24

II. TINJAUAN PUSTAKA

S. RENDANG

Rendang adalah masakan yang berasal dari suku Minangkabau tetapi

saat ini umum disajikan di seluruh Indonesia. Rendang merupakan salah satu

makanan khas dari kebudayaan Minangkabau yang disajikan pada saat-saat

penting seperti upacara atau untuk menghormati tamu. Rendang dibuat dari

daging sapi (atau dapat juga dari daging ayam, kerbau dan bebek, atau nangka

dan ubi kayu) yang dimasak dengan santan dan rempah-rempah selama

beberapa jam sampai airnya habis dan daging menyerap bumbu rempah-

rempah. Proses memasak berubah dari merebus menjadi menggoreng saat

airnya menguap. Rempah-rempah yang digunakan yaitu jahe, kunyit,

lengkuas, daun jeruk, dan cabai. Rendang ayam atau bebek juga biasa

ditambahkan dengan asam jawa dan waktu pemasakannya tidak selama

rendang daging sapi (Anonim, 2009b).

Ada dua jenis rendang yaitu rendang kering dan basah. Rendang kering

dapat disimpan selama 3-4 bulan dan biasanya dimasak dalam acara-acara

penting untuk menjamu tamu. Rendang basah, atau biasa disebut kalio, dapat

ditemui di rumah makan Minangkabau tanpa dibekukan, dan masih dapat

dikonsumsi dalam jangka waktu sebulan (Lipoeto et al., 2001). Rendang

sering disajikan dengan nasi di Indonesia, tapi di Malaysia, pangan ini juga

disajikan dengan ketupat dan lemang.

Rendang, empal dan semur yang dimasak secara tradisional diolah

dengan cara mencampurkan daging potong dengan bumbu atau campuran

rempah-rempah, kemudian dimasak sampai matang dengan santan untuk

rendang atau dengan minyak kelapa sawit untuk empal. Bumbu yang

biasanya dipakai dalam memasak rendang adalah cabai, bawang putih,

bawang merah, dan rempah-rempah lainnya. Karena masing-masing produk

memiliki kadar air yang tinggi, yaitu 60-70%, produk-produk tersebut

cenderung untuk cepat rusak pada suhu ruang (Irawati et al., 2000).

25

T. TEKNIK IRADIASI PANGAN

Menemukan cara untuk menghambat perusakan pangan dan

mengendalikan serangan mikroorganisme telah menjadi fokus manusia

selama berabad-abad. Cara-cara pengendalian seperti pembekuan atau

pasteurisasi telah menjadi teknik yang biasa digunakan, dan diharapkan suatu

saat teknik iradiasi pangan dapat dikembangkan dan diimplementasikan di

masyarakat.

Beberapa bakteri patogen merupakan penyebab penyakit yang

ditimbulkan oleh bahan pangan (foodborne illness) dan menyebabkan 1800

kematian dan 60.000 orang sakit setiap tahunnya di Amerika Serikat (Mead et

al., 1999). Sumber kontaminasi bakteri patogen asal pangan berasal dari

produk yang tidak diolah dan disimpan dengan baik. Iradiasi pangan

mendapatkan perhatian karena meningkatnya insiden penyakit asal pangan

dalam beberapa dekade terakhir, sebab proses iradiasi secara efisien dapat

mengurangi populasi patogen seperti Salmonella, Listeria, Campylobacter, E.

coli O157:H7, dan lainnya, seperti virus, parasit dan serangga. Proses ini telah

disetujui oleh World Health Organization (WHO), Food and Agriculture

Organization (FAO), Codex Alimentarius Commission, US Food and Drug

Administration (FDA), US Department of Agriculture (USDA), American

Medical Association, American Dietetic Association, American Institute of

Food Technologists, dan otoritas kesehatan di 50 negara (Diehl, 1995). Daftar

produk yang diijinkan untuk diiradiasi berbeda-beda di tiap negara, tetapi

seringnya terbatas hanya pada rempah-rempah, herba, bumbu, beberapa buah

segar dan kering, sayuran, makanan laut, daging sapi giling, dan daging

unggas (Marchioni, 2008).

Jenis sumber radiasi yang digunakan terbatas pada radiasi yang berasal

dari sumber radionuklida yang menghasilkan sinar gamma berenergi tinggi,

sinar X dan elektron yang diakselerasi. Sumber-sumber radiasi ini juga

dikenal dengan radiasi pengion karena energi yang dikeluarkan cukup tinggi

untuk mendislokasi elektron dari atom dan molekul dan mengubahnya

26

menjadi partikel bermuatan listrik yang disebut ion. Sinar gamma dan sinar

X, seperti gelombang radio, gelombang mikro, ultraviolet dan spektrum sinar

tampak, merupakan bagian dari spektrum elektromagnetik dan ada dalam

daerah gelombang pendek, berenergi tinggi yang memiliki kekuatan

berpenetrasi yang paling besar. Letak sinar gamma dan sinar X pada

spektrum elektromagnetik diperlihatkan di gambar 1.

Gambar 1. Spektrum elektromagnetik

Sinar gamma dan sinar X memiliki sifat yang sama dan efek yang sama

pada bahan, perbedaan utamanya hanya pada sumber. Sinar X dengan energi

yang bervariasi dihasilkan dari mesin. Sinar gamma dengan energi yang

spesifik dihasilkan dari disintegrasi spontan dari radionuklida. Radionuklida

yang ada secara alami dan buatan manusia, yang dikenal dengan nama isotop

radiaoktif atau radioisotop, menghasilkan radiasi saat bahan-bahan ini secara

spontan kembali ke keadaan stabil. Waktu yang dibutuhkan oleh sebuah

radionuklida untuk mencapai setengah level radioaktivitas yang ada di awal

disebut waktu paruh, dan spesifik untuk tiap radionuklida dari elemen

tertentu. Becquerel (Bq) merupakan unit radioaktivitas dan setara dengan satu

disintegrasi per detik (ICGFI, 1999).

Radiasi pengion merupakan energi yang ditransmisikan melalui udara

dalam bentuk gelombang elektromagnetik atau sinar berkas elektron. Iradiasi

27

pangan melibatkan penggunaan sinar gamma yang dihasilkan oleh

radionuklida, baik itu kobalt-60 [1.17 dan 1.33 MeV (1 MeV = 1.6 × 10−13

J)]

atau sesium-137 (0.66 MeV), sinar berkas elektron yang dihasilkan dari

sumber mesin listrik yang dioperasikan pada atau di bawah tingkat energi 10

MeV atau sinar X yang dihasilkan dari tumbukan berkas elektron (tingkat

energi 5 MeV atau di bawahnya) pada sebuah target logam yang memiliki

densitas elektronik yang tinggi (WHO, 1999) Dosis iradiasi diukur dengan

unit gray (Gy) atau kilogray (kGy). Satu gray setara dengan penyerapan 1 J

energi dalam 1 kg bahan pangan.

Sementara itu, menurut ICGFI (1999), hanya sumber radiasi tertentu

yang dapat digunakan dalam iradiasi pangan. Sumber-sumber tersebut

diantaranya adalah radionuklida kobalt-60 (Co-60) atau sesium-137 (Cs-137);

mesin sinar X yang memiliki energi maksimum 5 juta elektron volt (MeV)

(satu elektron volt adalah jumlah energi yang diperoleh oleh sebuah elektron

ketika diakselerasi dengan daya sebesar satu volt dalam keadaan vakum); atau

akselerator elektron yang memiliki energi maksimum 10 MeV. Energi dari

sumber-sumber radiasi ini terlalu rendah untuk dapat menginduksi

radioaktivitas pada bahan apapun, termasuk pangan.

Radioisotop yang dipakai dalam penyinaran rendang iradiasi adalah

kobalt-60. Radioisotop ini memiliki aktivitas spesifik 1,1 x 103 Ci/g dan

waktu paruh 5,23 tahun. Seperti radioisotop sesium-137, radioisotop ini

memancarkan sinar beta dan gamma.

Ada tiga aplikasi dan kategori dosis yang biasa digunakan: 1) iradiasi

dosis rendah (sampai 1 kGy), dengan tujuan untuk menunda kematangan,

menghambat pertunasan, disinfetasi serangga, dan inaktivasi parasit; 2)

iradiasi dosis sedang (1-10 kGy) dengan tujuan untuk mengurangi jumlah

mikroba pencemar, mengurangi atau mengeliminasi patogen yang tidak

membentuk spora, misalnya mikroorganisme penyebab penyakit; 3) iradiasi

dosis tinggi (di atas 10 kGy) yang bertujuan untuk mengurangi jumlah

mikroorganisme sampai mencapai keadaan steril (ICGFI, 1999). Dosis di atas

10 kGy dibutuhkan untuk sterilisasi pangan yang siap makan (ready-to-eat

food) yang mensyaratkan tidak adanya mikroba dan/atau harus

28

mempertahankan penyimpanan jangka lama tanpa refrigerasi (WHO, 1999),

misalnya pangan untuk rumah sakit, pangan untuk pasien dengan kekebalan

tubuh rendah, astronot, tentara, pendaki gunung, atau orang-orang yang

memiliki hobi berkemah (Marchioni, 2008).

Proses pendinginan merupakan proses yang dianggap mahal khususnya

di bagian tropis dan subtropis dunia. Perlakuan kimia relatif lebih murah dan

efektif, tetapi perlakuan ini meninggalkan residu, dan banyak negara telah

melarang penggunaannya karena alasan-alasan kesehatan. Oleh karena itu,

iradiasi dapat menjadi alternatif teknologi yang lebih baik (Miller, 2005).

Banyak pangan, khususnya buah-buahan dan sayuran segar, cukup

mendapatkan perlakuan dosis rendah tanpa mengalami penurunan kualitas.

Bagaimanapun, beberapa pangan, seperti daging ternak, unggas, dan beberapa

jenis hasil laut perlu mendapatkan dosis sedang (radurisasi) sampai tinggi

(radapertisasi), jika ada persyaratan tertentu dalam kualitas. Sterilitas

komersial, yang didefinisikan sebagai tidak terdapatnya bakteri, khamir, dan

kapang hidup, dapat dicapai dengan dosis antara 25-45 kGy. Enzim autolisis

yang ada pada semua pangan mentah memiliki sifat resisten terhadap dosis

radiasi ini dan harus diinaktivasi dengan perlakuan panas sedang (misalnya

blansir pada suhu 70°C) jika ingin dicapai stabilitas masa simpan dalam

jangka panjang tanpa refrigerasi. Untuk mencegah off-flavor, oksigen harus

dikeluarkan dengan cara pengemasan vakum dalam kaleng logam atau

kantong fleksibel yang dilaminasi (laminated flexible pouch). Kemudian,

proses iradiasi akan dilakukan pada suhu -20° - (-40°) C (Diehl, 1990).

Beberapa negara telah sukses menghasilkan pangan iradiasi dosis

tinggi. Salah satunya adalah Ceko. Pangan iradiasi dengan dosis tinggi yang

telah diproduksi adalah kari ayam, daging babi beku, ayam goreng dan ayam

panggang dikemas vakum dengan dosis 35-65 kGy. Pangan tersebut diiradiasi

dengan menggunakan elektron yang diakselerasi (Placek et al., 2004)

Sebelumnya, pada awal penggunaannya, iradiasi pengion telah digunakan

untuk menghasilkan pangan bagi astronot NASA dengan dosis iradiasi tinggi

mulai tahun 1995.

29

U. RENDANG IRADIASI

Beberapa produsen pada skala rumah tangga maupun industri telah

menunjukkan minat mengenai kemungkinan penggunaan iradiasi untuk

memperpanjang umur simpan produk pangan seperti rendang. Sebuah studi

yang dilakukan di sebuah pusat penelitian mengindikasikan bahwa rendang

ikan mas yang diiradiasi pada 7,5 kGy dapat disimpan lebih dari 15 hari pada

suhu ruang (Suswati, 1987). Iradiasi pada dosis yang lebih tinggi memiliki

efek nyata pada sifat sensori produk rendang tersebut, karena rendang

tersebut tidak dikemas vakum dan diiradiasi pada suhu ruang. Kombinasi

perlakuan antara iradiasi dosis sterilisasi dengan kemasan vakum pada suhu

rendah untuk menghasilkan pangan yang memiliki umur simpan stabil telah

sukses dikembangkan oleh beberapa peneliti (IAEA, 1995).

Prosedur dasar untuk mempersiapkan pangan radapertisasi (iradiasi

sterilisasi) adalah sebagai berikut (IAEA, 1995):

1. Proses termal: Untuk masa penyimpanan yang diperpanjang, enzim

proteolitik harus diinaktivasi, yang dilakukan dengan cara

memanaskan makanan sampai suhu internalnya di atas 75°C

selama sedikitnya 10 menit.

2. Pengemasan vakum: Keadaan vakum dibutuhkan karena oksigen

dapat menyebabkan kerusakan karena radiasi.

3. Pembekuan: Produk harus dibekukan sedikitnya mencapai suhu

-30°C.

4. Iradiasi: Pangan yang dikemas diiradiasi pada keadaan beku sampai

mencapai dosis minimum 25-45 kGy (tergantung pada produknya).

Rendang iradiasi yang menjadi sampel dalam penelitian ini diproduksi

oleh Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi Badan Tenaga Nuklir

Nasional (PATIR BATAN). Daging yang dibuat menjadi rendang dibeli dari

pasar lokal. Jumlah daging yang digunakan untuk membuat rendang adalah

20 bagian/kg. Bahan pengemas yang digunakan untuk mengemas rendang

adalah aluminium foil berlaminasi PET 12µ/LDPE, dengan adhesive 2µ/Al-

30

foil, 7µ/LDPE, dan 50µ /LLDPE sebagai pengemas bagian luar. Ukuran

masing-masing kantong pengemas adalah 21 × 17 cm2.

Bumbu yang dipakai dalam pembuatan rendang yang diiradiasi dapat

dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Bumbu yang dipakai dalam pembuatan rendang yang diiradiasi

Bumbu Jumlah

(g/kg daging)

Cabe merah 100

Bawang merah 100

Bawang putih 16

Daun sereh 3 helai

Daun kunyit 1 helai

Daun jeruk 6 helai

Asam kandis 1 buah

Garam 10

Lengkuas 35

Jahe 75

Santan kelapa 1,5 liter

Rendang dibuat dengan cara memotong-motong daging sapi menjadi

berbentuk kubus-kubus kecil (20 kubus/kg), dicuci menggunakan air keran,

kemudian dicampur dengan bumbu-bumbu seperti yang dicantumkan pada

tabel 1 dan direndam selama 2 jam. Setelah direndam dengan bumbu, daging

tersebut ditempatkan dalam wajan dan dimasak selama 20 menit sampai

airnya habis. Santan dan asam kandis ditambahkan ke dalam campuran

tersebut kemudian direbus kembali selama 20 menit. Setelah dimasak, daging

diambil dan campuran bumbu tanpa rendang direbus kembali selama 30

menit dalam wajan sampai campuran bumbu mengental dan berwarna coklat.

Daging yang telah masak kemudian ditaruh kembali dalam wajan dan ditumis

selama 2 jam. Rendang kemudian dibiarkan turun suhunya menjadi suhu

ruang sebelum dikemas vakum dalam kantong berlaminasi. Dua bagian

31

daging dimasukkan dalam tiap kantong dan disimpan dalam freezer semalam

pada suhu -18°C (Irawati et al., 2000).

Pangan olahan siap saji berbasis daging sapi diiradiasi dengan dosis

tinggi yaitu 45 kGy yang dilakukan di irradiator IRKA dengan kapasitas

sumber 195 kCi pada laju dosis 5,2 kGy/jam. Dosimeter untuk kalibrasi

menggunakan FW-60 film Radiochromic dan red Perspex. Kotak styrofoam

dengan ukuran yang sama dipakai sebagai wadah seperti yang digunakan

untuk iradiasi sup dan snack, berisi CO2 padat 10-15 kg untuk sekali proses

iradiasi.

Pada tahap pra-iradiasi, masing-masing bahan diolah ke dalam bentuk

produk siap santap, termasuk tahap pemanasan guna mengaktivasi enzim

autolitik, dilanjutkan dengan pengemasan, yaitu menggunakan kantung

laminasi tersebut dengan teknik vakum untuk mengurangi oksidasi lemak.

Iradiasi pangan siap saji dilakukan dengan suhu proses sekitar -50°C dengan

cara menggunakan CO2 padat (-79°C) yang diletakkan di dalam kotak

styrofoam berisi pangan siap saji. Teknik radiasi tersebut ditujukan untuk

mengeliminasi spora bakteri Clostridium botulinum dan bakteri pembentuk

spora lain seperti Bacillus spp. yang bersifat patogen, tanpa menurunkan

kualitas produk akhir. Diagram alir aplikasi radiasi pengion dari sumber

radionuklida kobalt-60 pada dosis 45 kGy pada pangan olahan siap saji

(produk berbasis ikan, daging sapi dan unggas) disajikan pada gambar 1.

32

Gambar 2. Diagram alir aplikasi radiasi pengion dari sumber radionuklida kobalt-

60 pada dosis 45 kGy terhadap pangan olahan siap saji (produk

berbasis daging) (Irawati, 2009).

Berdasarkan studi Irawati et al. (2000), hasil pengukuran kadar air, protein, lemak

dan pH rendang iradiasi yang disimpan sampai dengan 18 bulan pada suhu ruang

dapat dilihat pada tabel 2.

