HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS -...

iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar

Nama : Sani Pradasari Afifah

NIM : 1112102000004

Tanda Tangan :

Tanggal : Ciputat, 22 September 2016

HALAMAN PERSETUJUAIY PEMBIMBING


NIM :11121*2000004

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi :Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino

Hidroksiprolia Meagguaakan lV1etode Spektrofotometri

IIV-Vis

Disetujui oleh:

Pembimbing IdZilhadia. M.Si." Apt.

NrP. 1 9730 8222A0812A07

Pembimbing II

t,#Supandi.I\C,Si.. Apt.

NIP.

Mengetahui

Ketua Prodi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

^)4,Dr. Nurmeilis. M.Si.. Apt

NIP. 197404302005012003

iv Ulttl Syarif,Hidayatullah Jakarta

IIALAMAN PENGESAHAN

diaiukan oleh :Skripsi ini

Nama

NIM

Program Studi

Judul Skripsi

Pembimbing I

Pembimbing II

Penguji I

Penguji II

Ditetapkan di

Tanggal

: Sani Pradasari Afifah

:1112102000004

: Farmasi

:Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino

Hidroksiprolin Menggunakan Metode Spektrofotometri

tIV-Vis

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterimasebagai bagian persyaratan yang diperlukan unfuk memperoleh gelarSarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran danIImu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWA}{ PENGUJI

Zilhadia, M.Si., Apt.

Supandi, M.Si., Apt.

Drs.Umar Mansur, M.Sc., Apt

Nurhasni, M.Si.

Ciputat

22 September 2016

(

(

(

)

)

)

{@^ey-


vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK


NIM : 1112102000004


Judul :Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino

Hidroksiprolin Menggunakan Metode Spektrofotometri

UV-Vis

Hidroksiprolin merupakan asam amino hasil modifikasi prolin yang dikatalisisoleh enzim prolil-4-hidroksilase (P4H) pada saat proses posttranslasi protein.Hidroksiprolin adalah salah satu asam amino yang terdapat dalam gelatin danmenjadi salah satu parameter kualitas gelatin. Selain itu hidroksiprolin juga dapatdigunakan sebagai parameter untuk khasiat pengobatan luka bakar. Dalampenelitian ini telah dilakukan validasi metode penetapan kadar asam aminohidroksiprolin menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis. Hasil validasimetode selanjutnya dapat digunakan untuk penetapan kadar hidroksiprolin dalamsampel gelatin. Proses analisis hidroksiprolin menggunakan reagen ehrlich (para-dimetilamino-benzaldehid), larutan oksidan (Chloramin-T-hidrat), NaCl,isopropanol, dan buffer asetat/sitrat pH 6. Parameter metode validasi dalampenelitian ini meliputi uji linearitas, uji batas deteksi, uji batas kuantitasi, ujiakurasi dan uji presisi. Berdasarkan hasil penelitian didapat panjang gelombangmaksimum hidroksiprolin yaitu 563,5 nm. Hasil kurva kalibrasi pada rentang 3-18ppm memiliki koefisien korelasi r=0,9991. Dan diperoleh persamaan regresiy=0,0312x-0,0026. Metode yang digunakan mempunyai batas deteksi 0,691 ppmdan batas kuantitasi 2,094 ppm. Metode analisis memiliki nilai presisi kurang dari±2% sedangkan nilai akurasi (% diff) yaitu -0,386%. Hasil analisis sampel gelatinmenunjukan semua sampel mengandung hidroksiprolin. Sampel pertamamengandung hidroksiprolin sebesar 8,277 ppm, sampel kedua mengandunghidroksiprolin sebesar 13,886 ppm, sampel ketiga mengandung hidroksiprolinsebesar 10,126 ppm, sampel keempat mengandung hidroksiprolin sebesar 17,038ppm dan sampel kelima mengandung hidroksiprolin sebesar 10,500 ppm.

Kata kunci : gelatin, hidroksiprolin, spektrofotometri UV-Vis.

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT


NIM : 1112102000004

Program Studi : Pharmacy

Judul : Validation of Analytical Method of Acid Amino

Hydroxyproline by Method Spectrofotometry UV-Vis.

Hydroxyproline is a modified amino acid (proline) catalyzed by the enzyme prolil-4-hydroxylase (P4H) during the process of posttranslation protein.Hydroxyproline is one of the amino acids contained in gelatin and became one ofthe quality parameters of gelatin. Besides, hydroxyproline can also be used as aparameter for the efficacy of the treatment of skin burns. This validation methodin this study used spectrophotometry UV-Vis. The validation result then can beused to assay hydroxyproline in gelatin. Hydroxyproline is analysed by ehrlichreagent (para-dimethylamino-benzaldehyde), oxidant solution (Chloramine-T-Hydrat), NaCl, isopropanol, and buffer acetat/citrate pH 6. Parameter validationmethod in the study include test linearity, test detection limit, test quantitationlimit, test accuracy and precision test. Based on the research results obtainedhydroxyproline maximum wavelength is 563.5 nm. The results of the calibrationcurve in the range of 3-18 ppm has a correlation coefficient r=0.9991. And theregression equation y=0,0312x-0,0026. The method used has a detection limit of0.691 ppm and limit of quantitation of 2.094 ppm. The method of analysis hasprecision values less than ±2% while the value accuracy (% diff) of -0,386%. Theresults showed all gelatin samples contained hydroxyproline. The first samplecontains hydroxyproline amounted to 8.277 ppm, a second sample containinghydroxyproline amounted to 13.886 ppm, third sample containing hydroxyprolineamounted to 10.126 ppm, a fourth sample contains hydroxyproline of 17.038 ppmand fifth samples containing hydroxyproline of 10,500 ppm.

Keywords : gelatin, hydroxyproline, spectrophotometry UV-Vis.

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, rasa syukur serta pujian senantiasa kita panjatkan kehadirat

Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayat-Nya serta segala

anugerah-Nya berupa kesehatan, pemikiran dan ide sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi ini. Salawat serta salam semoga selalu tercurah kepada

junjungan Nabi Muhammad SAW, keluarga, serta para sahabat dan pengikutnya

yang senantiasa mengikuti sunnahnya hingga akhir zaman.

Skripsi ini penulis susun untuk memenuhi salah satu syarat menempuh

ujian akhir guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta. Adapun judul skripsi ini adalah “Validasi Metode

Penetapan Kadar Asam Amino Hidroksiprolin Menggunakan Metode

Spektrofotometri UV-Vis”.Penulis menyadari bahwa skripsi ini tidak akan selesai dengan baik tanpa

bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis mengucapkan terima kasih

kepada:

1. Prof. Dr. H. Arief Sumantri, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt selaku Kepala Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta.

3. Ibu Zilhadia, M.Si., Apt selaku Pembimbing I dan Bapak Supandi, M.Si., Apt

selaku Pembimbing II yang telah meluangkan waktu tenaga dan pikiran serta

dengan sabar membimbing dan mengajari sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi ini.

4. Ayahanda tersayang Samsul Zaman Sari dan Ibunda tersayang Nani Maryani

terima kasih atas doa yang selalu tercurah untukku, kasih sayang, semangat

dan dukungannya yang memberikan kekuatan kepada penulis dalam

menyelesaikan skripsi ini.

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

5. Adikku tersayang Faruk Katili Basyaroh dan Sanasiu Fafe Sabasam yang

dengan canda tawanya mampu memberikan keceriaan dan semangat di hari-

hari penulis.

6. Ibu/Bapak Dosen dan Staf Akdemika Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta.

7. Untuk ka yaenab, ka eris dan kakak-kakak laboran di Laboratorium Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta yang telah membantu mengoperasikan alat dan

berdiskusi tentang skripsi ini.

8. Rekan-rekan Program Studi Farmasi kelas A dan C angkatan 2012 Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri. Terimakasih atas

tawa ceria dan kebersamaannya selama ini.

9. Dan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama ini yang tidak

dapat disebutkan namanya satu persatu.

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari

kesempurnaan. Oleh karena itu, saran, kritik, dan masukan sangat diharapkan

demi penyempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi

perkembangan ilmu pengetahuan dan para pembaca.

Ciputat, 22 September 2016

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGASAKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademika Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :


NIM : 1112102000004


Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya,

dengan judul :

VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASAM AMINO

HIDROKSIPROLIN MENGGUNAKAN METODE

SPEKTROFOTOMETRI UV-Vis

untuk dipublikasi atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada Tanggal : 22 September 2016

Yang menyatakan

Sani Pradasari Afifah

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ........................................................................................... iiHALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................. iiiHALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... ivHALAMAN PENGESAHAN.............................................................................vABSTRAK ...........................................................................................................viABSTRACT..................................................................................... ...................viiKATA PENGANTAR........................................................................................viiiHALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ....................xDAFTAR ISI........................................................................................................xiDAFTAR GAMBAR..........................................................................................xiiiDAFTAR TABEL ..............................................................................................xivDAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................xv

BAB I PENDAHULUAN....................................................................................11.1 Latar Belakang Masalah ..................................................................11.2 Rumusan Masalah............................................................................41.3 Tujuan Penelitian .............................................................................41.4 Manfaat Penelitian ...........................................................................4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA.........................................................................52.1 Asam Amino Hidroksiprolin ...........................................................5

2.1.1 Sumber Asam Amino Hidroksiprolin.....................................62.1.2 Analisis Asam Amino Hidroksiprolin ....................................6

2.2 Asam Amino ....................................................................................72.2.1 Pembagian Asam Amino........................................................82.2.2 Analisis Asam Amino Secara Umum.....................................8

2.3 Gelatin..............................................................................................92.3.1 Komposisi Asam Amino dalam Gelatin.................................9

2.4 Validasi Metode Analisa..................................................................102.4.1 Parameter Validasi Metode ....................................................11

2.5 Spektrofotometri UV-VIS................................................................142.5.1 Instrumentasi Spektrofotometri UV-VIS ...............................152.5.2 Tipe Instrumentasi Spektrofotometri UV-VIS .......................18

BAB III METODOLOGI PENELITIAN .........................................................203.1 Tempat dan Waktu Penelitian..........................................................203.2 Alat dan Bahan.................................................................................20

3.2.1 Bahan......................................................................................203.2.2 Alat ........................................................................................20

3.3 Prosedur Penelitian ..........................................................................213.3.1 Penyiapan Bahan Baku dan Pereaksi .....................................213.3.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum 9 ppm ...............233.3.3 Validasi Metode .....................................................................233.3.4 Analisis Sampel Gelatin Secara Kuantitatif ...........................26

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................274.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ....................................27

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.2 Validasi Metode...............................................................................304.2.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas ......................304.2.2 Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ..................................324.2.3 Uji Kecermatan (Akurasi).......................................................324.2.4 Uji Keseksamaan (Presisi) ......................................................33

4.3 Analisis Sampel Gelatin...................................................................35BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ..............................................................38

5.1 Kesimpulan ......................................................................................385.2 Saran ................................................................................................38

DAFTAR PUSTAKA..........................................................................................39LAMPIRAN.........................................................................................................43

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Perubahan Asam Amino Prolin Menjadi Hidroksiprolin yangDikatalis Oleh Enzim Prolil 4 Hidroksilase....................................5

Gambar 2.2 Proses Oksidasi Hidroksiprolin Menjadi Pirol..................................7Gambar 2.3 Struktur Umum Asam Amino ...........................................................8Gambar 2.4 Komposisi Asam Amino Gelatin dari Beberapa Jenis Bahan Baku .10Gambar 2.5 Skema Kerja Alat Spektrofotometri UV-Vis ....................................15Gambar 2.6 Skema Spektrofotometri UV-Vis Tipe Single Beam ........................18Gambar 2.7 Skema Spektrofotometri UV-Vis Tipe Double Beam.......................18Gambar 4.1 Proses Oksidasi Hidroksiprolin Menjadi Pirol..................................29Gambar 4.2 Panjang Gelombang Maksimum Hidroksiprolin ..............................29Gambar 4.3 Kurva Kalibrasi Hidroksiprolin.........................................................31Gambar 4.4 Grafik Hasil Analisis Kadar Hidroksiprolin Dalam Sampel Gelatin 36Gambar 5.1 Perubahan Warna Larutan Hidroksiprolin Hasil Derivatisasi ...........58

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 4.1 Hasil Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Hidroksiprolin ..............32Tabel 4.2 Hasil Uji Rata-Rata % diff ....................................................................33Tabel 4.3 Hasil Uji Rata-Rata Presisi ...................................................................34Tabel 4.4 Hasil Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino Hidroksiprolin35Tabel 5.1 Hasil Data Uji Linearitas Larutan Standar Hidroksiprolin ...................51Tabel 5.2 Hasil Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Hidroksiprolin ..............52Tabel 5.3 Data Uji Akurasi (% diff) ......................................................................53Tabel 5.4 Data Uji Keseksamaan Pada Tiga Konsentrasi Hidroksiprolin ............54Tabel 5.5 Data Uji Kandungan Hidroksiprolin Dalam Sampel Gelatin................55Tabel 5.6 Rumus-Rumus.......................................................................................56

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1 Skema Pembuatan Reagen.................................................................43Lampiran 2 Skema Kerja Pembuatan Larutan Blanko..........................................46Lampiran 3 Bagan Skema Kerja ...........................................................................47Lampiran 4 Skema Analisis Hidroksiprolin dalam Sampel Gelatin Secara .........50

Kuantitatif...........................................................................................50Lampiran 5 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas .................................51Lampiran 6 Batas Deteksi dan Kuantitasi .............................................................52Lampiran 7 Uji Perolehan Kembali (Akurasi) ......................................................53Lampiran 8 Uji Keseksamaan (Presisi).................................................................54Lampiran 9 Uji Sampel Gelatin ............................................................................55Lampiran 10 Rumus-Rumus .................................................................................56Lampiran 11 Perhitungan Konsentrasi Hidroksiprolin .........................................57Lampiran 12 Perubahan Warna Larutan Hidroksiprolin Hasil Derivatisasi .........58

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Hidroksiprolin merupakan asam amino hasil modifikasi prolin

yang dikatalisis oleh enzim prolil-4-hidroksilase (P4H) pada saat proses

posttranslasi protein. Biasanya modifikasi posttranslasi pada protein

bersifat reversibel (dapat kembali), tetapi pada asam amino prolin dapat

melakukan modifikasi posttranslasi protein secara irreversibel. Asam

amino hidroksiprolin dapat ditemukan pada domain protein kolagen,

elastin, conotoxin, dan argonaute (Kelly et al., 2010). Asam amino

hidroksiprolin juga terdapat pada dinding sel tanaman dan ganggang hijau

(Cassab, 1998). Hidroksiprolin memiliki fungsi sebagai penstabil triple

helix pada kolagen (Kelly et al., 2010).

Penetapan kadar hidroksiprolin penting untuk divalidasi karena

kandungan asam amino hidroksiprolin merupakan salah satu parameter

kualitas gelatin. Gelatin merupakan protein yang diperoleh dari hidrolisis

parsial kolagen kulit, jaringan ikat putih dan tulang hewan (Rizky et al.,

2013). Semakin tinggi asam amino hidroksiprolin maka semakin baik

kualitas gelatin tersebut (Jaswir, 2007). Hidroksiprolin juga merupakan

parameter yang digunakan untuk khasiat pengobatan luka bakar. Seperti

yang dilakukan oleh Eriawan et al (2013) yang mengaplikasikan

penetapan kadar hidroksiprolin untuk mengetahui efektifitas khasiat

pengobatan luka bakar sediaan gel yang mengandung fraksi ekstrak

pegagan. Hal ini dikarenakan kadar hidroksiprolin dalam jaringan dapat

digunakan sebagai indeks parameter jumlah kolagen dalam kulit. Kolagen

menjadi parameter terbentuknya jaringan atau regenerasi kulit yang

tersusun atas dua jenis asam amino yakni hidroksilisin dan hidroksiprolin.

Semakin tinggi kandungan hidroksiprolin dapat diindikasikan bahwa

terjadi peningkatan sintesis kolagen yang berkorelasi dalam kecepatan

proses penyembuhan luka.

Ada tiga metode yang biasanya dilakukan untuk mengetahui kadar

asam amino hidroksiprolin dalam sampel yakni menggunakan HPLC

2


(High Performance Liquid Chromathographic) (Pier et al., 1997; Tobias

et al., 2007; Jun et al., 2014), Spektrofluorometri (Amin et al., 1982; Shila

and Natasa, 2009) dan menggunakan Spektrofotometri UV-VIS (Rajesh et

al., 2014; Daniela, 2014; Jitender et al., 2012). Masing-masing metode

memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode HPLC memiliki kelebihan

yakni cepat, sensitif, selektif, kolom pemisah dapat digunakan kembali

dan dapat menggunakan bermacam-macam detektor (Ardianingsih, 2009).

Metode ini memiliki kelemahan yakni apabila pengujian asam amino

hidroksiprolin dilakukan bersamaan dengan asam amino lain, kadar asam

amino hidroksiprolin secara tunggal sulit terderivatisasi oleh alat. Hasil

yang akan didapatkan berupa kadar total antara hidroksiprolin dan prolin

(Suzanne et al., 1998; Dhillon et al., 2014). Untuk itu analisis asam amino

hidroksiprolin harus dilakukan secara terpisah, hal ini dapat menyebabkan

kendala karena harus melakukan dua kali pengujian dengan kondisi

optimum HPLC yang berbeda. Metode HPLC juga merupakan metode

yang lebih komplek dan mahal dibandingkan metode lainnya.

Metode lainnya menggunakan spektrofluorometri. Metode ini

memiliki kelebihan yakni dapat mengukur konsentrasi sampel yang

rendah, lebih selektif dan peka. Kelemahan dari metode ini yakni dapat

terjadi pemadaman sendiri dan penyerapan sendiri molekul zat yang

disebabkan oleh tabrakan-tabrakan antar molekul zat itu sendiri. Tabrakan

ini dapat menyebabkan energi yang tadinya akan dilepaskan sebagai sinar

fluorosensi ditransfer ke molekul lain akibatnya intensitas berkurang

(Gholib dan Abdul 2007).

Metode lain yang sering digunakan untuk analisa hidroksiprolin

dalam sampel yakni metode Spektrofotometri UV-Vis. Metode ini

memiliki kelebihan yakni dapat digunakan untuk analisis suatu zat dalam

jumlah kecil, cukup sensitif dan selektif, pengerjaannya mudah dan

sederhana, biaya yang relatif murah dan mempunyai kepekaan analisis

yang cukup tinggi (Munson, 1991). Namun metode ini juga mempunyai

kelemahan yakni senyawa yang akan dianalisa harus memiliki gugus

kromofor dan ausokrom agar senyawa dapat terdeteksi pada daerah

3


ultraviolet dan daerah visible (Harmita, 2006). Selain itu hasil yang

diperoleh juga dipengaruhi oleh kebersihan kuvet dan sinar yang

digunakan harus monokromatis (Gholib dan Abdul, 2007).

Metode yang akan digunakan pada penelitian ini yaitu

menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis. Metode ini dipilih karena

memiliki kelebihan dibandingkan dengan metode lain yang sering

digunakan dalam analisis asam amino hidroksiprolin yakni metode ini

lebih mudah pengerjaannya dan lebih sederhana dibandingkan metode

spektrofluorometri dan HPLC. Dalam analisis sampel metode ini mampu

mengukur zat dalam jumlah kecil, memiliki kepekaan analisis yang cukup

tinggi, cukup sensitif dan selektif serta biaya pengerjaan yang relatif

murah (Munson, 1991). Selain itu derivatisasi hidroksiprolin dengan

metode spektrofotometri UV-Vis lebih mudah dibandingkan dengan

metode spektrofluorometri dan HPLC.

Suatu metode harus divalidasi untuk mendapatkan data atau hasil

penelitian yang memenuhi persyaratan dan dapat dipertanggung jawabkan

kebenarannya. Validasi metode juga dapat mengevaluasi suatu kerja

metode analisis, menjamin suatu prosedur analisis, menjamin keakuratan

dan keterulangan hasil prosedur analisis serta mengurangi resiko

penyimpangan yang mungkin timbul (Wulandari, 2007).

Berdasarkan uraian diatas maka penelitian ini ditujukan untuk

memvalidasi metode mengenai penetapan kadar asam amino

hidroksiprolin menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis.

Selanjutnya hasil penelitian ini diaplikasikan pada penentuan kadar

hidroksiprolin dalam sampel gelatin.

4


1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah hasil validasi metode penetapan kadar asam amino

hidroksiprolin menggunakan metode spektrofotometri UV-VIS

memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan?

2. Berapakah kadar asam amino hidroksiprolin yang terdapat pada

sampel gelatin?

1.2 Tujuan Penelitian

1. Untuk mengetahui apakah metode spektrofotometri UV-VIS yang

digunakan untuk validasi asam amino hidroksiprolin telah memenuhi

persyaratan yang telah ditetapkan.

2. Untuk mengetahui berapakah kadar asam amino pada sampel gelatin.

1.4 Manfaat Hasil Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat membantu para peneliti lain dalam

hal menentukan metode yang tepat untuk menentukan kadar asam amino

hidroksiprolin pada suatu sampel dengan metode yang lebih efektif dan

efisien dan telah divalidasi menggunakan metode spektrofotometri UV-

VIS.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Asam Amino Hidroksiprolin

Hidroksiprolin merupakan asam amino hasil dari modifikasi asam

amino prolin yang dikatalisis oleh enzim prolil 4 hidroksilase (P4H) pada

saat proses posttranslasi protein. Reaksi enzim prolil 4 hidroksilase

berlangsung di lumen retikulum endoplasma. Biasanya modifikasi

posttranslasi pada protein bersifat reversibel (dapat kembali), tetapi hal ini

berbeda pada asam amino prolin yang dapat melakukan modifikasi

posttranslasi pada protein secara irreversibel. Fungsi hidroksiprolin pada

kolagen yaitu sebagai penstabil triple helix (Kelly et al., 2010). Fungsi

hidroksiprolin pada gelatin yaitu sebagai penstabil jaringan gel (Bustillos

et al., 2006)

Pembentukan prolin menjadi hidroksiprolin sangat bergantung

pada pengaktifan enzim prolil-4-hydroksilase. Enzim ini dapat aktif

dengan adanya vitamin C (kofaktor enzim prolil-4-hydroksilase).

Kekurangan vitamin C dapat memicu terpecah-pecahnya kolagen atau

dengan kata lain kolagen yang kurang sempurna dalam pembentukannya

dan hal ini dapat meyebabkan timbulnya gejala penyakit sariyawan

(scurvy) yang ditandai oleh kerusakan pernbuluh darah serta struktur kulit

(Sidik, 2009).

Gambar 2.1 Perubahan asam amino prolin menjadi hidroksiprolin dikatalis

oleh enzim prolil-4-hidroksilase (Yan et al., 2014).

6


2.1.1 Sumber Asam Amino Hidroksiprolin

Hidroksiprolin berhasil ditemukan dalam hidrolisat gelatin oleh

Emil Fischer (Fischer, 1902). Hidroksiprolin juga dapat ditemukan pada

domain protein kolagen, elastin, conotoxin, dan argonaute (Kelly et al.,

2010). Selain terdapat pada jaringan hewan hidroksiprolin juga merupakan

komponen utama protein pada dinding sel tanaman dan ganggang hijau

(Cassab, 1998). Isomer dari 4-hidroksiprolin juga ditemukan pada produk

bakteri seperti antibiotik gentamisin dan antibiotik actinomysin, tetapi

belum ada laporan yang mengkonfirmasi bahwa 4-hidroksiprolin termasuk

kedalam struktur komponen sel bakteri (Elijah and Leonard, 1980).

2.1.2 Analisis Asam Amino Hidroksiprolin

Salah satu prosedur penentuan hidroksiprolin didasarkan pada

interaksi analit dengan ninhidrit (1,2,3-trioxidena hidrat), interaksi dengan

senyawa yang mengandung gugus amino akan memberikan produk

berwarna. Karena semua asam amino dapat bereaksi dengan ninhidrit,

pertama larutan uji diberi natrium ninhidrit dengan tujuan mengoksidasi

semua jenis asam amino dengan pembentukan alkohol dan alkena. Tetapi

prosedur ini memiliki kerugian utama yaitu penentuan konsentrasi total

hidroksiprolin dan prolin tidak dapat ditentukan secara terpisah satu sama.

Selain itu terdapat hipotesis bahwa tidak terjadi transformasi asam amino

pada saat dekomposisi asam amino, hal ini disebabkan amin sekunder

pada asam amino dapat bereaksi dengan asam nitrat untuk membentuk N-

nitrosamin (N. Yu. Ignat’eva et al., 2007).

Prosedur lain untuk penentuan hidroksiprolin didasarkan pada

reaksi reagen Ehrlich dengan proses oksidasi hidroksiprolin. Mekanisme

kimia dari proses ini dapat digambarkan sebagai berikut. Proses ini

melibatkan oksidasi dari asam imino menjadi pirol-2-karboksilat atau

pirol, kemudian pembentukan kromofor dengan penambahan reagen

Ehrlich (p-dimetilamino-benzaldehida) (Darwin and Sidney, 1960).

Senyawa yang dihasilkan berupa senyawa quinoid yang sangat berwarna

7


(warna tergantung pada substituen dan bervariasi dari orange-ungu) (N.

Yu. Ignat’eva et al., 2007).

Gambar 2.2 Proses Oksidasi Hidroksiprolin Menjadi Pirol (Darwin and

Sidney, 1960).

Chloramin-T-hidrat (N-kloro-4-Toluensulfonamida, garam

natrium) merupakan bahan kimia yang biasanya digunakan sebagai agen

pengoksidasi. Di antara keuntungan yang tidak diragukan sebagai agen

pengoksidasi adalah inexpensivenes, tidak mudah terdekomposisi dan

tidak ada pengurangan produk berwarna. Reaksi oksidasi dilakukan dalam

larutan buffer dengan pH 6 karena reagen ehrlich larut pada air dengan pH

tertentu (N. Yu. Ignat’eva et al., 2007).

2.2 Asam Amino

Asam amino adalah senyawa organik yang terdiri dari asam

karboksilat dan yang mempunyai gugus amino. Asam amino dapat

ditemukan pada keadaan bebas atau sebagai rantai linear pada peptida dan

protein (Bailey, 1990). Asam amino terdiri dari sebuah gugus amino,

gugus karboksil, atom hidrogen dan gugus R yang terikat pada atom C

yang dikenal sebagai karbon alfa (Cα). Gugus R sebagai rantai samping.

Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut pada pelarut

organik non polar seperti eter, aseton, kloroform (Poedjiadi, 2009).

8


Gambar 2.3 Struktur Umum Asam Amino (Merinda, 2013).

2.2.1 Pembagian Asam Amino

Berdasarkan sifat kimia rantai sampingnya, asam amino dapat

dibagi menjadi empat kelompok, yaitu asam amino yang bersifat basa

lemah, asam lemah, hidrofilik jika polar dan hidrofobik jika nonpolar

(Almatsier, 2006). Tidak semua asam amino dapat dibuat dalam tubuh kita

apabila ditinjau dari segi pembentukannya asam amino dibagi menjadi dua

golongan yaitu asam amino eksogen dan asam amino endogen. Asam

amino eksogen disebut juga asam amino esensial dan asam amino endogen

disebut juga asam amino non esensial (Winarno, 2008).

2.2.2 Analisis Asam Amino Secara Umum

Analisis asam amino merupakan metode penentuan komposisi

asam amino atau kandungan protein dan peptida. Untuk mengidentifikasi

adanya asam amino, terlebih dahulu kita perlu menghidrolisis ikatan amin

dengan sempurna untuk memperoleh asam amino dalam keadaan bebas,

kemudian kita memisahkan, mengidentifikasi dan menghitungnya.

Hidrolisis dapat dilakukan pada kondisi asam dan basa yang kuat atau

menggunakan enzim spesifik untuk memperoleh asam amino. Pada

hidrolisis asam unsur yang diperlukan adalah HCl 6 M pada suhu 110oC.

Reaksinya biasanya dilakukan ditabung kaca yang tertutup. