Identifikasi forensic menggunakan komunitas bakteri di kulit

Penelitian terbaru telah menunjukkan bahwa variasi kulit terhadap koloni bakteri jauh lebih tinggi dari sebelumnya, dengan tingginya variasi didalam komposisi koloni bakteri. Kita menduga bahwa kita bisa menggunakan sisa bakteri yang ada dikulit untuk identifikasi forensik, pencocokan bakteri pada objek dengan bakteri yang ada dikulit individu yang menyentuh objek. Asosiasi kulit menunjukkan bahwa kulit yang ada bakteri dapat segera pulih dari permukaan (termasuk tombol komputer dan mouse komputer) dan bahwa struktur komunitas ini dapat digunakan untuk membedakan benda ditangan oleh individu yang berbeda, bahkan jika mereka telah menyentuh objek sampai 2 minggu pada suhu kamar. Selain itu, kami menunjukkan bahwa kami dapat menggunakan high-throughput pyrosequencing berbasis ap-proach untuk kuantitatif membandingkan koloni bakteri pada objek dan kulit untuk mencocokkan objek untuk individu dengan tingkat kepastian yang tinggi. Meskipun pekerjaan tambahan diperlukan untuk lebih membangun kegunaan dari alat itu, dalam pelajaran ini memperkenalkan pendekatan forensik yang akhirnya dapat digunakan secara independen untuk mengevaluasi hasil yang diperoleh dengan menggunakan praktek-praktek forensik lebih tradisional.

Kata kunci: bakteri forensik, microbiome manusia, pyrosequencing, kulit mikrobiologi, ekologi mikroba

Permukaan kulit manusia pelabuhan sejumlah besar bakteri yang dapat mudah copot dan dipindahkan ke permukaan setelah menyentuh, maka pentingnya kebersihan tangan yang benar oleh praktisi kesehatan (1,2). Bakteri kulit dapat bertahan pada permukaan menyentuh untuk waktu yang lama karena banyak yang sangat tahan terhadap tekanan lingkungan, termasuk kelembaban, suhu, dan radiasi UV (3, 4). Oleh karena itu, kita mungkin meninggalkan "jejak" terus-menerus dari kulit terkait bakteri pada permukaan dan benda-benda yang kita sentuh selama kegiatan sehari-hari.

Karya terbaru telah menunjukkan bahwa kulit-kami terkait komunitas bakteri secara mengejutkan beragam, dengan tingkat tinggi dari variabilitas antar-dalam komposisi komunitas bakteri di lokasi kulit tertentu (5-9). Sebagai contoh, hanya 13% dari phylotypes bakteri pada permukaan sawit dibagi antara dua individu (8), dan tingkat yang sama diferensiasi interpersonal diamati pada lokasi kulit lainnya (5, 9). Selain itu, kulit komunitas bakteri yang relatif stabil dari waktu ke waktu: komunitas permukaan sawit bakteri sembuh dalam waktu jam setelah mencuci tangan (8), dan, rata-rata, variasi interpersonal dalam komposisi komunitas melebihi variasi temporal dalam orang, bahkan ketika individu sampel berbulan-bulan terpisah (5, 9). Mengingat bahwa individu tampaknya pelabuhan pribadi yang unik, temporal stabil, dan dapat dipindahtangankan kulit terkait komunitas bakteri, kita hipotesis bahwa kita bisa menggunakan bakteri sebagai "sidik jari" untuk identifikasi forensik.

Untuk menunjukkan bahwa kita dapat menggunakan bakteri kulit untuk menghubungkan permukaan menyentuh kepada individu tertentu, kriteria berikut harus dipenuhi: (i) DNA bakteri pulih dari permukaan menyentuh memungkinkan untuk karakterisasi yang memadai dan perbandingan komunitas bakteri, (ii) kulit komunitas bakteri bertahan pada permukaan selama berhari-hari sampai berminggu-minggu, dan (iii) permukaan yang menyentuh dapat secara efektif terkait dengan individu dengan menilai tingkat kesamaan antara komunitas bakteri pada objek dan kulit individu yang menyentuh objek. Untuk membangun kriteria dan untuk menunjukkan kegunaan potensial dari pendekatan untuk

identifikasi forensik, kami melakukan tiga studi yang saling terkait yang menggabungkan perkembangan terakhir dalam analisis filogenetik masyarakat (10) dengan tinggi-throughput metode pyrosequencing (11). Pertama, kami membandingkan komunitas bakteri pada tombol individu dari tiga keyboard komputer untuk masyarakat ditemukan pada jari pemilik keyboard. Kedua, kami memeriksa kesamaan antara kulit terkait komunitas bakteri pada objek yang disimpan pada suhu -20 ° C (metode standar untuk menyimpan sampel sebelum ekstraksi DNA) dibandingkan benda-benda yang disimpan di bawah kondisi khas lingkungan dalam ruangan sampai 14 hari. Akhirnya, kami menghubungkan objek untuk individu tertentu dengan membandingkan bakteri pada tikus komputer mereka terhadap database yang berisi informasi komunitas bakteri selama lebih dari 250 permukaan tangan, termasuk tangan pemilik.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Untuk menetapkan kriteria i dan iii, kami diseka kunci individu dari tiga keyboard komputer pribadi dan dibandingkan masyarakat pada orang-orang kunci kepada masyarakat bakteri pada ujung jari dari kunci-board pemilik. Kami juga sampel kunci individu dari lain keyboard komputer privat dan publik sehingga kita bisa mengukur tingkat korespondensi antara komunitas bakteri pada jari pemilik dan keyboard dibandingkan keyboard lainnya tidak pernah tersentuh oleh orang tersebut. DNA bakteri diekstraksi dari penyeka, dan komposisi komunitas bakteri ditentukan dengan menggunakan prosedur pyrosequencing barcode dijelaskan sebelumnya (8), mendapatkan rata-rata lebih dari 1.400 urutan gen rRNA 16S bakteri per sampel. Kami menemukan bahwa komunitas bakteri pada ujung jari atau keyboard dari individu tertentu jauh lebih mirip satu sama lain daripada ujung jari atau keyboard dari orang lain (Gambar 1 dan Gambar. 2). Demikian juga, masyarakat bakteri dengan jari pemilik keyboard masing-masing menyerupai masyarakat pada keyboard pemilik (Gambar 1 dan Gambar. 2), yang menunjukkan bahwa perbedaan di keyboard-terkait masyarakat yang kemungkinan disebabkan oleh transfer langsung dari bakteri jari. Diskriminasi antara individu yang kuat dengan UniFrac unweighted metrik dibandingkan dengan metrik tertimbang, menunjukkan bahwa perbedaan dalam keanggotaan masyarakat (bukan struktur komunitas) membedakan terbaik di antara individu. Yang jelas pola dalam Gambar. 1 sudah dikonfirmasi oleh analisis ANOSIM, yang menunjukkan bahwa keyboard masing-masing pelabuhan komunitas bakteri yang berbeda, jari-terkait komunitas bakteri yang unik untuk masing-masing dari tiga orang, dan bahwa perbedaan interindividual di ujung jari dan masyarakat keyboard yang melebihi perbedaan antara komunitas bakteri pada jari-jari dan keyboard milik individu tertentu (Tabel S1). Bersama hasil ini menunjukkan bahwa DNA bakteri dapat pulih dari permukaan relatif kecil, bahwa komposisi keyboard terkait masyarakat yang berbeda di tiga keyboard, dan bahwa orang meninggalkan bakteri unik 'sidik jari' pada keyboard mereka.

Untuk studi 'keyboard' dijelaskan di atas, keyboard yang diseka 1-2 jam setelah terakhir kali disentuh. Untuk menunjukkan stabilitas jangka panjang temporal kulit terkait masyarakat pada permukaan nonskin, kami melakukan studi skala kecil untuk menilai bagaimana komunitas bakteri bisa berubah dalam komposisi setelah terpapar khas kondisi lingkungan dalam ruangan. Permukaan kulit dari dua individu yang diseka dan penyeka entah dibekukan segera di -20 ° C atau dibiarkan dalam wadah terbuka di bangku di laboratorium pada ≈ 20 ° C. Penyimpanan dalam kondisi ruangan yang khas memiliki sedikit atau tidak ada pengaruh pada komposisi komunitas bakteri, atau kemampuan untuk menyelesaikan perbedaan antara komunitas bakteri pada kulit dari dua individu, bahkan setelah dua