- Bahan baku yang digunakan: daging

sapi

- Bumbu

- Air

Tahap pembuatan pangan olahan sesuai resep masing-masing

Masing-masing dimasukkan dalam kondisi panas ke dalam

kantong laminasi PET/Al-foil/LLDPE (@ kemasan 300g)

kemudian divakum 80%

Dibekukan pada suhu -18°C selama 48 jam

Kotak styrofam + CO2 padat

Diiradiasi dengan dosis 45 kGy

Dikondisikan sampai sisa CO2 padat habis

kemudian produk dipindahkan dan disimpan pada

suhu 28-30°C

33

Tabel 2. Hasil pengukuran kadar air, protein, lemak dan pH rendang iradiasi

yang disimpan sampai dengan 18 bulan pada suhu ruang

Waktu

penyimpanan

(bulan)

Kadar air

(%)

Kadar protein

(%)

Kadar lemak

(%)

pH

0 59,23 16,35 27,15 6,50

6 57,20 16,20 27,00 5,70

12 56,70 16,13 26,85 5,35

18 55,55 15,93 26,50 5,30

V. RADIKAL BEBAS

Radikal bebas adalah spesies kimia yang mengandung satu atau lebih

elektron yang tidak berpasangan. Definisi tersebut dapat secara luas diartikan

dan tidak menunjukkan secara spesifik mengenai letak elektron yang tidak

berpasangan. Definisi demikian lebih disukai sebab kebanyakan ion logam

transisi dapat juga diklasifikasikan sebagai radikal bebas sehingga hubungan

erat antara oksigen dan ion logam reaktif lebih mudah dimengerti (Gutteridge,

1995).

Baik anion superoksida dan radikal hidroksi merupakan radikal bebas

yang memiliki potensi bereaksi dengan makromolekul biologis dan kemudian

memicu kerusakan jaringan. Hidrogen peroksida (H2O2) itu sendiri merupakan

agen pengoksidasi yang lemah, tetapi dengan adanya ion logam transisi seperti

besi, anion superoksida mengubah ferri menjadi ferro, yang kemudian dapat

bereaksi dengan H2O2 untuk menghasilkan hidroksi radikal yang lebih reaktif.

Reaksi berantai radikal bebas pada sistem hidup adalah peroksidasi lipida

yang diperantarai oleh radikal bebas oksigen dan dipercaya merupakan

penyebab penting perusakan membran sel dan kerusakan sel (Yoshikawa et

al., 1997).

Menurut Morello et al. (2002), pembentukan dan reaksi radikal sangat

berkaitan. Skema umum dari autoksidasi lipida – inisiasi, propagasi dan

terminasi – menyediakan sebuah kerangka reaksi radikal pada umumnya.

34

Inisiasi : pembentukan sumber primer radikal biasanya terjadi

akibat pembelahan homolitik (homolytic fission), foto-eksitasi dan

reaksi redoks yang dibantu ion logam transisi.

Propagasi: reaksi radikal-molekul menghasilkan produk reaksi

terkarakterisasi. Reaksi ini meliputi abstraksi, substitusi, adisi dan

fragmentasi.

Terminasi: Reaksi radikal-radikal akan saling menetralkan. Reaksi

meliputi penggabungan dan disproporsionasi.

Saat ini, telah banyak diketahui berbagai peran radikal bebas in vivo.

Beberapa merupakan peran negatif dan lainnya adalah peran positif. Telah

diketahui bahwa radikal superoksida anion memiliki peranan penting dalam

fagositosis. Radikal bebas juga memiliki peranan penting dalam transduksi

sinyal dan menginduksi apoptosis yang memicu kematian sel terprogram.

Keterlibatan radikal bebas sering ditunjukkan dalam oksidasi enzimatis asam-

asam lemak misalnya oleh lipoksigenase. Salah satu karakteristik reaksi

radikal bebas adalah situs serangan radikal seringnya tidak bersifat selektif

tetapi acak. Semakin reaktif suatu radikal, maka ia menjadi semakin tidak

selektif. Sebagai contoh, radikal hidroksi menyerang hampir semua molekul

secara acak. Di sisi lain, radikal peroksi lebih tidak reaktif dan menyerang

molekul secara lebih selektif. Radikal bebas menyerang lipida, gula, protein

dan DNA untuk menginduksi oksidasi dengan mekanisme berantai yang

menyebabkan kerusakan membran, modifikasi protein, deaktivasi enzim, dan

kerusakan DNA. Kerusakan-kerusakan tersebut pada akhirnya akan

menyebabkan berbagai penyakit, kanker, dan penuaan (Niki, 1997).

Lipida, asam nukleat, enzim dan protein merupakan molekul target

penting dari kerusakan biologis yang disebabkan oleh radikal bebas oksigen.

Khususnya, asam lemak tidak jenuh yang berlokasi di bagian lipofilik pada

membran sel cenderung diserang oleh radikal oksigen yang menghasilkan

peroksida lemak melalui sebuah reaksi berantai dari peroksidasi lipida

(Yoshikawa et al., 1997). Tahap-tahap dalam peroksidasi lipida dapat dilihat

pada gambar 3.

35

Gambar 3. Tahapan peroksidasi lipida (Hatherill et al., 1911)

Protein dan penyusunnya rentan terhadap serangan OH• yang dihasilkan

dari H2O2 atau alkoksi lipida dan radikal peroksi sebagai konsekuensi

pembentukan radikal intermediet peroksidasi lipida. Salah satunya adalah

lisin, yang dapat dimodifikasi oleh produk stabil dari hasil peroksidasi lipida

seperti malonaldehida atau 4-hidroksinonenal (Evans, 1990).

Menurut Supari (1996), membran plasma merupakan tempat utama

reaksi radikal bebas, karena memiliki struktur yang terdiri dari asam lemak

tidak jenuh yang sangat mudah teroksidasi (lipid peroksidasi). Rusaknya asam

lemak tidak jenuh pada membran plasma akan mengganggu permeabilitas

membran dan radikal bebas semakin mudah masuk ke dalam sel dan

mempengaruhi atau bereaksi dengan organel yang terdapat di dalam sel.

Misalnya merusak lisosom, merusak inti sel, mengakibatkan kerusakan DNA

sehingga menimbulkan mutagenesis. Hal inilah yang mendasari patogenesis

kanker. Radikal bebas juga merusak karbohidrat di dalam sel, sehingga

merusak reseptor. Perusakan asam lemak tidak jenuh akan membentuk

36

aldehida (malonaldehida) dan hidroksinonenal, yang mengakibatkan

terjadinya ikatan silang (cross linkage) pada lipida, protein, fosfolipida dan

asam nukleat.

W. EFEK IRADIASI PADA KOMPONEN PANGAN

Iradiasi pada bahan apapun dapat menghasilkan deposisi energi pada

bahan yang diiradiasi. Energi yang terdeposisi ini dapat menyebabkan reaksi

kimia yang ditunjukkan oleh pembacaan pada dosimeter. Jika bahan yang

diiradiasi merupakan pangan, perubahan kimia dalam pangan tersebut dapat

diperkirakan kejadiannya akan terus meningkat berbanding lurus dengan

naiknya dosis iradiasi (Diehl, 1995). Perubahan kimia yang diinduksi proses

radiasi merupakan bagian yang penting dalam mengevaluasi keamanan

konsumsi pangan iradiasi, karena perubahan-perubahan ini mampu

menyebabkan radiolisis komponen penyusun bahan pangan.

Radiolisis air menghasilkan •OH, e-aq dan •H yang merupakan spesies

reaktif serta hidrogen dan hidrogen peroksida yang merupakan produk akhir

yang stabil. Hidrogen dan hidrogen peroksida dihasilkan dalam jumlah kecil,

meskipun pangan diiradiasi dengan dosis tinggi. Pembentukan hidrogen

peroksida, yang diketahui merupakan agen pengoksidasi, dianggap signifikan

dalam keamanan pangan iradiasi, meskipun sebenarnya tidak begitu

signifikan dibandingkan dengan pembentukan produk intermediet yang

sangat reaktif. Radikal hidroksil merupakan agen pengoksidasi yang kuat,

elektron terhidrasi merupakan agen pereduksi yang kuat, sementara atom

hidrogen adalah agen pereduksi yang kurang efektif. Karena semua bahan

pangan mengandung senyawa yang dapat dioksidasi maupun direduksi,

reaksi-reaksi reduksi maupun oksidasi terhadap bahan pangan mungkin saja

terjadi (Diehl, 1995).

Dengan keberadaan air, karbohidrat biasanya diserang oleh radikal

•OH, sementara elektron terlarut dan atom H hanya berperan kecil. Radikal

•OH memutus ikatan hydrogen C-H dan membentuk air. Bergantung pada

posisi molekuler C=O yang dibentuk melalui disproporsionasi atau dehidrasi,

37

produk akhirnya dapat berupa asam, keton, atau aldehida. Sebagai contoh,

produk radiolitik utama yang dihasilkan dari pati jagung yang diiradiasi

adalah asam format, asetaldehida, formaldehida, maltosa, aseton, metanol,

juga malonaldehida (Diehl, 1995).

Protein juga menjadi molekul target serangan radikal bebas. Sebagai

contoh, semua residu asam amino protein merupakan target serangan radikal

hidroksi yang diproduksi oleh radiasi pengion, meski beberapa residu

dihasilkan karena sebab lain. Radikal protein dibentuk oleh sebuah serangan

radikal yang menyebabkan pemotongan rantai polipeptida, ikatan silang

(crosslinking), oksidasi dan modifikasi asam amino. Perubahan

konformasional memicu meningkatnya kerentanan terhadap proteolisis dan

denaturasi panas juga kehilangan fungsi biologis (Niki, 1997).

