawanPrinsip pada metode isolasi pada cawan adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari satu sel tunggal. Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada cawan, yaitu :metode gaores kuadran dan metode agar cawan tuang. Metode gores kuadran , bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme, dimana setiap koloni berasal dari setiap sel. Metoe agar tuang berbeda dengan metoe gores kuadran, cawan tunag menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan yang kemudian dicawankan, pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung koloni-koloni yang terpisah di atas permukaan atau di dalam cawan.2)Isolasi pada medium cairMetode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengencaran dengan beberapa serial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar .3)Isolasi sel tunggalMetode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besaryang tiak dapat diisolasi dengan metode agar cawan atau medium cair, sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan pembesaran sekitar 100 X, kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun micromanipulator yang dilakukan secara aseptik.

Menurut Nuniek, 2002, isolasi mikroba dapat dilakukan dengan dua cara yaitu cara penggoresan dan cara penaburan.a. Isolasi mikroba dengan cara penggoresan (streak plate),Tujuan utama dari penggoresan ini adalah untuk menghasilkan koloni-koloni bakteri yang terpisah dengan baik dari suspensi sel yang pekat. Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tapi memerlukan ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Cara ini dilakukan dengan membagi cawan petri menjadi 3-4 bagian. Ose steril yang telah disiapkan dilekatkan pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horizontal di satu sisi cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua. Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores.Ada beberapa teknik goresan, antara lain :1. Goresan T2. Goresan kuadran3. Goresan radian4. Goresan sinambung (Nuniek, 2001).b. Isolasi mikroba dengan cara penaburanCara penaburan ( pour plate) merupakan cara yang kedua di samping penggoresan untuk memperoleh biakan murni dari biakan campuran mikroba. Cara ini berbeda dari cara penggoresan dimana media agar diinokulasi dalam keadaan tetap cair yaitu pada suhu 450C, dan demikian pula koloni-koloni akan berkembang di seluruh media, tidak hanya pada permukaan. Untuk beberapa tujuan hal ini menguntungkan, contohnya dalam mempelajari pertumbuhan koloni streptococcal pada sel-sel darah merah. Supaya koloni yang tumbuh dalam cawan tidak terlalu banyak ataupun sedikit maka contoh diencerkan hingga beberapa kali pengenceran dan ditaburkan pada beberapa cawan (Nuniek, 2001). Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak begitu banyak mengandung oksigen.

Khusus ntuk isolasi khamir dan jamur dikenal beberapa teknik inokulasi yaitu :1. Teknik pengenceran2. Teknik Hansen3. Teknik Lindner4. Mikromanipulator

Gambar Teknik Isolasi Dan Penapisan Mikroorganisme Untuk Produksi Bioaktif

gambar isolasi mikroorganisme

Gambar teknik gores kuadran

Gambar teknik gores T