minggu (Gambar 3 dan Tabel S2). Hasil ini menunjukkan potensi utilitas dari pendekatan ini untuk identifikasi forensik mengingat bahwa, di bawah kondisi ruangan standar, kulit terkait bakteri bertahan pada objek dengan struktur keseluruhan dan komposisi komunitas ini tetap pada dasarnya tidak berubah selama hari setelah benda itu terakhir ditangani.

Karena hasil keyboard yang diringkas dalam Gambar. 1 dan and22 menunjukkan bahwa kita dapat menggunakan kulit terkait bakteri untuk menghubungkan objek ke pemiliknya, kami merancang penelitian lebih ditargetkan untuk menentukan kemanjuran pendekatan ini untuk identifikasi forensik. Kami ingin menentukan apakah bakteri pada objek pribadi lebih mirip dengan bakteri yang ditemukan pada kulit pemilik daripada populasi umum. Kami sampel bakteri dari sembilan tikus komputer (dari komputer pribadi) yang belum tersentuh selama lebih dari 12 jam dan dari telapak pemilik mouse. Kami kemudian menghitung jarak filogenetik antara komunitas bakteri di tangan masing-masing pemilik mouse dan mouse, membandingkan jarak ini ke jarak antara masyarakat tikus bakteri dan masyarakat pada 270 tangan yang belum pernah menyentuh mouse. Komunitas-komunitas tangan 270 bakteri berasal dari database individu sampel untuk berbagai penelitian yang dilakukan selama 2 tahun terakhir menggunakan sampel yang sama dan analisis masyarakat tech-nique dijelaskan di atas. Jika pendekatan ini adalah untuk menjanjikan sebagai alat untuk identifikasi forensik, kita harapkan masyarakat pada tikus untuk lebih mirip dengan masyarakat di tangan pemilik mereka daripada semua tangan lain dalam database.

Dalam semua sembilan kasus, komunitas bakteri pada mouse masing-masing secara signifikan lebih mirip dengan masyarakat di tangan pemilik daripada tangan lain dalam database, terlepas dari jarak digunakan metrik (Gambar 4), menunjukkan bahwa teknik ini memiliki potensi untuk melayani sebagai sarana yang kuat identifikasi forensik. Namun, sama seperti lainnya forensik teknik telah diperlukan pengujian dan perbaikan yang cukup lama setelah mereka awalnya dipahami, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menilai bagaimana akurasi teknik ini dapat dibandingkan dengan standar yang lebih, dan diterima secara luas, alat forensik. Secara khusus, akan sangat penting untuk menilai bagaimana akurasi pendekatan bisa diperbaiki dengan menyusun database yang lebih besar dari tangan-terkait komunitas bakteri, mendapatkan urutan lebih per sampel, mengumpulkan spesimen beberapa per objek atau tangan, mengembangkan metrik jarak baru untuk meningkatkan kemampuan kita untuk mengatasi perbedaan antara masyarakat, atau hanya menggunakan subset dari komunitas bakteri dalam analisis (yaitu, bahwa sebagian dari tangan-terkait komunitas bakteri yang paling identitas pribadi). Demikian juga, untuk lebih membangun kegunaan teknik ini, penelitian tambahan akan diperlukan untuk menilai seberapa baik bekerja dengan benda-benda dari bahan permukaan yang berbeda, benda menyentuh lebih jarang, atau benda-benda yang bersentuhan dengan kulit lokasi ganda pada individu tertentu.