Bagian lemak dari pangan didominasi oleh trigliserida. Dengan adanya

oksigen pada saat iradiasi, autooksidasi dipercepat dengan mekanisme yang

sama seperti autooksidasi akibat cahaya atau keberadaan logam. Jika udara

tidak dikeluarkan dari kemasan, maka peroksida dapat mencapai nilai tinggi.

Akan tetapi hal ini tidak berlaku pada pangan yang terdiri dari hanya sedikit

bagian lipida. Beberapa penelitian pada iradiasi daging menunjukkan bahwa

protein atau kemungkinan produk hasil interaksi antara karbohidrat dan

protein memberikan efek antioksidan yang meningkat dengan semakin

tingginya dosis iradiasi, sehingga dapat melindungi lipida dari perubahan

oksidatif (Diehl, 1995).

Beberapa penelitian lain pada iradiasi daging mentah menunjukkan

bahwa setelah proses iradiasi, nilai peroksida dan kadar malonaldehida

produk daging iradiasi lebih tinggi dibandingkan produk sejenis yang tidak

diiradiasi. Menurut Ahn dan Jo (1999a), radiasi pengion menghasilkan radikal

hidroksi dan dapat meningkatkan laju oksidasi lipida. Ketika molekul-

molekul menyerap energi ionisasi, maka akan menjadi sangat reaktif dan

membentuk ion atau radikal bebas. Ion dan radikal bebas ini kemudian akan

bereaksi dan membentuk produk radiolitik stabil. Senyawa volatil yang

menyebabkan off-odor pada daging iradiasi dihasilkan akibat iradiasi pada

38

molekul protein dan karbohidrat dan bukan merupakan hasil dari oksidasi

lipida.

X. KEAMANAN PANGAN

Dalam situasi praktis, yang menjadi faktor kritis bukanlah toksisitas

intrinsik dari suatu senyawa kimia, tetapi lebih kepada resiko bahaya yang

berhubungan dengan penggunaan senyawa tersebut. Dalam ilmu pangan dan

gizi, sangat penting untuk memahami konsep resiko dan keamanan relatif,

bahaya, dan toksisitas yang dihubungkan dengan konsumsi pangan. Resiko

merupakan adanya kemungkinan (probabilitas) bahwa suatu senyawa akan

menghasilkan bahaya dalam kondisi tertentu yang spesifik. Keamanan absolut,

di sisi lain, merupakan jaminan bahwa kerusakan atau cedera akibat

penggunaan suatu senyawa adalah tidak mungkin terjadi. Bagaimanapun,

keamanan mutlak tidak mungkin dapat dicapai, sehingga, konsep keamanan

relatif pun diperkenalkan (Hall, 1991). Keamanan pangan relatif kemudian

dapat didefinisikan sebagai kepastian praktis bahwa cedera atau kerusakan

tidak akan dihasilkan akibat konsumsi pangan atau ingredien yang digunakan

dalam pengolahan pangan dengan cara dan dalam jumlah yang dapat

dipertanggungjawabkan (Deshpande, 2002).

Keamanan pangan tidak hanya merujuk kepada pangan itu sendiri, tetapi juga

kepada orang yang mengonsumsi. Sebagai contoh, pangan yang dianggap

aman bagi sebagian besar orang ketika digunakan dengan cara dan dalam

jumlah yang dapat dipertanggungjawabkan dapat menjadi sangat toksik,

bahkan letal, bagi individu tertentu yang sensitif atau mempunyai alergi

(Deshpande, 2002).

Y. TOKSIKOLOGI IRADIASI

Pengertian keamanan pangan ditingkatkan dengan mendefinisikan dua

konsep dasar, toksisitas dan bahaya. Toksisitas dapat diartikan sebagai

kapasitas sebuah senyawa untuk menyebabkan bahaya atau cedera, baik kronis

39

maupun akut dalam kondisi apapun. Hal ini temasuk kapasitas untuk merusak

fetus yang sedang berkembang (teratogenisitas), mengubah kode genetik

(mutagenisitas), atau untuk menginduksi kanker (karsinogenisitas). Lebih

jauh, adanya penyimpangan apapun dari normal dilihat sebagai kemungkinan

efek negatif, meskipun perubahannya mungkin terlihat positif, misalnya

kenaikan laju pertumbuhan atau peningkatan penyerapan nutrien. Perubahan

diasumsikan negatif sampai dibuktikan menguntungkan (Deshpande, 2002).

Di sisi lain, bahaya merupakan probabilitas relatif bahwa kerusakan atau

cedera akan terjadi ketika senyawa yang digunakan dalam jumlah dan cara

yang disarankan. Pengujian keamanan suatu pangan atau ingredien harus tidak

didasarkan pada apakah pangan atau ingredien tersebut memiliki toksisitas

alami tapi berdasar pada apakah menghasilkan suatu bahaya atau tidak

(Deshpande, 2002).

Toksisitas suatu bahan dapat diartikan sebagai kapasitas bahan untuk

memicu terjadinya reaksi berkebalikan pada makhluk hidup. Dalam hal ini

berhubungan dengan timbulnya efek yang tidak diharapkan oleh tubuh (Vries,

1997).

Teknik pengujian toksisitas dapat diklasifikasikan menjadi 3 kategori

umum: teknik biologis atau bioassay, teknik yang didasarkan pada metode

kimia dan/atau fisik, dan teknik yang berdasar pada pengikatan nonkovalen

antara satu reaktan dengan reaktan yang lain. Teknik yang ketiga juga disebut

dengan binding assay. Teknik biologis atau bioassay mengukur respon yang

mengikuti pengaplikasian stimulus pada suatu sistem biologis. Stimulus yang

diaplikasikan direpresentasikan oleh standar atau sampel uji yang

mengandung senyawa yang aktif secara biologis atau analit. Sistem biologis

yang menerima stimulus mungkin merupakan organisme multiseluler, utuh,

seperti binatang atau tumbuhan; organ yang diisolasi atau jaringan dari

organisme multiseluler; atau sel utuh atau mikroorganisme. Keuntungan

teknik biologis adalah spesifitas umumnya untuk bentuk-bentuk analit yang

aktif secara biologis. Bioassay adalah metode analisis yang lebih disukai

ketika bahan uji mengandung campuran bentuk analit yang aktif maupun

inaktif yang tidak dapat dipisahkan secara efektif. Di sisi lain, analit mungkin

40

berada dalam berbagai bentuk aktif yang memengaruhi situs target yang sama

tetapi dengan aktivitas biologis yang berbeda dan ada dalam jumlah yang tidak

diketahui. Selain spesifisitas yang tinggi, uji biologis (bioassay) juga sangat

sensitif. Maka, uji biologis digunakan jika tidak ada metode alternatif lain

yang cocok dan tersedia (Deshpande, 2002).

Menurut Vries (1997), Pengujian toksisitas suatu senyawa dapat

dilakukan secara in vitro yaitu dengan menggunakan sel limfosit manusia.

Keuntungan pengujian secara in vitro adalah uji yang digunakan sangat

sensitif dan dampak yang ditimbulkan dapat dilihat langsung. Efek dari

ketoksikan suatu bahan dapat diamati dari seberapa banyak jumlah sel limfosit

yang mati bila dibandingkan dengan keadaan awal dan dengan mengamati

tingkat proliferasi sel limfosit.

Pada tahun 1980, Food and Agriculture Organization, International

Atomic Energy Agency dan World Health Organization (FAO/IAEA/WHO)

menyatakan bahwa iradiasi terhadap pangan dengan dosis rata-rata sampai

dengan 1 Mrad (10 kGy) tidak menunjukkan bahaya toksikologi dan tidak

menghasilkan perubahan nutrisi dan mikrobiologi khusus; sehingga pengujian

toksikologi bagi pangan yang demikian tidak diperlukan (WHO, 1981).

Selanjutnya, FDA mengusulkan bahwa pangan yang secara khusus diiradiasi

pada dosis tidak melebihi 100 krad dapat dianggap aman. Berdasarkan

Amandemen Bahan Tambahan Pangan (Food Additives Amendment) tahun

1958 terhadap Undang-Undang Federal Pangan, Obat-obatan dan Kosmetika

(Federal Food, Drug, and Cosmetic Act) tahun 1938, iradiasi diatur sebagai

bahan tambahan pangan. Industri yang menggunakan proses iradiasi harus

menggunakan sumber-sumber iradiasi yang disetujui oleh FDA, dijelaskan

dalam Code of Federal Regulations CFR (21 CFR 179.26): sinar gamma dari

unit kobalt-60 atau sesium-137 yang disegel, elektron yang diakselerasi dari

sumber mesin (<10 MeV), atau sinar X yang dihasilkan dari sumber mesin

(<5 MeV). Karena pengurangan patogen yang diinduksi iradiasi paling efektif

jika diterapkan setelah proses pengemasan, bahan pengemas juga harus

disetujui oleh FDA sebagai bahan pengemas yang aman selama kondisi

proses (Brewer, 2009).

