17

III. METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaan

Penelitian ini dilakukan di rumah kasa kebun kretivitas mahasiswa Fakultas

Pertanian-Peternakan Universitas Muhammadiyah Malang (± -7.917655 lintang

selatan, ± 112.5951 bujur timur) dari tanggal 28 September – 28 Desember 2016).

3.2 Alat dan Bahan

3.4.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan, timbangan

analitik, gypsum moisture meter, kabel tembaga, kabel serabut, solder, jangka

sorong, meteran, hand counter, kamera untuk dokumentasi, alat-alat pertanian,

oven, tabung tembaga, mikropipet, sentrifuge, spektofotometer, mikroskop, dan

alat uji GCMS.

3.4.2 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah stek tanaman Jarak Pagar

G1 = 5-1-14 (SP8 x SP-16), G2 = 6-2-10 (SP8 x SP-38), G3 = 7-2-8 (SP-33 x HS-

49), G4 = 18-1-14 (SM-35 x SP-38), G5 = IP-3A, dan G6 = IP-3P, polibag ukuran

40 x 40 cm, akarisida, pupuk urea, pupuk SP-36, pupuk kalium, Tanah, pupuk

kandang, pasir, kuteks, acetone, metanol.

18

3.3 Metode Penelitian

Percobaan dilakukan dengan mengunakan Rancangan Petak Terbagi (RPT) /

Split-Plot Design (SPD) secara faktorial dengan jumlah perlakuan sebanyak dua

faktor dengan diulang sebanyak 2 kali. Petak utama adalah kadar air tanah

kapasitas lapang, terdiri dari 3 level yaitu K1 = Kadar air tanah 100% (Kontrol),

K2 = Kadar air tanah 70%, dan K3 = Kadar air tanah 40% kapasitas lapang. Anak

petak adalah genotip jarak pagar (6 level), yaitu G1 = 5-1-14 (SP8 x SP-16), G2 =

6-2-10 (SP8 x SP-38), G3 = 7-2-8 (SP-33 x HS-49), G4 = 18-1-14 (SM-35 x SP-

38), G5 IP-3 A, dan G6 = IP-3 P. Satuan percobaan yang diperoleh 3 x 6 x 2 x 2

= 72 satuan percobaan, setiap satuan percobaan terdiri atas 1 tanaman yang

masing-masing ditanam dengan jarak 50 x 100 cm.

3.4 Pelaksanaan Penelitian

3.4.1 Tahap Persipan

Bahan tanaman yang digunakan berupa stek batang tanaman jarak pagar

Hasil persilangan yang dilakukan oleh Dr. Ir. Maftuchah MP, dari Universitas

Muhammadiyah Malang dari 4 kombinasi persilangan yaitu: (SP 8 x SP 16) diberi

kode angka 5; (SP 8 x SP 38) diberi kode angka 6; (SP33 x HS 49) diberi kode

angka 7; (SM 35 x SP 38) diberi kode angka 18 dan dibandingkan dengan IP-3A,

dan IP-3P. Stek diambil di kebun koleksi Kedungpengaron, Pasuruan, Jawa

Timur. Stek yang digunakan berukuran 20 cm dengan diameter 1-2 cm. Setelah

usia 30 hari setelah tanam bibit tanaman jarak pagar dipindah ke dalam polibag

19

berukuran 40 x 40 yang telah berisi 10 kg media tanam tanah, pupuk kandang dan

pasir (3:1:1) (Istiana, 2008).

Menghitung Kadar Lengas Kering Angin

Kadar lengas kering angin ditentukan dengan tahapan-tahapan dan

perhitungan berikut ini :

1. Menimbang botol kuningan kosong beserta tutup botolnya (a gram).

2. Mengisi media tanam kedalam botol timbang dengan volume sekitar

separuh volume botol kemudian tutup dan timbang (b gram).

3. Masukkan botol timbang kedalam oven dengan tutup terbuka pada suhu

konstan selama 12 jam.

4. Setelah 12 jam, botol timbang ditutup rapat kemudian di keluarkan hingga

mencapai suhu ruang.