KESIMPULAN

Pendekatan yang dijelaskan di sini dapat memberikan konfirmasi independen dari hasil forensik diperoleh dengan menggunakan metode lain (misalnya, DNA analisis manusia atau analisis sidik jari) dan pendekatan mungkin merupakan alternatif yang berharga untuk teknik ini lebih standar dalam kondisi tertentu dan skenario. Misalnya, kecuali ada darah, jaringan, air mani, atau air liur pada objek, seringkali sulit untuk mendapatkan DNA manusia yang memadai untuk identifikasi forensik. Namun, mengingat

banyaknya sel bakteri pada permukaan kulit dan melepaskan sel-sel epidermis (12), mungkin lebih mudah untuk memperbaharui DNA bakteri dibandingkan DNA manusia dari permukaan menyentuh (meskipun penelitian tambahan diperlukan untuk mengkonfirmasi bahwa ini adalah benar-benar benar). Selain itu, teknik ini mungkin berguna untuk mengidentifikasi objek dari mana sidik jari yang tidak jelas dapat diperoleh (misalnya, kain, permukaan kotor, permukaan yang sangat bertekstur).

Bersama-sama, penelitian ini menunjukkan bahwa penelitian pada manusia terkait koloni mikroba, seperti Proyek Microbiome Manusia (13), tidak hanya akan menghasilkan kontribusi yang berharga di bidang mikrobiologi dan obat-obatan, tetapi juga aplikasi tak terduga dan novel untuk bidang lainnya dan disiplin. Secara khusus, kami telah memanfaatkan penemuan baru dan mengejutkan bahwa mikroba kami sangat personalisasi untuk memulai pengembangan pendekatan forensik yang unik. Pengembangan lebih lanjut dari pendekatan ini pertimbangan tuntutan cermat oleh bioethicists berusaha untuk memahami, implikasi etis hukum, dan sosial dari Proyek Microbiome Manusia, bahkan kembar identik pelabuhan koloni mikroba nya berbeda (14), menunjukkan bahwa pengumpulan gen simbion mikroba kami dapat akan lebih identitas pribadi daripada gen manusia kita sendiri.

METODE

Sampel Collection.

Untuk studi keyboard, kami diseka Kunci individu dari tiga keyboard komputer pribadi (25-30 kunci per keyboard) dan kulit pada permukaan ventral dari sendi distal dari setiap ujung jari dari pemilik dan pengguna hampir eksklusif keyboard masing-masing. Semua tiga orang yang sehat pada saat pengambilan sampel, tidak mengambil antibiotik selama minimal 6 bulan, dan antara 20 dan 35 tahun. Dua dari orang-orang berbagi ruang kantor yang sama. Keyboard dan ujung jari yang diseka dalam waktu 10 menit dari satu sama lain, tetapi keyboard belum tersentuh selama lebih dari 30 menit sebelum pengambilan sampel. Untuk membandingkan komunitas bakteri pada keyboard ini untuk keyboard lain-lain, kami diseka kunci ruang bar dari 15 keyboard komputer lain swasta dan publik yang terletak di University of Colorado kampus. Kulit permukaan dan tombol keyboard yang menggunakan sampel diautoklaf kapas-tipped swab premoistened dengan larutan steril (8, 15). Swabbing telah terbukti menjadi metode yang cocok untuk koleksi kulit sampel untuk analisis komunitas mikroba (7). Permukaan terkena seluruh setiap tombol keyboard yang diseka ringan selama 10 s. Semua penyeka disimpan pada -80 ° C selama kurang dari 1 minggu sebelum ekstraksi DNA.

Untuk studi "storage", kami menggunakan teknik swabbing dijelaskan di atas untuk sampel aksiler yang tepat (ketiak) permukaan kulit dari dua individu dewasa yang sehat. Ini permukaan kulit dipilih karena pelabuhan taksa mirip dengan yang ditemukan di habitat kulit lainnya (9), namun tingkat biomassa cenderung cukup tinggi untuk memungkinkan kita untuk mendapatkan jumlah yang cukup dari biomassa bakteri ke semua sampel swab replikasi yang dikumpulkan. Seluruh permukaan kulit secara bersamaan diseka dengan 16 penyeka basah per individu, memutar penyeka untuk menjamin homogenitas di daerah kulit yang dihubungi oleh swab masing-masing. Setengah dari penyeka segera dibekukan pada -20 ° C dengan setengah lainnya yang tersisa di membuka tutup 15-mL tabung kerucut di bangku laboratorium. Kondisi di laboratorium yang khas dari lingkungan dalam ruangan: suhu diadakan di ≈ 20 °

C selama percobaan dengan pencahayaan lampu neon selama ≈ 8 jam per hari. DNA bakteri diekstraksi dari empat penyeka ulangan per kondisi penyimpanan setelah baik 3 hari atau 14 hari, dengan DNA disimpan pada -80 ° C sebelum analisis.

