Laporan Praktikum ke-3

IDENTIFIKASI MIKROORGANISME DENGANBEBRAPA TEKNIK PEWARNAAN

Praktikan:

Nama : Muhammad Agil Adhitrya PutraNPM : 2011210161Kelas : DKelompok : 5

LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PANCASILA

JAKARTA 2012

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangMikroorganisme atau mikroba adalah organisme yang berukuran sangat kecil sehingga untuk mengamatinya diperlukan alat bantuan. Mikroorganisme disebut juga organisme mikroskopik. Mikroorganisme seringkali bersel tunggal (uniseluler) maupun bersel banyak (multiseluler). Namun, beberapa protista bersel tunggal masih terlihat oleh mata telanjang dan ada beberapa spesies multisel tidak terlihat mata telanjang. Virus juga termasuk ke dalam mikroorganisme meskipun tidak bersifat seluler. (http://id.wikipedia.org, diakses pada 30/09/2012 pukul 17.00)

Nama bakteri mengandung informasi mengenai bakteri tersebut. Misalnya genus Staphylococcus menunjukkan bahwa bakteri adalah gram positif berbentuk kokus (bulat) yang berkelompok bersama dalam bentuk seperti anggur, dan nama spesies (disebut sp. bila tunggal, atau spp. bila jamak) seperti aureus berarti koloninya berwarna emas. Namun demikian, terdapat beberapa strain berbeda pada satu spesies yang sama. Terdapat banyak Escherichia coli yang berbeda, tidak semuanya bersifat patogen (menimbulkan penyakit), tetapi ada yang dapat menyebabkan keracunan makanan. Demikian pula dengan Staphylococus aureus dapat bersifat bakteri komensal yang tidak berbahaya pada kulit, tetapi jika bakteri resisten terhadap antibiotik dan berpindah ke pasien maka dapat menyebabkan infeksi yang fatal. Strain yang berbeda dari satu spesies tidak mungkin dibedakan hanya dari melihatnya melalui mikroskop. Bakteri harus dikultur atau ditumbuhkan dalam jumlah besar sehingga dapat dilakukan tes-tes untuk mengidentifikasi jenis bakteri. Identifikasi strain bakteri sangat penting saat mencoba untuk melacak asal terjadinya suatu epidemik. Tes laboratorium yang sering digunakan adalah menghitung jumlah total bakteri dalam 1 mL cairan sampel dan teknik pewarnaan untuk menunjukkan bukti infeksi, dari kultur murni atau dari potongan jaringan. (Joyce James,dkk, 2002)

1.2 Tujuan Praktikum1. Melakukan beberapa teknik pewarnaan untuk identifikasi dan pengelompokan

mikroorganisme2. Mengamati dan menganalisis hasil reaksi-reaksi pewarnaan di bawah mikroskop.

1.3 Manfaat Praktikum1. Memahami dan mampu melakukan beberapa teknik pewarnaan untuk identifikasi

dan pengelompokan mikroorganisme2. Memahami dan mampu mengamati serta menganalisis hasil reaksi-reaksi

pewarnaan dibawah mikroskop

BAB IISTUDI PUSTAKA

2.1 Pemeriksaan LangsungPemeriksaan langsung digunakan untuk mengamati pergerakan, dan pembelahan secara biner, mengamati bentuk dan ukuran sel yang alami, yang pada saat mengalami fiksasi panas serta selama proses pewarnaan mengakibatkan beberapa perubahan.

2.2 PewarnaanTeknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan.a. Untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan Gram, dan pewarnaan

acidfast/tahan asam untuk Mycobacterium.b. Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagel, pewarnaan kapsul,

pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae.

Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik. Caranya tidak sulit tetapi membutuhkan kehati-hatian dalam pembuatannya.(http://file.upi.edu/direktori/FPMIPA, diakses pada 30/09/2012 pukul 18.00)

2.2.1 Pewarnaan SederhanaPewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis zat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahanlainnya yang ada pada olesan yang diwarnai. Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, kristal violet dan karbol fuehsin (Entjang,2003)

2.2.2 Pewarnaan GramPewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut: zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan

Gambar 2.2.1 Pewarnaan Spora

zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. (http://id.wikipedia.org diakses pada 30/09/2012 pada pukul 18.30)

2.2.3 Pewarnaan SporaSpora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan. Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspora, perlu dilakukan pemanasan supaya indikator malachite hijau  bisa masuk ke dalam spora, seperti halnya pada pewarnaan  Basil Tahan Asam dimana indikator  carbol   fuschsin  harus dipanaskan untuk bisa menembus  lapisan lilin asam mycolic  dari Mycobacterium .

