PERCOBAAN IIIISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI Manihot utilissima FOLIUMA. Tujuan PraktikumMemahami dan melakukan isolasi flavonoid dari daun ketela (Manihotutilissima).B. PendahuluanSenyawa flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang terbesar yang ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu dan biru serta sebagai zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan (Lenny, 2006). Infusa adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur 90C selama 15 menit. Infusa adalah proses penyarian yang umumnya digunakan untuk menyari zat kandungan aktif yang larut dalam air dari bahanbahan nabati.Penyarian dengan cara ini menghasilkan sari yang tidak stabil dan mudah tercemar oleh kuman dan kapang. Oleh sebab itu sari yang diperoleh dengan cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam. Cara ini sangat sederhana dan sering digunakan oleh perusahaan obat tradisional. Dengan beberapa modifikasi cara ini sering digunakan unuk membuat ekstrak. Dekokta adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur 90C selama 30 menit. Penguapan ekstrak larutan dilakukan dengan penguap pengurangan tekanan, yaitu rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak yang kental (Harborne, 1987).C. Bahan dan AlatBahan yang digunakan dalam praktikum adalah aquadest, eter, asam klorida (HCl 2 N), dan natrium sulfat anhidrat. Sedangkan alat yang digunakan dalam praktikum adalah panci infusa, corong besar, erlenmeyer (50 ml dan 250 ml), tabung reaksi, corong pisah (250 ml), cawan porselen, flakon (3 buah).D. Cara Kerja50 gram serbuk bahanDimasukkan ke dalam panci infusa 1 (atas),Ditambahkan dengan 500 ml aquadest,Diletakkan diatas panci infusa 2 (bawah) yang telahberisi air biasa, tunggu sampai mendidih dan suhu dipanci atas mencapai 90oC, dibiarkan selama 15 menit(untuk mendapatkan infusa),Disaring melalui corong buchner sehingga diperolehfiltrat yang jernih,Dipindahkan ke dalam erlenmeyer 250 ml,Disimpan dalam almari es hingga terbentuk kristalamorf putih kekuningan ( 1 minggu),Filtrat + kristal amorfDituang sebagian besar filtrat pada erlenmeyer ketempat lain dengan hati-hati supaya kristal tidak ikuttertuang,Disaring dengan kertas saring yang telah ditara hinggamemperoleh kristal, jika masih ada kristal yangmenempel pada dasar erlenmeyer maka bilang denganair es dan saring,Dikeringkan kertas saring bersama endapan pada suhu50oC selama 30 menit,Ditimbang untuk memperoleh rendemen,Diambil sedikit padatan dengan ujung spatel kecil,Dilarutkan dalam 2 ml campuran metanol-air samabanyak dalam flakon (sari I),Diambil sisa padatannya, masukkan ke dalam tabungreaksi dan ditambahkan dengan 10 ml HCl 2 N,Ditaruh corong kecil berisi kapas di atas tabung untukmengurangi penguapanDilakukan refluks pada penangas air mendidih selama1 jam,Didinginkan dan dimasukkan ke dalam corong pisahyang berisi eter sebanyak 10 ml,Dikocok dan tunggu hingga terbentuk dua lapisan,Dipisahkan bagian air asam dan organik eter,Dikocok kembali lapisan air asamnya dengan 10 mldietil eter yang baru dalam corong pisah,Dipisahkan bagian air asam dan organik eter, dandicampurkan dengan yang pertama,Disaring sari eternya dengan kertas saring yang berisi1 gram natrium sulfat anhidrat ke dalam cawanporselin,Diuapkan eternya tanpa pemanasan dan larutkan residuyang diperoleh dengan 2 ml metanol dalam flakon(Sari II).Diuapkan lapisan air asam hasil hidrolisis dengancawan porselin di atas penangas air dengan hembusanangin sehingga cairan tinggal kira-kira 1ml dantuangkan ke dalam flakon (Sari III)Sari I, Sari II, Sari IIIE. Hasil dan PembahasanE.1. Hasil PengamatanNo. Perlakuan Hasil Pengamatan1. 50 gram serbuk bahan dimasukkan kedalam panci infusa 1 (atas),2. Kemudian ditambahkan dengan 500ml aquadest,3. Kemudian diletakkan diatas panciinfusa 2 (bawah) yang telah berisi airbiasa, tunggu sampai mendidih dansuhu di panci atas mencapai 90oC,dibiarkan selama 15 menit (untukmendapatkan infusa),4. Kemudian disaring melalui corongbuchner sehingga diperoleh filtratyang jernih,Diperoleh filtrat jernih berwarnacoklat5. Kemudian dipindahkan ke dalamerlenmeyer 250 ml,6. Kemudian disimpan dalam almari eshingga terbentuk kristal amorf putihkekuningan ( 1 minggu),Terbentuk kristal amorf putihkekuningan pada dasar erlenmeyer7. Kemudian dituang sebagian besarfiltrat pada erlenmeyer ke tempat laindengan hati-hati supaya kristal tidakikut tertuang,Kristal tetap pada dasar erlenmeyer8. Kemudian disaring dengan kertassaring yang telah ditara hinggamemperoleh kristal, jika masih adakristal yang menempel pada dasarerlenmeyer maka bilang dengan air esdan saring,Kertas saring = 0,526 gram9. Dikeringkan kertas saring bersamaendapan pada suhu 50oC selama 30menit,10. Ditimbang untuk memperolehrendemen,n m no o n io o n1Kertas saring + bahan = 0,6522gramBahan = 0,1262 gramRendemen =(0,1262/50)x100%=0,2524%11. Diambil sedikit padatan dengan ujungspatel kecil,12. Dilarutkan dalam 2 ml campuran Diperoleh sari Imetanol-air sama banyak dalamflakon (sari I),13. Diambil sisa padatannya, masukkanke dalam tabung reaksi danditambahkan dengan 10 ml HCl 2 N,14. Ditaruh corong kecil berisi kapas diatas tabung untuk mengurangipenguapan15. Dilakukan refluks pada penangas airmendidih selama 1 jam,16. Didinginkan dan dimasukkan kedalam corong pisah yang berisi etersebanyak 10 ml,17. Dikocok dan tunggu hingga terbentukdua lapisan,18. Dipisahkan bagian air asam danorganik eter,Warna bagian air = jernihWarna bagian organik eter =kuning jernih19. Dikocok kembali lapisan air asamnyadengan 10 ml dietil eter yang barudalam corong pisah,20. Dipisahkan bagian air asam danorganik eter, dan dicampurkan denganyang pertama,Warna bagian air = jernihWarna bagian organik eter =kuning jernih21. Disaring sari eternya dengan kertassaring yang berisi 1 gram natriumsulfat anhidrat ke dalam cawanporselin,22. Diuapkan eternya tanpa pemanasandan larutkan residu yang diperolehdengan 2 ml metanol dalam flakon(Sari II).Diperoleh sari II23. Diuapkan lapisan air asam hasilhidrolisis dengan cawan porselin diatas penangas air dengan hembusanangin sehingga cairan tinggal kira-kira1ml dan tuangkan ke dalam flakon(Sari III)Diperoleh sari IIIOO1235 46789101'2'3'4'5'6' A(8a)(4a)CBE. 2. PembahasanPada praktikum ini bertujuan untuk dapat memahami dan melakukan isolasi flavonoid dari daun ketela (Manihot utilissima). Senyawa flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang terbesar yang ditemukan di alam. Senyawasenyawa ini merupakan zat warna merah, ungu dan biru serta sebagai zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon, dimana dua cincin benzene (C6) terikat pada suatu rantai propane (C3) sehingga bentuk susunan C6-C3-C6 (Lenny, 2006).Gambar 1. Struktur Senyawa Flavonoid (Lenny, 2006).Sebagian besar senyawa flavonoida alam ditemukan dalam bentuk glikosida, dimana unit flavonoid terikat pada suatu gula. Glikosida adalah kombinasi antara suatu gula dan suatu alcohol yang saling berikatan melalui ikatan glikosida. Pada prinsipnya, ikatan glikosida terbentuk apabila gugus hidroksil dari alcohol beradisi kepada gugus karbonil dari gula sama seperti adisi alcohol kepada aldehida yang dikatalisa oleh asam menghasilkan suatu asetal. Pada hidrolisa oleh asam, suatu glikosida terurai kembali atas komponen-komponennya menghasilkan gula dan alcohol yang sebanding dan alcohol yang dihasilkan disebut dengan aglikon. Residu gula dari glikosida flavonoida alam adalah glukosa, ramnosa, galaktosa dan gentibiosida. Flavonoida dapat ditemukan sebagai mono- , di- atau triglikosida dimana satu, dua atau tiga gugus hidroksil dalam molekul flavonoid terikat oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan sedikit larut dalam pelarut organic seperti eter, benzene, kloroform dan aseton. Senyawa-senyawa flavonoid yang umumnya bersifat antioksidan dan banyak yang telah digunakan sebagaisalah satu komponen bahan baku obat-obatan (Anonim, 2008).Pada percobaan kali ini digunakan simplisia dari daun ketela pohon (Manihot utilissima. Berikut taksonominya:Kingdom : PlantaeDivisi : SpermatophytaSub Divisi : AngiospermaeKelas : Dicotyledoneae atau biji berkeping duaOrdo : EuphorbialesFamili : EuphorbiaceaeGenus : ManihotSpesies : Manihot utilissima Pohl. ; Manihot esculenta Crantz sin.Ketela pohon atau singkong, dalam bahasa Inggris bernama cassava, adalah pohon tahunan tropika dan subtropika dari keluarga Euphorbiaceae. Umbinya dikenal sebagai makanan pokok penghasil karbohidrat dan daunnya sebagai sayuran. Di Indonesia sendiri ketela pohon menjadi makanan bahan pangan pokok setelah beras dan jagung. Manfaat daun ketela pohon sebagai bahan sayuran memiliki protein cukup tinggi dan Umbi singkong merupakan sumber energi yangkaya karbohidrat namun sangat miskin protein. Kayunya bisa digunakan sebagai pagar kebun atau di desa-desa sering digunakan sebagai kayu bakar untuk memasak. Dengan perkembangan teknologi ketela pohon dijadikan bahan dasar pada industri makanan dan bahan baku industri pakan. Selain itu digunakan pula pada industri obat-obatan. Ketela pohon sangat berkhasiat untuk menyembuhkan berbagai macam penyakit diantaranya yaitu reumatik, demam, sakit kepala, diare, cacingan, mata kabur; nafsu makan, luka bernanah, luka baru kena panas (Anonim, 2008).Monografi dari bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum adalah sebagaiberikut :1. EterEter mengandung tidak kurang dari 96,0% dan tidak lebih dari 98,0% C4H10O. Selebihnya terdiri dari etanol dan air. Eter sangat mudah menguap dan terbakar. Uapnya dapat meledak jika bercampur dengan udara dan nyala api.Gambar 2. Struktur Senyawa Eter.Pemerian, cairan mudah mengalir, mudah menguap, tidak berwarna, berbau khas. Teroksidasi perlahan-lahan oleh udara dan cahaya dengan membentuk peroksida, mendidih pada suhu lebih kurang 35oC. Kelarutannya, larut dalam air dapat bercampur dengan etanol, dengan benzena, dengan kloroform, dengan pelarut heksana, dengan minyak lemak dan minyak menguap (Anonim, 1995).2. AquadesAir suling adalah air murni yang diperoleh dengan penyulingan. Air murni adalah air yang dimurnikan yang diperoleh dengan destilasi, perlakuan menggunakan penukar ion, osmosis balik, atau proses lain yang sesuai. Dibuat dari air yang memenuhi persyaratan air minum. Tidak mengandung zat tambahan lain. Pemerian cairan jernih tidak berwarna, dan tidak berbau (Anonim, 1995).3. Metanol ( CH3OH )Gambar 3. Struktur Senyawa Metanol.Metanol, juga dikenal sebagai metil alkohol, wood alcohol atau spiritus, adalah senyawa kimia dengan rumus kimia CH3OH. Ia merupakan bentuk alkohol paling sederhana. Pada "keadaan atmosfer" ia berbentuk cairan yang ringan, mudah menguap, tidak berwarna, mudah terbakar, dan beracun dengan bau yang khas (berbau lebih ringan daripada etanol). Methanol digunakan sebagai bahan pendingin anti beku, pelarut, bahan bakar dan sebagai bahan additif bagi etanol industry (Anonim, 1995).4. Natrium sulfat anhidratNa2SO4 dengan berat molekul 142,04, murni pereaksi. Metanol P, metil alkohol CH3OH berat molekul 32,04, murni pereaksi (Anonim, 1995).5. Asam kloridaGambar 4. Struktur Asam Klorida.Nama Resmi : Acidum HydrochlorodiumNama Lain : Asam KloridaRumus Molekul : HClBerat Molekul : 36,46Pemerian : Cairan tidak berwarna, berasap, bau merangsang, jika diencerkan dengan 2 bagian air, asap dan bau hilang.Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat.K / P : Zat tambahan (Anonim, 1995)Pada praktikum isolasi glikosida flavanoid dari manihot utilissima folium hal pertama yang dilakukan adalah membuat cairan infusa dari simplisia mannihot utilistima, bahan yang digunakan 50 gram manihot utilissima di tambah dengan air hingga 500 ml ke dalam panci infusa. Panci infusa bagian bawah diisi dengan air biasa, hal ini dilakukan untuk menjaga suhu pemanasan tetap pada 90C karena yang menghantarkan panas adalah uap air bukan api secara langsung, kemudian setelah panic atas suhunya mencapai 90oC ditunggu selama 15 menit. kemudian cairan infus di saring menggunakan penyaring Buchner untuk mendapatkan bagian yang jernih dan ampasnya dibuang, penyaringan menggunakan penyaring Buchner agar filtrat yang dihasilkan baik dan benarbenar jernih, setelah itu kemudian dituang kedalam labu erlenmeyer dan disimpan dalam lemari es selama 1 minggu agar dapat terbentuk kristal (Harbone, 1987).Infusa adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur 90 C selama 15 menit. Infusa adalah proses penyarian yang umumnya digunakan untuk menyari zat kandungan aktif yang larut dalam air dari bahanbahan nabati. Penyarian dengan cara ini menghasilkan sari yang tidak stabil dan mudah tercemar oleh kuman dan kapang. Oleh sebab itu sari yang diperoleh dengan cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam. Cara ini sangat sederhana dan sering digunakan oleh perusahaan obat tradisional. Dengan beberapa modifikasi cara ini sering digunakan unuk membuat ekstrak. Infusa dibuat dengan cara : Membasahi bahan bakunya, biasanya dengan air 2 kali bobot bahan, untuk bunga empat kali bobot bahan, dan untuk karagen 10 kali bobot bahan. Bahan baku ditambah dengan air dan dipanaskan selama 15 menit pada suhu 900 980 C. Umumnya untuk 100 bagian sari diperlukan 10 bagian bahan. Hal ini disebabkan karena kandungan simplisia kelarutannya terbatas, misalnya kulit kina digunakan 6 bagian. disesuaikan dengan cara penggunaanya dalam pengobatan, misalnya daun kumis kucing, sekali minum infus 100 cc, karena itu di ambil 1/2 Bagian. Berlendir, misalnya karagen digunakan 1 bagian. Daya kerjanya keras, misalnya digitalis digunakan 1/2 bagian. Untuk memindahkan penyarian kadangkadang perlu ditambahkan bahan kimia misalnya Asam Sitrat untuk infus kina, Kalium atau Natrium karbonat untuk infuse kelembak. Penyarian dilakukan pada saat cairan masih panas, kecuali bahan yang mengandung bahan yang mudah menguap (Anonim, 2000). Dekokta adalahekstraksi dengan pelarut air pada temperatur 90C selama 30 menit. Penguapan ekstrak larutan dilakukan dengan penguap pengurangan tekanan, yaitu rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak yang kental (Harborne, 1987).Setelah 1 minggu filtrat disimpan dilemari es kemudian filtrate di tuang kedalam gelas beaker, tetapi yang dituang yang bagian atas atau yang jernihnya saja agar kristal pada cairan dibawah tidak ikut tertuang. Setelah dituang, kristal kemudian di saring menggunakan kertas saring yang sebelumnya telah ditimbang bobotnya. Bobot kertas saring tadi yaitu 0,526 gram. Setelah itu kertas saring bersama endapan kristal tadi di keringkan didalam oven pada suhu 50 C. Hal ini dilakukan agar mendapatkan kristal murni (rutin) yang bebas dari pelarut. Setelah kering, kertas saring dan kristal ditimbang lagi untuk memperoleh rendemannya, dan bobot kertas saring + kristal tadi yaitu 0,6522 gram. Kemudian kristal di ambil dengan spatel dan dilarutkan dengan campuran metanol-air 2 ml sama banyak. Digunakan campuran metanol-air untuk