Untuk studi mouse komputer, kami merekrut sembilan orang dewasa yang sehat (empat laki-laki dan lima perempuan, semua 20-35 tahun) yang bekerja di gedung yang sama di University of Colorado kampus. Menggunakan teknik swabbing dijelaskan di atas, permukaan terkena seluruh setiap mouse komputer dan permukaan telapak tangan yang dominan individu (tangan biasanya digunakan untuk mengoperasikan mouse) yang diseka. Perawatan diambil untuk memastikan bahwa mouse terakhir telah tersentuh oleh h 12 pemilik sebelum swab tersebut (tikus tetap pada suhu kamar selama periode ini). Permukaan sawit sampel siang dan relawan diminta untuk mengikuti praktek-praktek kebersihan tangan khas mereka sebelum sampling. Semua penyeka disimpan pada -80 ° C sebelum ekstraksi DNA. Kami memperkirakan akurasi pencocokan mouse untuk pemilik mouse dengan mengukur tingkat kesamaan antara komunitas bakteri pada setiap komputer mouse ke tangan pemilik mouse dan tangan yang belum pernah menyentuh mouse. Kami mengumpulkan database komunitas bakteri dari 270 tangan lainnya sampel untuk proyek-proyek lain (8, 9). The 270 tangan komunitas bakteri termasuk dalam database ini berasal dari permukaan telapak kiri dan kanan milik relawan pria dan wanita dalam proporsi yang sama yang sehat dan berusia antara 18 dan 40 tahun. Telapak sampel dan masyarakat bakteri dianalisis menggunakan prosedur identik dengan yang dijelaskan di sini.

Untuk semua tiga penelitian yang dijelaskan di atas, individu dibuat sadar akan sifat penelitian dan memberikan persetujuan tertulis sesuai dengan protokol pengambilan sampel disetujui oleh University of Colorado Manusia Komite Penelitian (protokol 0.109,23).

DNA Ekstraksi dan pyrosequencing.

DNA genomik diekstraksi dari penyeka menggunakan MO BIO PowerSoil kit DNA Isolasi. Tips kapas penyeka dari The beku yang patah langsung ke tabung manik-manik yang 60 uL Solution C1 telah ditambahkan. Diinkubasi pada 65 ° C selama 10 menit dan kemudian dikocok secara horizontal pada kecepatan maksimum selama 2 menit dengan menggunakan adaptor MO pusaran BIO. Langkah-langkah yang tersisa dilakukan seperti yang diarahkan oleh produsen.

Untuk setiap sampel, kita diperkuat 16S rRNA gen menggunakan primer ditetapkan dijelaskan dalam Fierer et al. (8) yang telah dioptimalkan untuk analisis filogenetik pyrosequencing dibaca (16). Reaksi PCR dilakukan dalam rangkap tiga 25-uL reaksi dengan 0,6 mM maju dan mundur primer, 3 DNA template yang uL, dan 1 × dari HotMasterMix (5 PRIME). Siklus termal terdiri dari denaturasi awal pada 94 ° C selama 3 menit diikuti dengan 35 siklus denaturasi pada 94 ° C selama 45 s, anil pada 50 ° C selama 30 s, dan ekstensi pada 72 ° C selama 90 s, dengan perpanjangan terakhir dari 10 menit pada 72 ° C. Amplikon ulangan dikumpulkan dan divisualisasikan pada gel 0,1% agarosa menggunakan gel SYBR DNA Aman noda di 0,5 × TBE (Invitrogen). Amplikon yang dibersihkan menggunakan UltraClean-htp 96-baik PCR Clean-up kit (MO BIO).