2.2.4 Pewarnaan KapsulPewarnaan selubung (kapsul) bertujuan untuk membedakan kapsul dari sel bakteri. Pewarnaan kapsul disebut juga sebagai pewarnaan negatif, karena materi yang akan dilihat (kapsul) tidak diwarnai, yang diwarnai adalah daerah latar belakang dan badan sel bakterinya. Kapsul tidak dapat diwarnai dengan pewarna asam maupun basa, karena kapsul adalah materi yang tidak memiliki muatan. Kapsul tidak dimiliki oleh semua bakteri. Bakteri yang memiliki kapsul umumnya adalah yang memiliki patogenitas yang tinggi, dimana kapsul tersebut melindungi sel bakteri dari mekanisme fagositosis sel inang. Pewarnaan kapsul lebih sulit dibandingkan pewarnaan yang lain karena kapsul adalah materi yang larut dalam air sehingga mungkin dapat hilang/tercuci dengan pembilasan yang berlebihan. Setelah diwarnai, kapsul akan tampak sebagai daerah bening yang mengelilingi sel bakteri.

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Alat dan BahanAlat yang digunakan pada praktikum ini adalah kaca benda (object glass) yang bersih, sengkelit/jarum ose, lampu spiritus, pipet tetes, penjepit kaca benda, mikroskop, kertas saring, corong, dan kertas lensa. Sedangkan bahan yang digunakan adalah biakan bakteri E. coli, S. aureus, B. subtilis, K. pneumoniae, S. typhii berumur 24 jam dengankerapatan 25% T dalam medium kaldu pepton atau dalam medium nutrien agar miring. Pereaksi dan zat warna yang digunakan adalah gentian violet, karbol fuchsin, air suling steril, metilen biru, larutan lugol, dan alkohol 96%.

3.2 Cara Kerja3.2.1 Penyiapan Preparat Apusan Bakteri

Siapkan kaca benda yang bersih. Lewatkan dulu diatas nyala api lampu spiritus untuk menghilangkan lemak-lemak yang masih menempel. Jarum ose atau sengkelit diflambir, biarkan selama 10 detik hingga dingin. Untuk membuat preparat apusan yang berasal dari biakan cair, ambil satu sengkelit biakan, kemudian tempatkan pada permukaan kaca benda yang bersih. Jika berasal dari biakan padat (agar miring), sebelumnya teteskan satu tetes air suling steril atau NaCl fisiologis steril pada permukaan kaca benda yang bersih, kemudian ambil satu sengkelit biakan dari agar miring dan suspensikan pada air suling yang ada pada permukaan benda tersebut. Ratakan biakan pada permukaan kaca benda dengan cara memutar jarum ose dengan putaran yang searah hingga diperoleh apusan yang tipis. Rekatkan (fiksasi) apusan bakteri dengan cara melewatkan preparat di atas nyala api lampu spiritus, hingga preparat membentu suatu lapisan tipis yang merekat pada kaca benda. Jangan memanaskan berlebihan karena akan merusak struktur bakteri.

3.2.2 Pewarnaan SederhanaPreparat yang telah dikeringkan dan difiksasi (direkatkan) diletakkan di tempat pewarnaan, dituangi zat warna yang telah disaring, misalnya: air metilen biru, gentian violet, atau karbol fuchsin yang ditipiskan 1:10. Diamkan selama 30-60 detik. Zat warna dibuang , bilas dengan air kran. Preparat dikeringkan diantara dua kertas saring diudara. Amati hasil pewarnaan.

3.2.3 Pewarnaan GramPreparat yang telah dikeringkan dan difiksasi (direkatkan) dituangi karbol gentian violet (pewarna primer), diamkan selama 5 menit. Zat warna dibuang preparat dituangi larutan lugol (berfungsi sebgai mordant, yaitu zat yang membentuk kompleks yang tak larut dengan mengikat pewarna primer), diamkan selama 45-60 detik. Preparat dimasukkan dalam silinder yang berisi alkohol 96% sambil digoyang-goyangkan selama 30 detik atau sampai tidak ada lagi zat warna yang luntur mengalir dari preparat. Bilas dengan air kran. Preparat dituangi dengan karbol fuchsin dan diamkan selama 1-2 menit. Zat warna dibuang, bilas dengan air kran, keringkan diantara kertas saring atau di udara, dan amati hasil pewarnaan.

3.2.4 Pewarnaan Spora

Buat suspensi pekat bakteri dalam 0,5 air garam 0,85% dalam tabung. Tambahkan karbol fuchsin sama banyaknya dengan NaCl tadi (0,5 mL). Panaskan diatas api kecil selama 6 menit. Buat preparat dari suspensi diatas, keringkan, rekatkan. Rendam dalam asam belerang 1% untuk membuang zat warna yang berlebihan selama 1-3 detik. Bilas dengan air kran. Tuang air metilen biru dan diamkan selama 2-4 menit. Zat warna dibuang, bilas dengan air kran, keringkan diatas kertas saring, atau diudara. Amati hasil pewarnaan.

