YONA OKTA SARI1010413008

ISOLASI DNA DAN RNA MIKROBA

Dosen Pembimbing : Dra. Elida Mardiah MS DR. Zulkarnain Chaidir

PENGERTIAN DNA (deoxyribonucleic acid)DNA adalah asam nukleat yang mengandung instruksi genetik yang digunakan dalam pengembangan dan fungsi dari semua organisme hidup dikenal, dan beberapa virus.• Peran utama dari DNA adalah sebagai sandi genetik,

yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut ‘junk DNA’, DNA ‘sampah’ yang fungsinya belum diketahui dengan baik.

Isolasi DNA

Prinsip Isolasi DNA

Prinsip dasar isolasi total DNA/RNAdari jaringan adalah dengan

memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan

terbentuk ekstrak sel yang terdiri DNA, RNA dan substansi dasar

lainnya

• Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,lemak, dan karbohidrat.

Isolasi

• Pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein

Ekstraksi • Menghilangkan beberapa kontaminan seperti senyawa sekunder (fenol), polisakarida, RNA dan juga protein.

Pemurnian

Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam mengisolasi DNA

• Harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA.• Metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk

semua spesies.• Metode yang dilakukan tidak boleh mengubah

struktur dan fungsi molekul DNA.• Metodenya harus sederhana dan cepat.

PENGERTIAN MIKROBA

Jasad hidup yang ukurannya kecil sering disebut sebagai mikroba atau mikroorganisme atau jasad renik. Jasad renik disebut sebagai mikroba bukan hanya karena ukurannya yang kecil, sehingga sukar dilihat dengan mata biasa, tetapi juga pengaturan kehidupannya yang lebih sederhana dibandingkan dengan jasad tingkat tinggi.

JENIS-JENIS MIKROBA

Bakteri

• Bakteri merupakan mikroba prokariotik uniselular, termasuk klas Schizomycetes, berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan sel. Bakteri tidak berklorofil kecuali beberapa yang bersifat fotosintetik

Virus

• Virus adalah parasit berukuran mikroskopik yang menginfeksi sel organisme biologis. Virus jauh lebih kecil daripada bakteri dan oleh karena itu dapat menerobos saringan bakteri dengan mudahnya

Jamur

• Jamur atau cendawan adalah tumbuhan yang tidak mempunyai klorofil sehingga bersifat heterotrof.

Alga

• Alga merupakan protista yang bertalus memiliki pigmen dan klorofil.

Kha

mir

• Khamir merupakan organisme eukariot uniseluler yang secara taksonomi termasuk kedalam kingdom Eucaryota.

Prinsip Isolasi DNA Bakteri (Plasmid)

Pemanenan sel

• Pemanenan sel dilakukan dari biakan yang telah diinkubasi sebelumnya

Perusakan dan

pembuangan dinding sel

• Perusakan dinding sel antara lain dapat dilakukan dengan pemberian lisozim

lisis sel

Pembuangan remukan sel

Pemisahan DNA dari protein

dan RNA

• Protein dan RNA masing-masing dihilangkan menggunakan kloroform dan RNAse

Pada kelompok prokaryot, umumnya hanya ada satu unit bahan genetik utama yang membawa semua informasi genetik yang

diperlukan untuk kelangsungan pertumbuhan jasad tersebut.

• lisis sel biasanya digunakan sodium dodesyl sulfat (SDS)

• Pembuangan kontaminan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi

Metoda Isolasi DNA Bakteri

Kultur Bakteri (E.Coli)

- Kultur selama 1 malam- Sentrifuge (mengambil kultur dan

menghilangkan medium)

Larutan I(glucose)

Larutan II(NaOH & SDS)

NaOH : merusak membran selSDS : sabun untuk menghancurkan membran sel

Larutan III(netralisasi)

- sentrifuge

Menggumpal & menyatu

Supernatan (berisi DNA)

Indikator untuk melihat lendir-lendir dimulut tabung yang menandakan bahwa bahwa membran sel telah terpecah

Jika ada larutan berkonsentrasi tinggi masuk ke dalam sel, dengan sendirinya membran sel akan rusak

- Treatment PCI (Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol)

DNA bebas dari komponen lain

+ etanol 100% dan NaAc (membantu pengendapan)

Pengendapan- Inkubasi- Cuci dengan EtOH 70%- Keringkan

DNA murni

Prinsip Isolasi DNA Virus (Bakteriophage)Preparasi DNA bakteriophage atau virus, sedikit agak berbeda dengan sel-sel bakteri, yaitu :

1. Phage diisolasi dari kultur sel-sel yang terinfeksi.

2. Dilakukan sentrifugasi dengan ultra sentrifugasi,

sampai diperoleh supernatan berisi phage dan

terpisah dari kultur selnya (dalam bentuk endapan

atau pellet).

3. Tambahkan PEG (poli ethilen glikol) + NaCl

untuk presipitasi partikel phage, sentrifugasi dan

diperoleh pellet phage murni.

Isolasi DNA Jamur

Misellium Jamur

- Subkultur dalam medium PDB (Potato Dextrose Broth)

- Isolasi menggunakan CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)

+ nitrogen cair ke dalam miselium

Terbentuk kristal- Digerus dalam lumpang

Bubuk Misellium+ larutan dapar mengandung CTAB- Divortex beberapa menit- Inkubasi suhu 65 C (2 jam)- Sentrifugasi 5000 rpm (25 menit)

Endapan

+ kloroform : isoamylalcohol (24:1)- Vortex sampai homogen- Sentrifugasi 10000 rpm (10

menit)

Supernatan

- Pindahkan tabung baru+ kloroform,isoamyl alcohol,isopropanol- Simpan pada suhu -20 C (2 jam)

Campuran Larutan- Sentrifugasi 10.000 rpm

Pelet- Cuci dengan alkohol 80%- Sentrifugasi- Larutkan dengan TE

(TrisEDTA)- Simpan pada suhu -20 C

Hasil Isolasi DNA

Isolasi DNA KhamirTahap I • Tahapan utama pada isolasi DNA khamir

adalah penghancuran dinding sel khamir.• Proses terebut dapat dilakukan dengan

metode mekanik dan lisis.• Metode isolasi yang digunakan

mempengaruhi kualitas dan kuantitas DNA yang dihasilkan. Contoh metode mekanik untuk menghancurkan dinding sel khamir antara lain adalah penggunaan sonikasi, mortar (grinding), dan boiling. Contoh bahan enzim yang dapat digunakan dalam proses isolasi DNA khamir adalah zymolase maupun litikase.

Taha

p II

• Tahap kedua adalah pengukuran kualitas

dan kuantitas DNA, pengukuran

kuantitas dan kualitas dilakukan

menggunakan spektrofotometer.

• Kualitas DNA atau tingkat kemurnian

DNA dalam suatu sampel juga dapat

diukur berdasarkan perbandingan nilai

absorbansi antara DNA dan protein.

• Nilai perbandingan antara absorbansi

DNA dan protein dalam suatu sampel

yang menunjukan kualitas DNA yang baik

adalah 1,8-2,0.

• Kisaran nilai tersebut menunjukan

jumlah DNA dalam sampel lebih banyak

dari pada jumlah protein.

amplifikasi daerah ITS (Internal Transcribed

Spacer) dengan metode PCR

Tahap III 1. Denaturasi

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. 2. Penempelan primerPada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer.3. Reaksi polimerisasi (Extension)Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.

Pengertian RNA

RNA merupakan singkatan dari Ribonukleatid Acid atau Asam ribonukleat. RNA merupakan substansi genetik yang berperan sebagai perantara dalam proses pengkodean protein dari gen yang terdapat di dalam DNA.

Ekstrasi RNA

• mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein. mRNA prokariot dapat dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT.• RNA total juga dapat di isolasi dari sel dengan

menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi DNA.

Tahap Isolasi RNA

Penghancuran dinding sel.- Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi.- Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol. - Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan.

Penghilangan protein dan DNA

Enzim DNAase digunakan untuk menghancurkan DNA sehingga RNA dapat diisolasi secara utuh

Pemurnian RNAPurifikasi RNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan PCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan RNA dari larutan, dan mengendapkan.

Metode-metode Isolasi RNA

Rt-PCR

• Teknik RT PCR merupakan suatu pengembangan dari teknik PCR untuk melakukan analisis terhadap RNA hasil transkripsi yang hanya terdapat dalam jumlah yang sedikit di dalam sel

GTC

• RNA diisolasi dengan cara menghomogenasi jaringan pada buffer ekstraksi yang mengandung Guanidinium Thiocyanate (GTC) untuk melisiskan sel dan menonaktifkan RNase endogenous.

DAFTAR PUSTAKA

• Edining,Annisa Retno.2008.Skripsi Identifikasi Khamir dari Perairan Mangrove dan Laut Cagar Alam Pulau Rambut Berdasarkan Daerah Internal Trancribed Spacer (ITS). Universitas Indonesia : Jakarta• Syukur, Sumaryati dan Endang Purwati.2013. Bioteknologi Prebiotik Untuk Kesehatan Masyarakat. Andi : Yogyakarta• http://journal.fmipa.itb.ac.id/jms/article/viewFile/189/186• http://fatchiyah.lecture.ub.ac.id/teaching-responsibility/genera

l/dna-isolation/• http://hendry1.wordpress.com/tag/jenis-mikroba/

Terima

Kasih

Wassalamualaiku

m