melarutkan kristal rutin ini yang bersifat polar dan fungsi metanol sendiri yaitu untuk melarutkan pengotor dari kristal rutin itu. Larutan tersebut kemudian dinamai dengan sari 1 yangmengandung rutin (Mulia, 1990).Kemudian sisa padatan diambil dan di masukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 10 ml HCL 2N. Penambahan ini berfungsi untuk menghidrolisis rutin menjadi bentuk glikon dan aglikonnya, karena rutin adalah glikosida flavanoid. Bentuk aglikon dari rutin adalah kuersetin yang berfungsi sebagai antiinflamasi, antikanker dan antioksidan. Kemudian setelah itu dilakukan refluks pada penangas air mendidih selama 1 jam dan jika cairan dalam tabung terlalu banyak yang menguap bisa ditambahkan 5 ml aquadest yang panas kedalamnya, refluks bertujuan untuk menyempurnakan reaksi hidrolisis yang terjadi. Setelah refluks, campuran dimasukkan ke dalam corong pisah untuk di pisahkan dengan pelarut eter. Eter digunakan karena memiliki kepolaran yang sama dengan kuersetin sehingga kuersetin dapat larut didalamnya. Ketika pemisahan akan terbentuk 2 lapisan yaitu lapisan air asam yang berada di bawah dan lapisan eter yang berada di atas. Kedua lapisan tersebut lalu dipisahkan. Untuk hasil campuran eter dituang kedalam beker glass. Kemudian pada lapisan air asam dilakukan kembali partisi menggunakan 10 ml pelarut dietil eter yang baru dalam corong pisah. Hal ini bertujuan untuk mengambil kembali kuersetin yang mungkin belum terbawa pada pemisahan pertama tadi. Kemudian dipisahkan kembali dengan cairan eternya dimasukkan ke dalam beaker glass yang sudah berisi campuran eter sebelumnya. Sari eter yang didapat kemudian di saring dengan kertas saring yang terdapat 1 gram natrium sulfat anhidrat ke dalam cawan porselin, hal ini dilakukan untuk membersihkan air yang mungkin terbawa ke dalam larutan eter aglikon flavanoidnya. Kemudian eternya diuapkan tanpa pemanasan dan residunya dilarutkan dengan 2 ml metanol sebagai pelarut dari kuersetin. Campuran tersebut dinamai dengan sari II. Setelah itu kemudian uapkan lapisan air asam hasil hidrolisis pada cawan porselin diatas penangas air dengan hembusan angina sehingga cairan kira-kira tinggal 1 ml, yang disebut sebagai sari III (Harbone, 1987).Pada praktikum kali ini Kristal yang didapatkan sebanyak 0,2162 gr dengan rendemen sebesar 0,2524 %. Hasil rendemen ini tidak sesuai dengan literature karena seharusnya dengan 50 gr bahan yang digunakan, kristal yang didapat lebih dari 0,2162 gr. Hal ini dapat disebabkan karena filtrat terkontaminasi jamur jadi pada saat filtrat yang atas dibuang, kristal yang terbentuk juga ikut terbuang dan bisa juga disebabkan kurang lamanya penyimpanan atau pendinginan didalamlemari es, juga karena kurang telitinya praktikan dalam penimbangannya. Kesalahan yang terjadi dalam percobaan kali ini dapat dikelompokkan menjadi dua macam yaitu kesalahan random dan kesalahan sistematik (Gandjar dan Rohman, 2007).a. Kesalahan random (random error)Kesalahan random adalah kesalahan yang selalu terjadi dalam analis dikarenakan adanya sedikit variasi yang tidak dapat ditentukan (dikontrol) saat pelaksanaan (Gandjar dan Rohman, 2007) seperti selisih dalam penimbangan bahan dan ketidaktepatan dalam penambahan volume larutan.b. Kesalahan sistematikKesalahan sistematik memiliki sifat yang konstan, serta dapat mengakibatkan hasilnya menyimpang dari rata-rata. Kesalahan ini dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti :1) kesalahan personel dan operasi2) kesalahan alat dan pereaksi3) kesalahan metodeUntuk mengatasinya dapat dilakukan beberapa cara seperti Kalibrasi alat yang dipakai, melakukan penetapan blanko,penetapan kontrol, satu seri penetapan kadar serta penetapan dengan berbagai metode (Gandjar dan Rohman, 2007)F. KesimpulanDari praktikum Isolasi Glikosida Flavonoid dari Manihot utilissima Foliumdapat ditarik kesimpulan yaitu sebagai berikut :1. Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang terdapat dalam tumbuhan,terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid.2. Flavanoid didalam bahan yang diisolasi bersifat polar sehingga dapat disaridengan air panas dan dikristalkan dengan pendinginan.3. Pemisahan aglikon dari glikosidanya dapat dilakukan dengan hidrolisis asam.4. Pada praktikum kali ini, dihasilkan sari 1 berupa larutan rutin, sari II berupakuersetin dan sari III dihasilkan standar.5. Hasil rendeman yang diperoleh yaitu 0,2524%.Daftar PustakaAnonim, 1995, Farmakope Indonesia edisi IV, Depkes RI, JakartaAnonim, 2000, Acuan Sediaan Herbal, Depkes RI, Jakarta.Anonim, 2008, Singkong Manihot esculenta Crantz, www.plantamor.com,Diakses pada 08 Juni 2014.Gandjar, I. G., Rohman A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,Yogyakarta.Harbone, J.B, 1987, Metode Fitokimia penuntun cara modern menganalisistumbuhan terbitan kedua, ITB, Bandung.Lenny, Sovia, 2006, Karya Ilmiah Senyawa Flavonoida, Fenil Propanoida, danAlkaloida, www.library.usu.ac.id. Diakses pada 08 Juni 2014.Mulia M dan Syahrani A., 1990, Aplikasi Analisis Spektrofotometer UV-VIS,Mecphiso Grafika, Surabaya.Lampiran 1. Jawaban Pertanyaan1. Apakah perbedaan antara infusa dan decocta?Decocta dan infusa dapat diartikan sebagai sari-sari dalam air yang dibuatdari bahan-bahan alam yang direbus pada suhu 900C sampai 980C.Perbedaannya yaitu pada decocta lamanya penyarian setengah jam,sedangkan pada infusa selama 15 menit. Selain itu pada infusa digunakansimplisia yang lunak, mengandung minyak atsiri dan bahan nya tidak tahanpanas. Sedangkan decocta, simplisia yang digunakan biasanya keras, tidakmengandung minyak atrisi, dan tahan pemanasan.2. Sebutkan keuntungan dan kerugian penyarian glikosida flavonoid dengan air?Keuntungan : murah dan mudah diperoleh, stabil, tidak mudah menguap dantidak mudah terbakar, tidak beracun, serta alamiah.Kerugian : banyak komponen polar yang dapat larut bersama air, media airmemungkinkan timbulnya jamur atau bakteri jika disimpan di suhu ruang,tidak selektif, dan untuk pengeringan diperlukan waktu lama.3. Bagaimana dapat diketahui bahwa hidrolisis yang dikerjakan telah sempurna?Deteksi warna dapat dilakukan untuk mengetahui bahwa hidrolisis yangdikerjakan telah sempurna.Lampiran 2. Jurnal PraktikumPERCOBAAN IVIDENTIFIKASI FLAVONOID DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPISA. Tujuan PraktikumMelakukan analisis kualitatif golongan senyawa flavonoid dengan metodekromatografi lapis tipis.B. PendahuluanFlavonoid terdapat dalam semua tumbuhan yang berpembuluh tetapi beberapa kelas lebih tersebar daripada yang lainnya. Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi dan karena itu menunjukkan pita serapan kuat pada sprektum UV dan sprektum tampak. Flavonoid pada umumnya terdapat dalam tumbuhan, terikat terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikonfalvonoid yang mana pun mungkin saja terdapat dalam satu tumbuhan dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida. Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air. Mereka diekstraksi dengan etanol 70% dan tetap ada dalam lapisan air setelah ekstrak ini dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila ditambah basa amonia, jadi mereka mudah dideteksi pada kromatogram atau dalam larutan. Tidak ada benda lain yang begitu mencolok dibandingkan flavonoid yang member konstribusi keindahan dan kesemarakan pada bunga dan buah-buahan di alam. Flavin akan memberikan warna kuning atau jingga, antosianin akan member warna merah, ungu atau biru yaitu semua warna yang terdapat pada pelangi terkecuali warna hijau. Secara biologis, flavonoid memainkan peranan penting dalam kaitannya dengan penyerbukan pada tanaman oleh serangga. Sebagian flavonoid memiliki rasa yang pahit sehingga dapat menolak sejenis ulat tertentu. (Sastroamidjoyo,1996).Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya.C. Bahan dan AlatBahan yang digunakan dalam praktikum adalah lempeng KLT GF 254, metanol,amonia, pereaksi sitroborat, fase atas dari campuran n-butanol : asam asetat : air(3 : 1 : 1) v/v sebagai eluen. Sedangkan alat yang digunakan dalam praktikumadalah chamber KLT, pipa kapiler/ tusuk gigi, pinset, alat penyemprot, oven,lampu UV 244 nm.D. Cara KerjaSari I, Rutin dalam metanol Sari 2, Kuersetin dalam metanol, Sari 3Ditotolkan pada lempeng KLT GF 254 (6x8cm,dengan garis awal = 1 cm, garis akhir = 0,5 cm, danjarak elusi = 6,5 cm),Dielusi pada chamber KLT yang telah berisi campurann-butanol : asam asetat : air (3 : 1 : 1) v/v sebagaieluen,Dikeringkan dengan hair dryer,Dideteksi :1. Sinar UV 254, ditandai bercaknya,2. Uap amonia, di bawah sinar tampak dan UV 254,ditandai bercaknya,3. Pereaksi sitroborat, dipanaskan 110oC selama 5menit, di amati di bawah sinar UV 254, ditandaibercaknya,Dicatat Rf, hRf, dan warna yang terbentuk,Rf, hRf, warnaE. Hasil dan PembahasanE.1. Hasil PengamatanGambar 1. Skema Lempeng KLT.Lempeng KLT dan totolan sampel yang terelusi saat praktikum.0,5 cm1 cm6,5 cm6 cmNo Perlakuan Hasil Pengamatan1. Ditotolkan pada lempeng KLT GF 254 (6x8cm,dengan garis awal = 1 cm, garis akhir = 0,5 cm,dan jarak elusi = 6,5 cm),KiriKanan1. Sari 12. Rutin3. Sari 24. Kuersetin5. Sari 32. Dielusi pada chamber KLT yang telah berisicampuran n-butanol : asam asetat : air (3 : 1 : 1)v/v sebagai eluen,Ke-5 sampel terelusihingga garis akhir.3. Dikeringkan dengan hair dryer, Lempeng KLT GF 254telah kering, siap untuk dideteksi.4. Dideteksi :1. Sinar UV 254, ditandai bercaknya,Sari I = 4,7 cmRutin = 4,8 cmSari II = 6,5 cmKuersetin = 6,3 cmSari III = 6 cm2. Uap amonia, di bawah sinar tampak danUV 254, ditandai bercaknya,3. Pereaksi sitroborat, dipanaskan 110oCselama 5 menit, di amati di bawah sinar UV254, ditandai bercaknya,Sari I = 4,4 cmRutin = 4,5 cmSari II = 6,5 cmKuersetin = 6,3 cmSari III = 6,1 cmSari I = 4,5 cmRutin = 4,5 cmSari II = 6,5 cmKuersetin = 6,2 cmSari III = 6,1 cm5. Dicatat nilai Rf dan hRf yang diperolehhRf = Rf x 100Rf1, hRfSari I = 0,72 cm, 72 cmRutin = 0,73 cm, 73 cmSari II = 1 