3.2.5 Pewarnaan KapsulTeteskan NaCl 0,85% diatas alas kaca, kemudian tanamkan 1 mata sengkelit atau secukupnya biakan bakteri, campurkan. Letakkan di sebelah campuran tadi 1 tetes tinta cina. Campur tinta cina dengan bakteri, hapuskan dengan menggunakan alas kaca lain seperti membuat preparat rekatan darah. Keringkan, fiksasi/rekatkan dengan api. Tuang karbol funhsin yang telah ditipiskan 1:10, panaskan 1-2 detik atau dengan karbol thionin, diamkan selama 5-10 menit. Zat warna dibuang, bilas dengan air kran. Keringkan diantara kertas saring atau udara. Amati hasil pewarnaan.

BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil PengamatanTabel Pengamatan Pewarnaan Bakteri

Jenis Pewarnaan Gambar Keterangan

Pewarnaan Sederhana

Lampiran Gambar 4.1

Zat warna : gentian violetNama Bakteri : B. subtilisBentuk : bacillus / batangRangkaian : memanjang beruntun

Pewarnaan Gram

Lampiran Gambar 4.2

Nama bakteri : S. aureusBentuk : coccusRangkaian :bulat berkelompokWarna : UnguGram : +

Lampiran Gambar 4.3

Nama bakteri : E. coliBentuk : coccusRangkaian : bulat tunggalWarna : merahGram : -

Pewarnaan Kapsul Lampiran Gambar 4.4 Nama bakteri : K. pneumoniae

Pewarnaan Spora Lampiran Gambar 4.5

Nama bakteri : B. subtilisBentuk : bacillus / batangRangkaian : batang berkelompokLetak spora : pada ujung sel bakteri

4.2 Pembahasan

Pada teknik pewarnaan sederhana menggunakan bakteri B. subtilis yang diberi zat warna gentian violet sehingga mengahasilkan warna ungu pada bakteri saat diidentifikasi melalui mikroskop. Jika menggunakan zat warna metilen blue, maka akan memberikan warna biru pada bakteri dan untuk zat warna karbol fuchsin akan memberikan warna merah. Pewarnaan gram ditujukan untuk membagi bakteri kedalam 2 kelompok yaitu bakteri gram positif dan negatif.

Untuk pewarnaan bakteri gram positif, menggunakan bakteri S. aureus yang diberi zat warna gentian violet sehingga menghasilkan warna ungu pada bakteri pada saat pengamatan dan menunjukan bahwa bentuk dari bakteri tersebut adalah kokus. Sedangkan untuk bakteri gram negatif, menggunakan bakteri E. coli yang diberi zat warna gentian violet sehingga menghasilkan warna merah pada badan bakteri dan bentuk bakteri tersebut adalah basil/batang yang terlihat pada proses pengamatan.

Pewarnaan spora menggunakan bakteri B. subtilis dengan zat warna karbol fuchsin yang menghasilkan warna biru pada badang bakteri dan berwarna merah pada spora.

Dari hasil pengamatan dapat dilihat bahwa bentuk dari bakteri tersebut adalah bacillus dengan letak spora pada ujung sel bakteri. Untuk pewarnaan selubung (kapsul) menggunakan bakteri K. pneumonia yang memberikan warna merah pada badan bakteri dengan dasar berwarna hitam kemerahan yang berasal dari tinta cina yang digunakan.

BAB VKESIMPULAN

1. Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa ada 4 teknik pewarnaan yang dilakukan yaitu pewarnaan sederhana, gram, spora, dan kapsul.

2. Tiap zat warna yang digunakan pada percobaan akan menghasilkan warna yang berbeda pada badan bakteri.

3. Melakukan fiksasi terlebih dahulu mempunyai tujuan untuk menginaktivasi enzim yang mungkin dapat merusak morfologi bakteri sehingga sel tidak berubah saat proses pewarnaan.

Daftar Pustaka

Entjang I, 2003, Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Ke- perawatan, PT. Citra Aditya Bakti, Jakarta.

http://id.wikipedia.org, diakses pada 30/09/2012 pukul 17.00

http://file.upi.edu/direktori/FPMIPA, diakses pada 30/09/2012 pukul 18.00

James,Joyce,dkk.2002.Prinsip-prinsip Sains untuk Keperawatan.Jakarta:Erlangga Medical Series.

LAMPIRAN

Lampiran Gambar 4.1 Lampiran Gambar 4.2

Lampiran Gambar 4.3 Lampiran Gambar 4.4

Lampiran Gambar 4.5