5. Menimbang botol yang telah di dinginkan (c gram).

6. Menghitung kadar lengas tanah kering angin dengan rumus :

Keterangan :

a = berat botol timbang kosong serta tutup botol (gram)

b = berat botol timbang setelah diisi degan media tanam (gram)

c = berat botol timbang dan tutup setelah didinginkan (gram)

nilai (c-a) adalah berat contoh tanah kering mutlak

nilai (b-c) adalah berat air dalam contoh tanah (Ikhwan, 2014)

20

Jenuh Air

1. Menuang contoh tanah secara merata tanpa ditekan setebal kurang lebih

2,5 cm.

2. Memasukkan keranjang tersebut ke dalam pipa paralon dan mengisi air

secara perlahan pada keranjang hingga tanah terjenuhi oleh air.

3. Mengambil sebagian sampel tanah dalam pipa, kemudian menimbang

tanah tersebut (a gram).

4. Mengoven tanah tersebut selama 4 jam dengan suhu 1050C, kemudian

menimbang berat tanah (b gram).

BB = Berat Basah Tanah (gram)

BK = Berat Kering tanah oven (gram) (Ikhwan, 2014)

Kadar Lengas Kapasitas Lapang

Penetapan kadar air kapasitas lapang yaitu dengan menggunakan metode

gravimetri seperti tahap –hahap sebagai berikut :

1. Memasukkan sampel tanah kering angin kedalam seng tanpa ditekan lalu

menimbangnya (x gram).

2. Meletakkan seng berisi media tanam tersebut pada penyangga diatas

wadah berdiameter lebih besar. Menyiram air secara perlahan dengan

volume terukur (V1 liter) pada media sampai jenuuh air yang ditandai

dengan air yang menetes dari lubang bagian bawah seng.

21

3. Mengatuskan sampel tanah jenuh air selama semalam (12 jam) atau

sampai tidak ada air lagi yang menetes dan mengukur volume air

tertampung dalam wadah (V2 liter).

4. Menimbang sampel tanah (Bobot basah) sebanyak a (gram).

5. Mengoven media tanam selama semalam 12 jam dengan suhu 105ºC

6. Menimbang (Bobot Kering) b (gram).

Contoh tanah dikeluarkan dan ditetapkan kadar airnya dengan metode

gravimetri dengan 6 sampel media tanam. Kadar air tanah pada keadaan kering

udara dapat ditentukan dengan menggunakan rumus :

a = Berat Basah Tanah (gram)

b = Berat Kering tanah oven (gram) (Ikhwan, 2014)

Penetapan Penambahan Air per penurunan (ml / %)

Perlakuan cekaman kekeringan berdasarkan kapasitas lapang dapat

ditentukan tingkat kadar air tanah masing-masing sebagai berikut : 100, 70, dan

40 % KL. Untuk menentukan volume air yang diberikan, maka perhitungan

menggunakan rumus sebagai berikut :

Keterangan :

BB = Kadar Air Tanah Kering Udara bobot basah tanah,

BK = Bobot Tanah Kering Mutlak (kering oven) (Lapanjang, 2008)

22

3.4.2 Perawatan dan pemeliharaan

Pemeliharaan tanaman meliputi penyiangan, pemupukan, dan pengendalian

hama-penyakit dilakukan secara intensif. Dosis pupuk yang digunakan dalam

penelitian ini adalah 40 g Urea + 40 g SP-36 + 20 g KCl, pupuk diberikan setelah

tanaman berumur 1 minggu setelah tanam, setengah dosis pupuk N dan seluruh

dosis pupuk P dan K (20 g Urea + 40 g SP-36 + 20 g KCl), sedangkan ½ dosis

pupuk N (20 g) diberikan pada saat 8 minggu setelah tanam.

Tabel 3. Daftar Pestisida dan fungisida yang digunakan saat perawatan tanaman

jarak pagar (Jatropha curcas L.)

Hama/penyakit Jenis

Pestisida/Fungisida Bahan aktif Konsentrasi

Cabuk/kutu putih Marshal

Fastag

Karbosulfan

Alfametrin

0,5-2 ml/l

1-2 ml/l

Tungau Fastag

arrivo

Alfametrin

Sipermenrin

1-2 ml/l

0,5-1 ml/l

Busuk akar dan

batang

Benlox

Nordox 56 WP

Benomil

Tembaga oksida

1-1,5 gram/l

3-4 gram/l

3.4.3 Perlakuan Uji

Perlakuan uji dilaksanakan 2 tahap, tahap pertama adalah tahap perlakuan

kekeringan sesuai dengan perlakuan 100, 70, dan 40% kapasitas lapang.

Pengeringan tanaman sesuai dengan perlakuan dan penambahan air (ml)

dilakukan setiap hari selama 84 hari. Tahap kedua adalah tahapan pemulihan

pasca perlakuan kekeringan. Tahapan kedua ini dilakukan mulai tanaman 66-84

hari setaleh cekaman kekeringan dengan cara mengembalikan seluruh perlakuan

ke 100 % kapasitas lapang. Pemberian air dilakukan dengan cara di kocor sesuai

dengan penurunan (%). Pengukuran kadar air tanah kapasitas lapang

menggunakan alat Gypsum Moisture Meter.

23

3.5 Pengamatan

Karakter morfologi yang diamati mencakup peubah pertambahan volume

batang tanaman (cm3), jumlah daun terbentuk, jumlah daun gugur, jumlah bunga,

jumlah buah, persentase bunga jadi buah, panjang akar (cm), karakter biokimia

yang diamati meliputi jumlah klorofil, dan kandungan metabolit sekunder (ppm).

Sedangkan karakter anatomi yang diamati adalah jumlah, ukuran stomata dan

kerapatan stomata.

a. Pertambahan Volume Batang Tanaman (Cm3)

Pertambahan Volume batang diukur setiap 14 hari sekali dengan

mengukur diameter pangkal batang dan tinggi batang, untuk cabang

primer pengukuran diameter dilakukan mulai pangkal diatas permukaan

tanah. Volume tanaman hitung dengan rumus panjang batang, volume

tiap ruas batang, dan volume batang (Nurnasari dan Djumali, 2011)

Panjang batang (Pb) dihitung dengan rumus:

Volume setiap ruas batang (Vr) dihitung dengan rumus:

Volume batang (Vb) dihitung dengan rumus:

24

b. Jumlah Daun Terbentuk

Jumlah helaian daun dihitung pertanaman yaitu dengan

menghitung jumlah daun pada masing-masing tanaman. Daun yang

dihitung adalah daun yang telah terbuka sempurna, pengamatan

dilakukan dengan interval 7 hari sampai 84 hari setelah perlakuan.

Pengamatan dimulai 1-56 setelah perlakuan untuk cekaman kekeringan

sedangkan 57-84 haridalam keadaan pemulihan (recovery).

c. Jumlah Daun Gugur

Jumlah daun gugur dihitung pertanaman yaitu dengan menghitung

jumlah daun gugur. Daun yang gugur disimpan dalam plastik yang di

tempel di polybag masing-masing tanaman, pengamatan dilakukan

dengan interval 7 hari sampai 84 hari setelah perlakuan. Pengamatan

dimulai 1-56 setelah perlakuan untuk cekaman kekeringan sedangkan

57-84 hari dalam keadaan pemulihan (recovery).

d. Jumlah bunga

Pengamatan jumlah bunga total dilakukan dengan mengamati

jumlah bunga jantan, betina, dan hemaprodit dalam masing-masing

tanaman. Pengamatan dilakukan pada dua fase yaitu fase pengeringan

dan fase pemulihan. Proses pengeringan berlangsung mulai dari 1-56

setelah perlakuan untuk cekaman kekeringan sedangkan 57-84 hari

dalam keadaan pemulihan (recovery). Pengamatan dilakukan setiap hari

sampai dengan akhir penelitian.

25

e. Jumlah Buah

Pengamatan dilakukan dengan cara mengamati berapa banyak

jumlah bunga yang terbentuk menjadi buah. Pengamatan dilakukan pada

dua fase yaitu fase kering dan fase pemulihan setelah pengeringan.

Proses pengeringan berlangsung mulai dari 1-56 setelah perlakuan untuk

cekaman kekeringan sedangkan 57-84 hari dalam keadaan pemulihan

(recovery).Pengamatan jumlah buah dilakukan pada semua tanaman

percobaan.

f. Persentase bunga jadi buah

Penghitungan persentase bunga jadi buah dilakukan dengan

menghitung jumlah buah yang terbentuk dalam satu tanaman dibagi

dengan jumlah bunga yang terbentuk kemudian dikalikan 100%.

Penghitungan dilakukan dalam satuan persen (%).

Rumus bunga jadi buah =

g. Panjang Akar (cm)

Dilakukan saat tanaman berumur 56 hari setelah perlakuan

(sampel 1) atau sampel destruktif dan 84 hari setelah perlakuan (sampel

2), media dipisahkan dari akar dengan cara merobek polibag dan

memisahkan akar dari tanah dengan cara merendamnya dalam air agar

akar tidak putus. Akar yang diukur adalah akar yang terpanjang yang

diukur dari pangkal akar hingga ujung akar.

26

h. Jumlah, Ukuran Stomata dan Kerapatan Stomata

Pengukuran Jumlah stomata dilakukan pada saat tanaman

diperlalukan selama 56 hari setelah cekaman kekeringan dengan teknik

imprint yaitu mencetak stomata dengan menggunakan kuteks bening (cat

kuku), duplikat stomata yang terletak pada bagian bawah daun seluas 1 x

1 cm3. Permukaan daun bagian bawah (daun ke-empat dari pucuk)

ditutupi dengan kutek bening. Setelah itu kutek diambil kemudian

diamati dan dihitung di bawah mikroskop stereo dengan perbesaran

400x. Kerapatan stomata dihitung berdasarkan rumus:

i. Jumlah Klorofil

Pengukuran klorofil daun dilakukan menggunakan

spektrofotometri. Klorofil diekstrak menggunakan metode baku yang

dikembangkan oleh oleh Arnon dalam Ardie (2006) yaitu 1 g jaringan

daun segar ditimbang dan digerus hingga halus dalam mortar martil,

Penambahan aseton 10 ml dilakukan sehingga jaringan menjadi

homogen. Jaringan tersebut diaduk hingga menghasilkan supernatan lalu

ditambahkan aseton 80%. Suspensi dituangkan kedalam tabung sentrifius

dan diputar selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Secara

perlahan supernatan dituangkan kedalam tabung sentrifius yang lain dan

volume dibuat 3 ml, kemudian dilakukan pengukuran absorbansi dengan

menggunakan pada panjang gelombang 663 nm dan 645 nm atau 652 nm

27

menggunakan spektrofotometer Shimatzu UV-1601. Konsentrasi klorofil

berdasarkan panjang gelombang dihitung dengan persamaan McKinney

dan Arnon :

Keterangan : A663 = Nilai Absorbansi panjang gelombang 663

A645 = Nilai Absorbansi panjang gelombang 645

A652 = Nilai Absorbansi panjang gelombang 652

j. Kandungan Metabolit Sekunder (Ppm)

Kandungan metabolit sekunder dilakukan pada saat tanaman

berumur 56 hari setelah perlakuan cekaman kekeringan, pengujikan

dengan menggunakan metode Gas Chromatography Mass Spectrometry

(GCMS) dengan cara mengambil getah dari tanaman jarak pagar.

1. Bahan berupa getah tanaman jarak pagar sebanyak 500 µl per

sampel.

2. Suspensi di vorteks sampai homogen selama 5 menit.

3. Sentifugasi sampel pada kecepatan 4000 rpm selama 5-10 menit

(saat melakukan sentrifugasi, berat sampel harus seimbang).

28

4. Mengambil fasa atas (supernatant) 250 µl kemudian dipindah

kedalam tabung sentrifuge yang baru (jangan sampai endapan

terbawa).

5. Menambahkan methanol 250 µl kedalam supernatant.

6. Suspensi di vorteks sampai homogen selama 5 menit.

7. Tambah methanol dingin dengan perbandingan 1:1 (500 µl).

8. Sentrifugasi sampel pada kecepatan 4000 rpm selama 10 menit.

9. Buang supernatant hingga tersisa nathannya saja (endapan).

10. Resuspensi dengan menambah 100 µl ethanol absolut, lalu

diinjeksikan dalam kolom GCMS.

29

Tabel 4. GCMS report properties

GCMS apparatus

model

: Shimadzu GCMS QP 2010 SE

Column : ZB - AAA (10 mL x 0,25 mml.D

(Phenomenex Inc)

Injection quantity : μ

Vaporization chamber

temperature

: 280 °C

Column oven

temperature

: 110 °C → (30 °C/min) → 320 °C

Control mode : Constant pressure (15 kPa)

Injection mode : split

Split ratio : 127,5

Carier gas : Helium

Interface temperature : 280 °C

Ion source temperature : 200 °C

Solvent elution time : 0,4 min

Data sampling time : 0,5 min to 7 min

Measurement mode : Scan

Mass range : m/z 45 - 900 (3,33 u/sec)

Event time : 0.15 sec

Total flow : 80,5 mL/min

Column flow : 0,6 mL/min

Linear velocity : 28,5 cm/sec

Purge flow : 3,0 mL/min

Solvent cut time : 2 min

Detector gain mode : Relative

Detector gain : 0,00 kV

Run time : 100 minutes

GCMS method : GCMS method

3.6 Analisis dan Penyajian Data

Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis sidik ragam (Anova)

kemudian jika keragaman diatas 30% data ditransformasi menggunakan (√ )

dan di D c α %

pengaruh perlakuan terhadap peubah yang diukur. Untuk mengetahui tingkat

toleransi klon-klon jarak pagar dilakukan perhitungan indeks sensitivitas cekaman

30

(SSI = stress sensivity index) pada masing-masing peubah menurut Fischer dan

Maurer (1978).

(

c

)

( c

)

Pada peubah pertambahan volume batang tanaman, jumlah daun, berat biji,

jumlah bunga, jumlah buah, persentase buah terbentuk, panjang akar, jumlah daun

gugur, jumlah stomata selama tanaman mengalami cekaman. Klon yang

menghasilkan nilai SSI tertinggi dikategorikan klon klon rentan dan klon terendah

dikategorikan klon toleran. Kategori toleransi tanaman terhadap cekaman air yang

digunakan sebanyak 5 kategori sehingga nilai penentu batas kategori (NPB) pada

setiap peubah dihitung dari nilai SSI maksimum dibagi lima, kolon-klon

dikategorikan :

1. Rentan bila nilai SSI > (SSImax – NPB) dan diberi indeks 1

2. Agak Rentan bila(SSImax – 2 NPB) < SSI , (SSImax –NPB) dan diberi

indeks 2

3. Moderat bila (SSImax – 3 NPB) < SSI , (SSImax – 2 NPB) dan diberi

indeks 3

4. Agak toleran bila (SSImax – 4 NPB) < SSI , (SSImax – 3 NPB) dan

diberi indeks 4

5. Toleran bila nilai SSI < (SSImax – 4 NPB) dan diberi indeks 5

Rerata indek dari peubah pengamatan digunakan untuk menentukan tingkat

ketahanan klon-klon jarak pagar yang diuji (Lapanjang, 2008 ; Djumali, 2016).

31

Pengamatan &

Pengujian Sampel

Inventarisasi Alat dan

Stek Tanaman

Input

6 Genotipe Tanaman Persiapan Alat Dan

Bahan

Proses Output

TAHAP AWAL

Informasi kadar air

tanah dan data

pengamatan

Perlakuan

Pengeringan

Penyesuaian Kadar Air

Tanah 100%, 70%, dan 40%

Kapasitas lapang

TAHAP 1

Penetapan Kadar Air

Tanah kapasitas

lapang

Menjenuhkan Air dan

Mencari Selisih Kadar

Air dengan metode

gravimetri

Nilai Kadar Air

Kering Udara (%)

Informasi Parameter

pengamatan non-

destruktif, destruktif

dan Metabolit

Sekunder

TAHAP AKHIR

Uji Anova Dan Uji

D c α %

Analisis Data

Data Pengamatan

Tahap ke-II

Pemulihan Pasca

Pengeringan Penembalian kadar air

ke 100% Kapasitas

Lapang

Mengamati Parameter non-

destruktif, destruktif

dan uji GCMS

Tanaman Toleran,

Agak Toleran, dan

Tidak Toleran

Tanaman Cepat

Pulih, lambat Pulih,

dan Tidak Pulih

TAHAP 2

Informasi Parameter

pengamatan non-

destruktif dan destruktif

Pengamatan &

Pengujian Sampel

Pengamatan Parameter non-

destruktif dan destruktif

Tahapan Penelitian Uji Toleransi Enam Genotipe Jarak Pagar

(Jatropha curcas Linn) Produktivitas Tinggi Terhadap Berbagai

Cekaman Kekeringan

Gambar 2.