41

Dosis maksimum yang diijinkan untuk daging tergantung pada jenis

dagingnya, daging unggas ataukah daging merah, dan apakah daging tersebut

hanya didinginkan atau dibekukan. Penggunaan iradiasi pada daging unggas

segar maupun beku disetujui pada tahun 1992 sementara untuk daging merah

disetujui pada tahun 1997 (FSIS, 1999). Untuk pengurangan patogen,

penggunaan dosis maksimum 4,5 kGy diperbolehkan untuk daging mentah

yang dibekukan; 3,0 kGy diperbolehkan untuk daging unggas segar atau beku

(Brewer, 2009).

Sementara itu, iradiasi dengan dosis di atas 10 kGy (iradiasi dosis tinggi) pada

bahan pangan dinyatakan aman sebagaimana halnya proses sterilisasi termal

yang berlangsung sampai saat ini (WHO, 1999). Meskipun demikian, data

pendukung keamanan pangan khususnya hasil uji toksisitas makanan siap saji

iradiasi berbasis resep tradisional masih sangat terbatas khususnya di negara-

negara berkembang.

Z. OKSIDASI LEMAK

Komposisi asam lemak yang menyusun membran dan lipoprotein

awalnya ditentukan oleh jenis pangan yang dikonsumsi. Diketahui bahwa rata-

rata vegetarian memiliki asam-asam lemak tidak jenuh, orang yang banyak

memakan daging-dagingan memiliki asam arakidonat tinggi, dan orang yang

banyak mengonsumsi ikan memiliki asam lemak tidak jenuh lebih tinggi

seperti asam eikosapentaenoat (EPA) dan asam dokosahenoat (DHA) (Niki,

1997).

Asam lemak tidak jenuh yang memiliki dua atau lebih ikatan lebih

rentan terhadap serangan radikal bebas dan autooksidasi. Kemudahan relatif

dioksidasi dari asam lemak tidak jenuh meningkat seiring dengan jumlah

ikatan rangkap. Telah diamati bahwa asam arakidonat dioksidasi lebih cepat

daripada asam linoleat pada oksidasi yang diamati pada membran eritrosit dan

lipoprotein densitas rendah (Niki, 1997).

42

AA. MALONALDEHIDA

Menurut Bird dan Draper (1984), malonaldehida (MDA) merupakan

produk hasil peroksidasi lipid dalam tubuh dan sebagai indeks ketengikan

oksidatif dalam makanan. Di dalam bahan biologi, malonaldehida terdapat

dalam bentuk bebas dan sebagai kompleks dengan unsur pokok lainnya di

dalam jaringan. Malonaldehida juga merupakan produk yang dihasilkan oleh

radikal bebas melalui reaksi ionisasi di dalam tubuh dan sebagai produk

samping biosintesis prostaglandin.

Asam lemak tak jenuh (ALTJ) sangat mudah mengalami proses

oksidasi. Karbon metilen antara dua ikatan rangkap ALTJ sangat sensitif

terhadap pengurangan hidrogen dan pembentukan senyawa radikal. Oksigen

dapat menyerang asam lemak yang telah kehilangan hidrogen, membentuk

senyawa radikal yang selanjutnya akan bereaksi dengan molekul lemak

lainnya dan menghasilkan antara lain senyawa aldehid dan keton. Senyawa

aldehida seperti hidroksialkenal, malonaldehida dan senyawa karbonil rantai

pendek lainnya telah diketahui bersifat toksik terhadap sel. Konsentrasi

malonaldehida dalam bahan biologi telah digunakan secara luas sebagai

indikator dan kerusakan oksidatif pada lemak tak jenuh sekaligus merupakan

indikator keberadaan radikal bebas (Zakaria, 1996)

Analisa malonaldehida merupakan analisa radikal bebas secara tidak

langsung dan merupakan analisa yang cukup mudah untuk menentukan

jumlah radikal bebas yang terbentuk. Analisa radikal bebas secara langsung

sangat sulit dilakukan, karena radikal ini merupakan senyawa yang tidak stabil

dan cenderung untuk merebut elektron senyawa lain agar menjadi lebih stabil.

Reaksi ini berlangsung sangat cepat sehingga pengukurannya sangat sulit bila

dalam bentuk senyawa radikal bebas (Gutteridge, 1995).

Menurut Conti et al. (1991), analisa jumlah MDA dapat menggunakan

metode TBA. MDA dapat bereaksi dengan TBA membentuk senyawa

kompleks MDA-TBA melalui reaksi nucleophilic addition reaction. Kompleks

senyawa MDA-TBA yang terbentuk memiliki warna merah jambu yang dapat

diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm.

43

Reaksi pembentukan kompleks MDA-TBA pada metode pengukuran kadar

malonaldehida dapat dilihat pada gambar 4.

Gambar 4. Reaksi pembentukan kompleks MDA-TBA (Anonim, 2009a)

BB. KULTUR SEL

Kultur sel merupakan teknik yang biasa digunakan untuk

mengembangbiakkan sel di luar tubuh atau in vitro. Pada kultur sel, kondisi

kultur sel dibuat semirip mungkin dengan keadaan lingkungan awal di dalam

tubuh. Hal ini dimaksudkan untuk mempertahankan spesifitas sel. Keuntungan

penggunaan kultur sel adalah lingkungan tempat hidup sel dapat dikontrol,

seperti pH, tekanan osmosis, CO2 dan O2 sehingga kondisi fisiologis dari

kultur relatif konstan. Salah satu kelemahan dari teknik ini, yaitu kultur sel

harus dilakukan dalam kondisi steril (Freshney, 1994).

Menurut Malole (1990), faktor yang mendukung pertumbuhan sel dalam

kultur adalah media pertumbuhan. Pemilihan medium merupakan langkah

yang penting di dalam teknik kultur sel. Fungsi utama kultur sel adalah untuk

bertahan hidup dan juga menyediakan substansi-substansi yang tidak dapat

disintesa oleh sel itu sendiri. Selain itu, media kultur sel berfungsi

mempertahankan pH dan osmolalitas esensial untuk viabilitas sel dan juga

menyediakan nutrisi dan energi yang dibutuhkan untuk multiplikasi dan

pertumbuhan sel.

Media dipilih berdasarkan kandungan zat gizi yang disesuaikan dengan

jenis sel yang akan ditumbuhkan (Davis, 1994). Namun, sampai saat ini media

yang paling banyak dipakai adalah RPMI-1640 yang merupakan media sintetis

yang kaya nutrisi dan merupakan media terbaik untuk menumbuhkan limfosit

tikus dan limfosit manusia untuk jangka pendek (Freshney, 1994). Kandungan

44

lengkap RPMI-1640 dapat dilihat pada lampiran 1 dan kandungan medium

PBS dapat dilihat di lampiran 2.

Pertumbuhan sel memerlukan kondisi lingkungan yang mendukung,

seperti pH lingkungan 7,4, pH di bawah 6,8 biasanya menghambat

pertumbuhan sel, temperatur 37°C, konsentrasi oksigen 95%, serta konsentrasi

karbon dioksida 5%. Pengaturan pH lingkungan yang stabil dilakukan dengan

penambahan sodium bikarbonat. Media yang mengandung buffer bikarbonat

akan membutuhkan fase gas yang mengandung CO2 untuk mempertahankan

kondisi pH tersebut, sedangkan oksigen tetap menjadi faktor utama yang

dibutuhkan sel agar dapat berkembang biak secara normal pada kondisi aerob.

Pengaturan suhu, konsentrasi gas oksigen dan karbon dioksida tersebut untuk

menyamakan kondisi media kultur seperti kondisi di dalam tubuh (Freshney,

1992).

Harrison dan Rae (1997) menyatakan fungsi penambahan sodium

bikarbonat yaitu mempertahankan pH, mempertahankan tekanan osmotik dan

menyediakan sumber energi melalui reaksi:

NaHCO3 + H2O

Na+ +HCO3- + H2O

Na+ + H2CO3 + OH

-

Na++ OH

- + H2O + CO2 kebasaan meningkat

Salah satu kelemahan penggunaan sodium bikarbonat adalah

membutuhkan campuran gas 5% atau 10% CO2 dalam 95% atau 90% udara

untuk ekuilibrasi.

Sistem buffer normal dalam media kultur merupakan sistem karbon

dioksida-bikarbonat yang analog dengan yang terjadi dalam darah. Sistem ini

merupakan sistem buffer yang lemah di mana pKanya di bawah kondisi

optimum fisiologis, sehingga membutuhkan penambahan karbon dioksida

pada headspace di atas medium untuk mencegah kehilangan karbon dioksida

dan kenaikan ion hidroksil. Kapasitas buffer medium ditingkatkan dengan

fosfat yang ada dalam balanced salt solution (BSS) (Freshney, 1992)

Penyebab kontaminasi yang paling sering terjadi adalah kegagalan

dalam menerapkan teknik aseptis yang digabung dengan kepercayaan yang

45

berlebihan pada efektifitas antibiotik. Antibiotik yang paling sering digunakan

adalah campuran penisilin dan streptomisin, meskipun ada masalah dalam

menggunakan campuran ini secara kontinu dengan alur sel yang dipertahankan

dalam jangka waktu lama. Antibiotik lain yang juga sering digunakan adalah

gentamisin (50-100 µg/ml), kanamisin (100 µg/ml) dan kloramfenikol (5

µg/ml) (Harrison dan Rae, 1997).

CC. DARAH

Darah adalah suspensi yang terdiri dari elemen-elemen atau sel-sel, dan

plasma yaitu larutan yang mengandung berbagai molekul organik dan

anorganik (Williams, 1987). Menurut Carpenter (1975), jumlah total darah

dalam tubuh hewan yang normal adalah 1/12 berat tubuhnya, sedangkan pada

manusia dewasa rata-rata memiliki volume 12-14 pints (6,816-7,952 liter).

Menurut Eurell (2004), di dalam tubuh manusia terdapat tiga jenis sel

darah, yaitu sel darah merah (eritrosit), sel darah putih (leukosit), dan keping

darah (trombosit). Sel darah merah menyusun sedikitnya 45% dari total

volume darah, sedangkan sel darah putih yang tersusun atas neutrofil, basofil,

eosinofil, limfosit dan monosit menyusun kurang dari 1% dari seluruh total

volume darah. Komposisi elemen seluler darah manusia dapat dilihat pada

tabel 3.

46

Tabel 3. Komposisi elemen seluler darah manusia (Ganong, 1990 ; Shier et

al., 2002*)

Elemen seluler Rata-rata

sel/ml

Kisaran normal

(/mm3darah)

% dari leukosit

normal

1. Leukosit

Granulosit

Neutrofil

Eosinofil

Basofil

Agranulosit

Limfosit

Monosit

9,00 x 103

5,40 x 103

2,75 x 102

35

2,750 x 103

5,40 x 102

4,00-11,00 x 103

3,00-6,00 x 103

1,50-3,00 x 102

0-100

1,50-4,0 x 103

3,00-6,00 x 102

-

50-70

1-4

0,4

20-40

2-8

2. Eritrosit

Laki-laki

Wanita

5,4 x 106

4,8 x 106

4,6-6,2 x 106*

4,2-5,4 x 106*

-

-

3. Platelet 300.000 1,5-3,5 x 105 -

DD. LIMFOSIT

Limfosit dibawa ke hampir semua jaringan dan organ vertebrata tingkat

tinggi lewat dua jaringan sirkulasi, darah dan sistem limfa. Limfosit terdapat

sebanyak 20-80% dari sel bernukleasi dalam darah dan lebih dari 99% dalam

cairan limfatik (limfa) (Weissman et al., 1978).

Limfosit merupakan bagian dari sel darah putih yang bersifat

agranulosit, berukuran kecil, berbentuk bulat dengan diameter 7-12 µm dan

banyak terdapat pada organ limfoid seperti limpa, kelenjar limfe dan timus.

Sel ini merupakan inti dalam proses respon imun spesifik karena sel-sel

limfosit dapat mengenal setiap jenis antigen, baik antigen yang terdapat pada

intraseluler maupun ekstraseluler (Kresno, 1996).

Guyton dan Hall (2006) mengatakan bahwa limfosit manusia berjumlah

sekitar 30% dari jumlah normal sel darah putih. Limfosit dapat membentuk

ratusan jenis antibodi dan limfosit sensitif yang berbeda-beda. Masing-masing

47

jenis sifatnya spesifik untuk suatu antigen yang khusus dan tiap jenisnya dapat

menggandakan diri mencapai jumlah yang sangat besar apabila distimulasi

oleh antigen spesifik yang jumlahnya cukup.

Limfosit dibentuk di dalam sumsum tulang dan berdiferensiasi menjadi

sel limfosit T dan limfosit B. Secara umum, limfosit dapat dibagi menjadi 3

kelompok utama, yaitu sel B, sel T dan sel natural killer (NK). Sel B dan sel T

memiliki reseptor pada permukaan yang mampu mengenal antigen tertentu,

sedangkan sel NK tidak memiliki reseptor untuk mengenal antigen. Pada

manusia normal, sel limfosit B berjumlah 5-15% dan sel limfosit T berjumlah

sekitar 65-80% dari jumlah limfosit dalam tubuh. Kedua sel tersebut berperan

sebagai respon spesifik di mana sel B berperan di dalam respon imun humoral

dan sel T berfungsi dalam sistem imun seluler, sedangkan sel natural killer

berperan dalam respon imun nonspesifik (Harris, 1991).

a. Limfosit T (sel T)

Limfosit T berasal dari sel hematopoetik di sumsum tulang belakang,

sel ini kemudian pindah ke timus dan menjadi dewasa. Di organ timus sel

T sangat cepat membelah diri. Pada proses pendewasaannya, sel ini

mengalami diferensiasi menjadi Thelper (Th) Tsuppresor (Ts) dan

Tcytotoxic (Tc) (Bellanti, 1993). Thelper dapat dibedakan dari Tcytotoxic

pada adanya glikoprotein yang berbeda pada permukaan membran mereka.

Sel T yang memiliki CD4 berfungsi sebagai TH sedangkan sel T dengan

CD8 pada permukaannya berfungsi sebagai TC. Sel berproliferasi menjadi

sel T memori dan berbagai sel efektor yang mensekresi berbagai limfokin.

Limfokin ini berpengaruh pada aktivasi sel B, sel Tc, sel NK dan sel lain

yang terlibat dalam respon imun (Roitt, 1991)

b. Limfosit B (sel B)

Limfosit B dewasa di sumsum tulang dan meninggalkan sumsum

tulang dengan mengekspresikan sebuah reseptor pengikatan antigen yang

unik pada membrannya. Reseptor sel B merupakan molekul antibodi

terikat membran. Ketika sebuah sel B naif, yang belum bertemu antigen,

bertemu dengan antigen yang memiliki antibodi terikat membran spesifik

untuk pertama kalinya, sel akan mulai membelah dengan cepat.

48

Progeninya akan berdiferensiasi menjadi sel B memori dan sel B efektor

yang disebut dengan sel plasma.

Sel B memori memiliki waktu hidup lebih lama dan terus

mengekspresikan antibodi terikat membrannya dengan spesifisitas yang

sama seperti B sel naif awalnya. Sel plasma tidak mengekspresikan

antibodi terikat membran dalam bentuk yang dapat disekresi. Meskipun sel

plasma hanya hidup beberapa hari, namun sel-sel ini dapat mensekresikan

antibodi dalam jumlah besar selama hidup. Diperkirakan bahwa satu sel

plasma dapat mensekresikan lebih dari 2000 molekul antibodi per detik.

Antibodi yang disekresi merupakan molekul efektor yang penting dalam

imunitas humoral (Kuby, 1997).

EE. PROLIFERASI SEL LIMFOSIT

Respon proliferasi limfosit pada sistem in vitro digunakan untuk

menggambarkan fungsi limfosit dan status imun individu. Proliferasi

merupakan fungsi biologis, yaitu proses diferensiasi dan pembelahan sel

secara mitosis (Fletcher et al., 1994). Sel limfosit juga dapat berproliferasi

secara nonspesifik jika dikultur dengan senyawa mitogen (Zakaria et al.,1992)

sehingga banyak dipakai untuk menguji aktivitas sel limfosit.

Menurut Kuby (1997), mitogen merupakan agen yang dapat

menginduksi pembelahan sel B atau T dengan persentase tinggi. Tidak seperti

imunogen, yang hanya mengaktivasi reseptor limfosit yang spesifik untuk

imunogen tersebut, sebuah mitogen dapat mengaktivasi banyak klon sel B atau

T tanpa melihat spesifitas antigennya. Karena kemampuannya ini, mitogen

dikenal sebagai aktivator poliklonal.

Beberapa jenis mitogen yang umum merupakan protein yang mengikat

gula yang disebut lektin, yang mengikat secara spesifik glikoprotein pada

permukaan berbagai sel, termasuk limfosit. Pengikatan molekul lektin ke

glikoprotein membran sering memicu aglutinasi, atau pengklusteran sel, yang

kemudian mungkin memicu aktivasi seluler dan proliferasi. Beberapa jenis

mitogen yang digunakan untuk menstimulasi aktivitas proliferasi sel limfosit

49

adalah pokeweed (PWM), fitohemaglutinin (PHA), concanavalin A (Con A),

dan lipopolisakarida (LPS) bakteri gram negatif. PHA, Con A dan PWM

adalah lektin. Terdapat sejumlah mitogen yang hanya dapat mengaktivasi sel

limfosit B atau sel limfosit T saja dan ada pula yang dapat mengaktivasi

populasi keduanya. Pokeweed merupakan jenis mitogen yang mampu

mengaktivasi kedua jenis sel limfosit B dan T. Mitogen PHA dan Con A dapat

merangsang transformasi blast subpopulasi sel T. Sementara LPS akan

bereaksi dengan membran plasma sel B dan menghasilkan aktivitas seluler

(Ganong, 1979).

PWM bersumber dari tanaman pokeweed (Phytolacca americana)

dengan struktur molekul polimerik dengan ligan di N-asetilkitobiose,

sementara Con A bersumber dari jack bean dan PHA bersumber dari kacang

merah (kidney bean). Baik Con A maupun PHA memiliki struktur molekul

tetramer (Kuby, 1997).

FF. MTT ASSAY

Teknik yang sangat luas digunakan melibatkan penggunaan garam

tetrazolium (MTT atau [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide] yang dimetabolisme menjadi garam formazan berwarna oleh

aktivitas enzim mitokondria pada sel hidup. Metode ini pertama kali

digunakan pada tahun 1983 sebagai metode kolorimetri yang cepat untuk

penelitian bidang imunologi dan modifikasi penggunaan metode ini telah

banyak diaplikasikan. Teknik ini sangat berguna khususnya untuk menguji

suspensi sel karena spesifisitasnya terhadap sel hidup. Pertimbangan ini tidak

begitu penting pada kultur monolayer karena sel mati kehilangan sifat

menyerapnya. Salah satu kelemahan teknik ini adalah keharusan untuk

menggunakan sel tidak tetap (unfixed cells) yang mungkin menyebabkan

keterbatasan waktu. Teknik ini memiliki potensi untuk digunakan dalam

pengujian sensitivitas obat pada tumor manusia, dan laporan-laporan awal

mengenai penelitian tersebut menunjukkan hasil yang memuaskan. Beberapa

publikasi terbaru menyebutkan beberapa masalah teknis yang memengaruhi

50

interpretasi hasil pengujian yang harus dipertimbangkan ketika merencanakan

protokol pengujian. Hal ini termasuk kemungkinan aktivitas enzim

mitokondria pada sel yang diberi perlakuan obat dan efek pengkondisian

medium oleh sel pada saat produksi formazan. Spektrum absorpsi MTT-

formazan juga diketahui tergantung pada pH dan kerapatan sel, namun sebuah

metode telah diperjelas dan mampu menjawab permasalahan dan

meningkatkan linearitas hubungan antara MTT-formazan dan kerapatan sel

khususnya pada jumlah sel yang besar (Freshney, 1992).

Uji MTT tetrazolium merupakan salah satu metode analisis kolorimetrik

untuk mengukur viabilitas sel yang paling banyak digunakan, karena MTT

dapat diubah menjadi kristal biru formazan yang tidak larut air oleh aktivitas

enzim dehidrogenase di dalam sel hidup, kemudian OD formazan secara tidak

langsung akan menunjukkan jumlah sel yang hidup. Bagaimanapun, telah

diketahui juga bahwa reliabilitas dan sensitivitas metode ini dipengaruhi oleh

berbagai faktor diantaranya volume sel, antioksidan dan senyawa berwarna

lainnya (Wang et al., 2006) .

Enzim suksinat dehidrogenase adalah salah satu enzim yang berperan

aktif selama proses respirasi seluler secara aerobik. Enzim suksinat

dehidrogenase merupakan flavoprotein yang mengandung protein dengan

ikatan Fe (besi) dan S (belerang). Enzim ini terikat pada bagian membran

mitokondria yang berfungsi sebagai reduktor selama tahapan siklus Krebs dan

transport elektron. Pada siklus Krebs, enzim ini menerima hidrogen dari

suksinat dan bertugas menghidrogenasi suksinat menjadi fumarat serta

menghasilkan FADH2. FADH2 yang dibentuk akan mengalami reoksidasi

pada rantai transport elektron yang berkaitan erat dengan pembentukan energi

(ATP) dalam proses fosforilasi oksidatif (Lehninger, 1982).

Suksinat dehidrogenase merupakan satu-satunya enzim terikat membran

dalam siklus asam sitrat, lainnya adalah komponen matriks mitokondria,

sehingga enzim ini ditempatkan untuk menyalurkan elektron secara langsung

ke mekanisme transpor elektron pada membrane mitokondria (Voet et al.,

2006).

51

Menurut Freimoser et al. (1999), MTT assay merupakan metode uji

viabilitas sel kuantitatif yang lebih praktis, cepat dan efisien dengan hasil yang

cukup akurat dibandingkan dengan menggunakan metode pewarnaan tripan

biru yang dilakukan secara manual pada pengujian sel fungi. Reduksi garam

tetrazolium merupakan cara yang dapat dipercaya untuk mendeterminasi

proliferasi sel limfosit. Garam tetrazolium MTT yang berwarna kuning

berkurang sebagai akibat proses metabolisme sel, terutama karena aktivitas

kerja enzim suksinat dehidrogenase. Kristal formazan tidak larut air berwarna

biru tua yang terbentuk dapat dilarutkan dengan pelarut organik seperti

isopropanol, etil asetat, dietil eter atau n-butanol dan kemudian diukur dengan

spectrophotometer microplate reader.

Sel yang berproliferasi aktif secara metabolik daripada sel yang tidak

berproliferasi (ada pada tahap istirahat), maka uji ini sesuai tidak hanya untuk

penentuan aktivasi sel dan proliferasi. Uji kolorimetrik merupakan uji yang

cepat dan mudah. Karena teknik ini tidak membutuhkan pencucian maupun

pemanenan sel, uji lengkap dari awal mikrokultur sampai analisis data dalam

sebuah ELISA plate reader dapat dilakukan pada lempeng mikrokultur yang

sama (Rode et al., 2009).

Reaksi reduksi pewarna MTT oleh enzim suksinat dehidrogenase yang

dihasilkan sel hidup dapat dilihat pada gambar 5.

Gambar 5. Reaksi reduksi pewarna MTT oleh enzim suksinat

dehidrogenase (The University of Queensland, 2009)

Kandungan enzim suksinat dehidrogenase relatif konstan di antara

berbagai sel dengan tipe spesifik sehingga jumlah formazan yang dihasilkan

52

dapat dipercaya berbanding lurus terhadap jumlah sel. Pengujian jumlah

proliferasi sel limfosit manusia menggunakan uji MTT dengan mengukur nilai

absorbansi yang akan digunakan untuk mendapatkan nilai indeks stimulasi

(I.S.). Metode ini sering digunakan untuk mengukur proliferasi sel dan

toksisitas sel. Semakin tinggi absorbansi maka semakin tinggi pula nilai

indeks stimulasi yang menandakan semakin banyak jumlah sel limfosit yang

hidup. Sebaliknya, semakin rendah absorbansi maka semakin rendah indeks

stimulasi yang berarti semakin banyak sel limfosit yang mati.

GG. ERITROSIT

Eritrosit adalah sel yang berukuran kecil dan berdiameter kira-kira 7,5

µm. Sel ini berbentuk lempeng bikonkaf yang artinya tipis di bagian tengah

dan tebal di bagian pinggir. Bentuknya yang khusus ini merupakan adaptasi

fungsi sel darah merah yaitu dalam mentranspor gas. Bentuknya menyebabkan

luas permukaan menjadi lebih besar di mana gas-gas dapat berdifusi. Selain

itu, membran selnya menjadi lebih dekat dengan molekul pembawa oksigen –

hemoglobin – dalam sel. Akibatnya, sel darah merah dapat dengan mudah

berubah bentuk ketika melewati kapiler. Pada pria normal, jumlah rata-rata sel

darah merah per milliliter kubik adalah 4.600.000-6.200.000 dan pada wanita

normal 4.200.000-5.400.000. Jumlah sel darah merah biasanya naik setelah

beberapa hari melakukan latihan berat atau jika sedang berada di tempat yang

lebih tinggi karena kenaikan jumlah oksigen yang dibutuhkan (Shier et al.,

2002). Pembentukan eritrosit merupakan subyek dari kontrol umpan balik.

Pembentukannya dihambat oleh kenaikan level sirkulasi sel darah merah

terhadap nilai supernormal dan distimulasi oleh anemia, juga distimulasi oleh

hipoksia dan kenaikan pada jumlah sel darah merah yang bersirkulasi

merupakan ciri umum karena aklimatisasi ketinggian (Ganong, 1990).

Karena fungsinya yang sangat penting di dalam tubuh dan

kerentanannya terhadap oksidasi, banyak sekali penelitian yang menggunakan

eritrosit sebagai model untuk mempelajari kerusakan oksidatif biomembran

dan pengaruh berbagai senyawa yang terdapat pada makanan, dalam

53

menghambat terjadinya kerusakan pada membran. Pada umumnya parameter

yang digunakan untuk mengetahui terjadinya kerusakan pada membran adalah

persentase hemolisis yang terjadi pada eritrosit. Semakin tinggi persentase

hemolisis yang terjadi menandakan semakin parahnya kerusakan yang terjadi

pada membran eritrosit, begitu pula sebaliknya, semakin rendah persentase

hemolisis yang terjadi menandakan semakin tahan membran sel terhadap

kerusakan (Amri, 2007).

Eritrosit dipilih sebagai model in vitro untuk mempelajari interaksi

oksidan/antioksidan karena membrannya kaya akan asam lemak tidak jenuh

yang sangat rentan terhadap peroksidasi yang diperantarai oleh radikal bebas,

dan dianggap dapat mewakili membran plasma secara umum (Shiva Shankar

Reddy et al., 2007).

HH. HEMOLISIS ERITROSIT

Hemolisis adalah pecahnya sel darah merah dan keluarnya hemoglobin

ke dalam plasma. Hemolisis eritrosit kemungkinan merupakan hasil akhir dari

kerusakan minor pada membran eritrosit. Integritas struktur membran

merupakan ciri penting resistansi eritrosit terhadap serangan peroksidatif

(Gratzer, 1981). Eritrosit juga rentan terhadap stres oksidatif karena adanya

fosfolipida membran yang tidak jenuh (Gain dan Shohet, 1981), paparan yang

terus menerus terhadap tensi oksigen tinggi dan adanya logam transisi dalam

jumlah berlebih yang dapat bertindak sebagai agen redoks (Pryor, 1976).

Adanya hemoglobin dan senyawa hematin lainnya mungkin juga

meningkatkan proses peroksidasi lipida (Tappel, 1953). Kerusakan sel darah

merah diperkirakan terjadi baik karena oksidasi membran atau denaturasi

hemoglobin (Hatherill et al., 1991).

Pada dasarnya ketika sel darah merah telah mencapai batas akhir masa

hidupnya, sekitar 120 hari, akan terjadi hemolisis secara alami. Proses ini

diawali dengan menurunnya volume sel hingga 13%, meningkatnya

sensitivitas membran sel karena faktor stress, menurunnya deformabilitas, dan

54

beberapa perubahan pada daya adhesi dan transpor membran (Bartosz, 1990).

Keadaan tersebut nantinya akan menuju kepada hemolisis sel darah merah.

Pengujian aktivitas antihemolisis pada sel darah merah dapat dilakukan

dengan penambahan larutan pengoksidasi seperti H2O2, senyawa-senyawa

aldehida seperti formaldehida, asetaldehida, atau glutaraldehida dan juga

aloksan (Rose dan Gyorgy, 1950)

II. ANTIOKSIDAN

Antioksidan adalah senyawa yang ketika berada dalam jumlah kecil,

dibandingkan dengan substrat yang dioksidasi, dapat menunda atau

menghambat oksidasi substrat. Antioksidan dapat beraksi pada beberapa

tahap berbeda dalam sebuah sekuensi oksidatif, sebagaimana diilustrasikan

dengan melihat oksidasi lipida yang terjadi di membran sel atau produk kaya

lipida. Antioksidan dapat bekerja dengan cara: a) membuang oksigen atau

menurunkan konsentrasi oksigen lokal; b) membuang ion logam katalitik; c)

membuang spesien kunci oksigen reaktif; d) mengikat radikal bebas yang

menginisiasi seperti spesies hidroksil, alkoksil dan peroksil; e) memutus

rantai sekuens yang telah diinisiasi; f) memecah atau mengikat oksigen

singlet (Gutteridge, 1995).

JJ. KOMPONEN BIOAKTIF DALAM BUMBU RENDANG

Dalam pembuatan rendang digunakan berbagai bumbu dan rempah,

seperti cabai merah, bawang merah, bawang putih, daun sereh, daun kencur,

daun jeruk, asam kandis, lengkuas dan jahe. Bumbu dan rempah ini juga

memiliki kandungan komponen bioaktif yang memiliki antioksidan dan

manfaat bagi kesehatan. Komponen bioaktif ini mungkin memiliki peran

membantu melawan radikal bebas yang mungkin ada pada pangan iradiasi.

55

1. Cabai merah (Capsicum anuum)

Cabai merah memiliki kandungan komponen capsaicin dan

dihidrocapsaicin yang memiliki peran dalam memberikan rasa pedas pada

cabai. Oleoresin dari cabe merah mengandung 6,38% capsaicin yang

kepedasannya setara dengan satu juta unit Scoville (Farrell, 1990).

2. Bawang Merah (Allium cepa L.)

Bawang merah (Allium cepa L.) diketahui memiliki banyak

komponen flavonoid seperti quercetin, kaempferol, yang ditemukan dalam

berbagai bentuk mono dan diglikosida, misalnya rutin (quercetin-3-

rutinoside). Selain itu, bawang merah memiliki banyak senyawa yang

mengandung sulfur yang volatil (Wetli, 2004), seperti alliin, and g-

glutamilsistein (Corzo-Martinez et al.., 2007). Senyawa bersulfur inilah

yang berperan sebagai antimikroba (Rose et al., 2005).

3. Bawang Putih (Allium sativum L.)

Bawang putih memiliki komponen bioaktif bersulfur yang tidak jauh

berbeda dengan bawang merah seperti ajoene, dan juga komponen lain

seperti b-chlorogenin dan quercetin (Rahman dan Lowe, 2006). DAS,

diallil sulfoksida (DASO), diallyl sulfone (DASO2), DADS, DATS, dan

SAC yang terdapat pada bawang putih memiliki aktivitas antikanker

(Sigounas et al., 1997).

4. Sereh (Cymbopogon citratus)

Pada penelitian yang dilakukan Yoo et al. (2008) didapatkan bahwa

sereh memiliki komponen fenolik dan flavonoid. Jumlah komponen

fenolik pada sereh sebesar 662,0 mg GAE/100 g, sementara jumlah

komponen flavonoid sebesar 300,5 mg CE/100 g. Berdasarkan penelitian

Figueirinha et al. (2008), komponen bioaktif yang terdapat pada sereh

adalah tannin, kafeat, turunan asam p-kumarat, dan glikosida flavon

(apigenin dan turunan luteolin).

56

5. Daun kunyit (Curcuma longa)

Kunyit mengandung senyawa kurkumin yang merupakan

antioksidan larut lemak yang kuat. Banyak studi telah membuktikan

aktivitas antioksidan kurkumin baik dalam sistem in vitro maupun in vivo.

Kurkumin memiliki karakteristik anti-inflamasi dan menunjukkan bahwa

komponen ini dapat menghambat peroksidasi lipida dalam berbagai model

uji hewan (Reddy dan Lokesh, 1994). Kurkumin dibiosintesis pada daun,

kemudian ditranspor ke rimpang kunyit untuk disimpan (Dixit dan

Srivastava, 2000).

6. Daun jeruk (Citrus aurantifolia)

Menurut studi Rasooli dan Razzaghi-Abyaneh (2004), minyak

esensial yang diekstrak dari daun jeruk memiliki aktivitas antifungi dan

antiaflatogenik. Senyawa-senyawa yang terkandung dalam minyak

esensial yang diekstrak dari daun jeruk adalah pinene, sabinene, myrcene,

telinene dan limonene. Senyawa dengan jumlah terbanyak pada minyak

esensial tersebut adalah limonene (85,5%).

7. Asam kandis (Garcinia xanthocymus)

Asam kandis merupakan tanaman yang termasuk keluarga Guttiferae

yang kaya akan xanthone, biflavonoid dan benzophenon (Sordat-Diserens

et al., 1989). Komponen bioaktif yang terdapat pada asam kandis adalah

xanthochymol, isoxanthochymol, volkensiflavone, morelloflavone, 1,5-

dihydroxyxanthone dan 1,7-dihydroxyxanthone (Karanjgoakar et al.,

1973).

8. Lengkuas (Alpinia galanga)

Seperti rempah lain, lengkuas kaya akan senyawa fenolik, seperti

flavonoid dan asam fenolat. Lengkuas memiliki komponen aktif kamfer,

galangi, galangol, eugenol, dan kurkumin (Muchtadi dan Sugiyono, 1992).

Menurut penelitian Mayachiew dan Devahastin (2008), ekstrak lengkuas

57

memiliki komponen aktif 1,8-cineole (20.95%), b-bisabolene (13.16%), b-

caryophyllene (17.95%) dan b-selinene (10.56%).

9. Jahe (Zingiber officinale)

Jahe memiliki komponen aktif, baik dalam bentuk volatil maupun

non-volatil. Komponen minyak yang volatil pada jahe utamanya terdiri

dari hidrokarbon sesquiterpen, yang didominasi zingeberene (35%),

curcumene (18%) dan farnesene (10%), dan l-bisabolene dan b-

sesquiphellandrene dengan jumlah lebih kecil. Persentase lebih kecil

terdiri dari dari 40 hidrokarbon monoterpenoid yaitu 1,8-cineole, linalool,

borneol, neral, dan geraniol yang memiliki jumlah paling banyak

(Govindarajan, 1982). Konstituen ini berkontribusi kepada aroma dan rasa

khas dari jahe.

Komponen non-volatil jahe seperti gingerol, shogaol, paradol, dan

zingerone menghasilkan sensasi pedas di mulut. Gingerol, yang terdiri dari

beberapa senyawa homolog kimia yang dibedakan oleh panjangnya rantai

alkil tak bercabang diidentifikasi sebagai komponen aktif dengan jumlah

terbesar pada rimpang segarnya (Govindarajan, 1982). Shogaol, bentuk

terdehidrasi dari gingerol, merupakan konstituen dominan jahe kering

(Connell and Sutherland, 1969). Paradol mirip gingerol dan merupakan

hasil hidrogenasi shogaol. Selain komponen tersebut, rimpang jahe juga

mengandung enzim proteolitik potensial yang disebut zingibain. Jahe

memiliki aktivitas antikanker, antioksidatif dan antimutagenik (Shukla dan

Singh, 2007).