cm, 100 cmKuersetin = 0,97 cm, 97cmSari III = 0,92 cm, 92 cmRf2, hRfSari I = 0,68 cm, 68 cmRutin = 0,70 cm, 70 cmSari II = 1 cm, 100 cmKuersetin = 0,96 cm, 96cmSari III = 0,93 cm, 93 cmRf3, hRfSari I = 0,70 cm, 70 cmRutin = 0,70 cm, 70 cmSari II = 1 cm, 100 cmKuersetin = 0,93 cm, 93cmSari III = 0,93 cm, 93 cm6. Dicatat warna yang terbentuk Warna1Sari I = cokelat kehijauanRutin = cokelat kehijauanSari II = cokelat kehijauanKuersetin = ungu pudarSari III = ungu pudarWarna2Sari I = cokelat kehijauanRutin = cokelat kehijauanSari II = cokelat kehijauanKuersetin = ungu pudarSari III = ungu pudarWarna3Sari I = cokelat kehijauan,lebih pudarRutin = cokelat kehijauanSari II = cokelat kehijauan,lebih pudarKuersetin = ungu pudarSari III = ungu pudarOO1235 46789101'2'3'4'5'6' A(8a)(4a)CBE.2. PembahasanPada praktikum ini bertujuan untuk dapat melakukan analisis kualitatif golongan senyawa flavonoid dengan metode kromatografi lapis tipis. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangatsedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. Senyawa flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang terbesar yang ditemukan di alam. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah, ungu dan biru serta sebagai zat warna kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Flavonoid mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom karbon, dimana dua cincin benzene (C6) terikat pada suatu rantai propane (C3) sehingga bentuk susunan C6-C3-C6 (Lenny, 2006).Gambar 1. Struktur Senyawa Flavonoid (Lenny, 2006).Sebagian besar senyawa flavonoida alam ditemukan dalam bentuk glikosida, dimana unit flavonoid terikat pada suatu gula. Glikosida adalah kombinasi antara suatu gula dan suatu alcohol yang saling berikatan melalui ikatan glikosida. Pada prinsipnya, ikatan glikosida terbentuk apabila gugus hidroksil dari alcoholberadisi kepada gugus karbonil dari gula sama seperti adisi alcohol kepadaaldehida yang dikatalisa oleh asam menghasilkan suatu asetal. Pada hidrolisa olehasam, suatu glikosida terurai kembali atas komponen-komponennya menghasilkangula dan alcohol yang sebanding dan alcohol yang dihasilkan disebut denganaglikon. Residu gula dari glikosida flavonoida alam adalah glukosa, ramnosa,galaktosa dan gentibiosida. Flavonoida dapat ditemukan sebagai mono- , di- atautriglikosida dimana satu, dua atau tiga gugus hidroksil dalam molekul flavonoidterikat oleh gula. Poliglikosida larut dalam air dan sedikit larut dalam pelarutorganic seperti eter, benzene, kloroform dan aseton. Senyawa-senyawa flavonoidyang umumnya bersifat antioksidan dan banyak yang telah digunakan sebagaisalah satu komponen bahan baku obat-obatan (Anonim, 2008).Pada percobaan kali ini digunakan simplisia dari daun ketela pohon (Manihotutilissima. Berikut taksonominya:Kingdom : PlantaeDivisi : SpermatophytaSub Divisi : AngiospermaeKelas : Dicotyledoneae atau biji berkeping duaOrdo : EuphorbialesFamili : EuphorbiaceaeGenus : ManihotSpesies : Manihot utilissima Pohl. ; Manihot esculenta Crantz sin.Ketela pohon atau singkong, dalam bahasa Inggris bernama cassava, adalahpohon tahunan tropika dan subtropika dari keluarga Euphorbiaceae. Umbinyadikenal sebagai makanan pokok penghasil karbohidrat dan daunnya sebagaisayuran. Di Indonesia sendiri ketela pohon menjadi makanan bahan pangan pokoksetelah beras dan jagung. Manfaat daun ketela pohon sebagai bahan sayuranmemiliki protein cukup tinggi dan Umbi singkong merupakan sumber energi yangkaya karbohidrat namun sangat miskin protein. Kayunya bisa digunakan sebagaipagar kebun atau di desa-desa sering digunakan sebagai kayu bakar untukmemasak. Dengan perkembangan teknologi ketela pohon dijadikan bahan dasarpada industri makanan dan bahan baku industri pakan. Selain itu digunakan pulapada industri obat-obatan. Ketela pohon sangat berkhasiat untuk menyembuhkanberbagai macam penyakit diantaranya yaitu reumatik, demam, sakit kepala, diare,cacingan, mata kabur; nafsu makan, luka bernanah, luka baru kena panas(Anonim, 2008).Monografi dari bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum adalah sebagaiberikut :1. Air suling (Depkes RI, 1979).Nama resmi : Aqua DestillataNama lain : Air sulingPemerian : Cairan jernih; tidak berwarna; tidak berbau;tidak mempunyai rasa.BM / RM : 18,02 / H2O2. Asam asetat (Depkes RI, 1979).Gambar 2. Struktur Asam AsetatNama resmi : Acidum AsetatNama lain : Asam asetat,cukaPemerian : Cairan jernih tidak berwarna, bau menusuk, rasa asam,tajamKelarutan : Dapat campur dengan air, dengan etanol (95%)P, dandengan gliserol PBerat jenis : 1,040 g/ml-1,042 g/ml3. Methanol (Depkes RI, 1979).Gambar 3. Struktur Methanol.Pemerian : Cairan tidak berwarna, jernih, bau khas.Kelarutan : Dapat bercampur dengan air, membentuk cairan jernih,tidak berwarna.BJ / RM : (15,5/15,5) 0,796 sampai 0,798/ CH3OH4. Amonia (Depkes RI, 1979).Nama lain : AmoniaRM / BM : NH4OH / 35,05Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, bau khas, dan menusuk kuatKelarutan : Mudah larut dalam airPenyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat dan ditempat sejukKegunaan : Sebagai dapar pH 105. n-Butanol (Perry, 1984).Gambar 4. n-ButanolMerupakan cairan putih jernih dan berbau tajam Produksi n-butanolsebagian besar digunakan pada pembuatan resin urea fonnaldehid danplasticizer dibutil pthalat. n-Butanol merupakan senyawa organik yangmemiliki ikatan hydrogen. Berat molekul (gr/mol) 74,12; titik didih pada 1atm (oC) 117,73; titik beku, (oC) -89,3; spesifik gravity pada 20oC 0,8098.6. SitroboratPereaksi sitroborat digunakan untuk mendeteksi keberadaan senyawagolongan flavonoid dari glikosida saponin reaksi positif ditunjukkan denganberpendar di bawah sinar UV 366nm. Pada plat, tidak ada bercak yangberwarna kuning, tetapi terdapat bercak yang berpendar di UV 366 setelah disemprot sitroborat. Hal ini menunjukkan bahwa dimungkinkan adanyakandungan flavonoid pada fraksi ini (Wagner, 1984).Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan kromatografi planar dengan fasediam berupa lapisan yang seragam pada permukaan bidang datar yang didukungoleh lempeng kaca, plat almunium atau plastic. Fase gerak sebagai pelarutpengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler padapengembangan secara ascending atau karena pengaruh gravitasi padapengembangan secara descending. Pemisahan pada KLT yang optimal akandiperoleh jika pada penotolan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempitmungkin, dan jika penotolan sampel tidak tepat akan menyebabkan bercak yangmenyebar dan puncak ganda. Parameter pada KLT yang digunakan untukidentifikasi adalah nilai Rf, dua senyawa dikatakan identik jika memiliki nilai Rfyang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama. Analisis kuantitatif denganKLT dapat dilakukan dengan mengukur langsung lempeng dengan ukuran luasbercak atau densikometri (Gandjar, 2007).Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan eluen.Pemilihan eluen didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya merupakancampuran beberapa cairan yang berbeda polaritas. Kepolaran eluen sangatberpengaruh terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh. Faktor retensi (Rf)adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang ditempuholeh eluen. Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluentertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaansenyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berartimempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebutdikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuatpada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah (Anonim, 2013).Keuntungan KLT :1. Waktu relatif singkat2. Menggunakan inestasi yang kecil.3. Paling cocok untuk analisis bahan alam dan obat.4. Jumlah cuplikan yang dengan sedikit.5. Kebutuhaan ruang minimum.6. Penanganan sederhana.7. Zat yang bersifat asam/basa kuat dapat dipisahkan dengan KLT.Kelemahan KLT :1. Hanya merupakan langkah awal untuk menentukan pelarut yang cocokdengan pada kromatografi kolom2. Noda yang terbetuk belum tentu senyawa murni.Terdapat beberapa tahap yang dilakukan pada KLT yaitu penyiapan plat,pemilihan adsorben, pemilihan pelarut, menentukan sistem pengembang yangcocok, pengamatan lokasi bercak pada kromatogram, deteksi dan identifikasi(Kusmardiyani dan Nawawi, 1992). Langkah pertama yang dilakukan untukmengidentifikasi flavonoid adalah dengan mempersiapkan fase diam dan fasegerak yang digunakan sebagai eluen. Fase diam yang digunakan adalah selulosaGF254, sedangkan fase gerak yang digunakan adalah n-butanol : asam asetat : air(3:1:1) v/v dan cuplikan yang digunakan adalah sari I, sari II, sari III, danpembanding larutan rutin serta kuersetin. Dengan digunakannya eluen yangbersifat polar maka senyawa polar akan terelusi lebih dulu dan memiliki Rf yanglebih tinggi, dibandingkan dengan senyawa non-polar ataupun semipolar. PadaKLT ini yang diuji adalah senyawa polar yaitu glikosida flavonoid (rutin) dansenyawa non-polar yaitu aglikon glikosida (kuersetin). Pelarut n-butanol sebagaipelarut non-polar yang melarutkan senyawa non-polar dan yang melarutkansenyawa polar adalah air sebagai pelarut polar. Penotolan dilakukan terhadap sariI, sari II, sari III dan pembanding larutan rutin serta kuersetin, denganmenggunakan pipa kapiler. Penotolan dilakukan pada plat KLT, dimana jarakantar totolan sejauh 1 cm. Setelah dilakukan penotoloan, plat KLT kemudiandideteksi di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm. Pada saatdeteksi di bawah sinar UV diamati bercak flavonoid yang terlihat kemudiandiukur jaraknya dari garis front. Setelah itu, plat KLT diuapkan amonia dandideteksi kembali di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm.Kemudian, langkah selanjutnya di deteksi dengan pereaksi sitroborat, laludipanaskan. Setelah nilai Rf kedua dihitung, plat KLT disemprot dengan pereaksisitroborat dan diamati kembali di bawah sinar UV dengan panjang gelombang254 nm, setelah itu lakukan perhitungan nilai Rf. Nilai Rf dihitung denganpersamaan (Gandjar, 2007) :Rf =Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyaiperbandingan distribusi (D) dan faktor retensi (k) sama dengan 0 yang berartisolut bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak (Gandjar danRohman, 2007). Nilai Rf yang diperoleh dari hasil perhitungan dan warna yangterbentuk kemudian dibandingkan dengan nilai Rf dan warna fluoresens yang adadalam pustaka.Setelah melakukan percobaan Kromatografi Lapis Tipis maka diperolehhasil sebagai berikut, hasil yang di amati dibawah sinar UV254 yaitu sari Imenghasilkan jarakmenurut literatur dapat disimpulkan bahwa sari Imengandung rutin dan sari II mengandung kuersetin karena antara sari I dan rutinmemiliki nilai Rf yang berdekatan dan pada sari II dan kuersetin jugamengandung nilai Rf berdekatan (Gross, 1991). Pada saat KLT dilihat dibawahsinar UV bercak yang tampak yaitu rutin manghasilkan 4,1 cm dan sari IImenghasilkan 5 cm, jadi yang mampu berflourosensi hanya rutin dan sari IIkarena yang akan tampak pada UV hanyalah zat yang mampu berflouresensi(Gandjar, 2007). Kemudian, warna yang terbentuk untuk warna yang pertamaadalah sari I dan sari II menghasilkan warna cokelat kehijauan, sari IIImenghasilkan warna ungu pudar, untuk rutin dan kuersetin masing-masingmenghasilkan warna cokelat kehijauan dan ungu pudar. Warna yang kedua, untuksari I dan sari II menghasilkan warna cokelat kehijauan, sari III menghasilkanwarna ungu pudar, untuk rutin dan kuersetin masing-masing menghasilkan warnacokelat kehijauan dan ungu pudar. Warna yang ketiga, untuk sari I dan sari IImenghasilkan warna cokelat kehijauan tapi lebih pudar, sari III menghasilkanwarna ungu pudar, untuk rutin dan kuersetin masing-masing menghasilkan warnacokelat kehijauan dan ungu pudar.F. KesimpulanDari praktikum Identifikasi Falovonoid dengan Kromatografi Lapis Tipisdapat ditarik kesimpulan yaitu sebagai berikut :1. Senyawa golongan flavonoid dapat diidentifikasi dengan metodekromatografi lapis tipis (KLT) dan spektrofotometer UV-vis.2. Nilai Rf ditentukan dengan mengukur jarak titik pusat bercak dari titik awaldibagi dengan jarak tepi muka pelarut dari titik awal.3. Dengan adanya warna fluoresens itu dapat mengetahui adanya rutin dankuersetin karena hanya rutin dan kuersetin yg dapat berpendar pd Rf standardan sampel yang telah ditentukan (0-1).Daftar PustakaAnonim, 2008, Singkong Manihot esculenta Crantz, www.plantamor.com,Diakses pada 08 Juni 2014.Anonim, 2013, Kromatografi Lapis Tipis.http://www.ilmukimia.org/2013/05/kromatografi-lapis-tipis-klt.html.diakses tanggal 9 mei 2014.Depkes RI, 1979, Farmakope Indonesia Edisi III, Dirjen Ri, Yogyakarta.Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman, 2007, Kimia Farmasi Analisis, PustakaPelajar, Yogyakarta.Kusmardiyani, Siti dan Nawawi As'ari, 1992, Kimia Bahan Alam, Pusat antarUniversitas Bidang Ilmu Hayati, Yogyakarta.Lenny, Sovia, 2006, Karya Ilmiah Senyawa Flavonoida, Fenil Propanoida, danAlkaloida, www.library.usu.ac.id. Diakses pada 08 Juni 2014.Perry R. H., and Green D., 1984, "Chemical Engineer's Hand Book", six edition,Mc Graw Hill Book Company.Robbers.J.E., Speedie.M.K., Tyler.V.E., 1996, Pharmacognosy and Pharmaco,biotechnology.Sastrohamidjojo. H., 1996, Sintesis Bahan Alam, Gajahmada University Press,Jogjakarta.Wagner H.,S. Bladt and EM. Zgainski, 1984, Plant Drugs Analysis., Springer-Verlag., Berlin.Lampiran 1. Jawaban Pertanyaan.1. Apa perbedaan fluoresensi rutin (flavonoid-3-glikosida) dan aglikonnya?Rutin merupakan salah satu jenis glikosida flavonoid yang bersifat polar,sehingga dapat diekstraksi dengan pelarut polar, seperti air, methanol atauetanol. Filtrate yang didapat dari hasil penyarian didinginkan untukmempercepat pembentukan kristal.Pemisahan aglikon dan glikosidanya dapatdilakukan dengan hidrolisis asam, seperti menggunakan HCl. Akan didapathasil berupa kuersetin dan glukosa dari hidrolisis rutin. Terlihat berupa tidakberwarna pada sinar tampak, berwarnabiru keunguan pada sinar UV254nm,birukeunguan pada sinar UV 366nm, dan memberikan fluoresensiberwarna biru terang dengan penampak bercak AlCl3.2. Apakah dasar pemisahan senyawa dengan metode kromatografi lapis tipis?Pemisahan komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografilapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap dengan sifat daya serapmasing-masing komponen. Komponen yang terlarut akan terbawa oleh fasediam (penyerap) dengan membandingkannya dengan standar yang sangatmemakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama.Dalam hal ini untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilihdua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yangsama (Gandjar, 2008).3. Berikan 2 contoh fase gerak lain yang bisa digunakan daam identifikasiflavonoid?Metal asetat, heksan, methanol. Methanol sifatnya polar. Heksan sifatnyanonpolar . Metil asetat sifatnya semi polar.Lampiran 2. Jurnal Praktikum.