Konsentrasi DNA amplikon diukur menggunakan Quant-iT PicoGreen reagen dsDNA dan kit (Invitrogen). Setelah kuantisasi, amplikon dibersihkan digabungkan dalam rasio molar yang sama ke dalam tabung

tunggal. Kolam akhir DNA diendapkan di atas es selama 45 menit setelah penambahan 5 M NaCl (0.2 M konsentrasi akhir) dan 2 volume es-dingin etanol 100%. The DNA diendapkan disentrifugasi pada 7.800 × g selama 40 menit pada 4 ° C, dan pelet yang dihasilkan dicuci dengan volume yang sama dari dingin etanol 70% dan disentrifugasi lagi pada 7.800 × g selama 20 menit pada 4 ° C. Supernatan dibuang dan pelet adalah udara kering selama 10 menit pada suhu kamar dan kemudian resuspended dalam nuklease bebas air (MO BIO). Pyrosequencing dilakukan pada 454 Hidup Genome Sciences instrumen Sequencer FLX (Roche) oleh Core Fasilitas Lingkungan Genomics di University of South Carolina (Columbia).

Urutan Analisis dan Perbandingan Masyarakat.

Urutan diolah dan dianalisis mengikuti prosedur yang dijelaskan sebelumnya (8, 11). Urutan telah dihapus dari analisis jika mereka kurang dari 200 atau lebih dari 300 bp panjang, memiliki skor kualitas kurang dari 25, terdapat karakter ambigu, mengandung barcode uncorrectable, atau tidak mengandung urutan primer. Urutan Sisa ditugaskan untuk sampel dengan memeriksa barcode 12-nt. Urutan serupa dikelompokkan ke dalam unit taksonomi operasional (Otus) menggunakan cd-hit (17) dengan cakupan minimal 97% dan identitas minimal 97%. Urutan perwakilan terpilih dari setiap OTU dengan memilih urutan terpanjang yang memiliki jumlah terbesar dari hits ke urutan lain di OTU tersebut. Urutan perwakilan yang selaras dengan Nast (18) dan database greengenes (19) dengan panjang keselarasan minimal 150 dan identitas minimal 75%. Topeng Lane PH digunakan untuk menyaring daerah hipervariabel setelah keselarasan. Sebuah pohon filogenetik disimpulkan menggunakan tebang habis (20) dengan dua-parameter model Kimura. Taksonomi ditugaskan menggunakan classifier RDP dengan ambang minimum support dari 60% dan taksonomi nomenklatur RDP (21).

Untuk masing-masing sampel termasuk dalam tiga studi yang dijelaskan di atas (termasuk dalam database dari 270 permukaan sawit digunakan untuk memperkirakan keakuratan mouse komputer tugas) kami memperoleh minimal 800 urutan berkualitas (kisaran 800-1,500 urutan per sampel) dengan urutan rata-rata 240 bp.

Untuk menentukan jumlah ketidaksamaan (jarak) antara setiap pasang komunitas bakteri, kami menggunakan metrik UniFrac (10, 22, 23). Jarak UniFrac didasarkan pada fraksi panjang cabang dibagi antara dua masyarakat di dalam pohon filogenetik dibangun dari urutan gen rRNA 16S dari semua masyarakat yang dibandingkan. Sebuah jarak UniFrac relatif kecil menyiratkan bahwa dua masyarakat yang komposisinya mirip, menyembunyikan garis keturunan berbagi sejarah evolusi umum. Dalam UniFrac tertimbang, hanya ada atau tidak adanya garis keturunan dianggap. Dalam UniFrac tertimbang, panjang cabang yang berbobot berdasarkan pada jumlah relatif garis keturunan dalam masyarakat. Kami menggunakan analisis kesamaan (ANOSIM) (24) fungsi dalam PRIMER program (25) menguji perbedaan komposisi komunitas di antara kelompok sampel.

UCAPAN TERIMA KASIH

Karya ini didanai sebagian oleh dana dari National Science Foundation (NF) dan hibah dari National Institutes of Health, Crohn dan Colitis Foundation of America, dan Howard Hughes Medical Institute (ke RK). Kami berterima kasih kepada para relawan yang berpartisipasi dalam studi ini dan anggota Fierer

dan laboratorium Ksatria atas bantuan mereka dengan koleksi sampel, analisis data, dan mengedit naskah. Micah Hamady memberikan bantuan dengan analisis data sekuens.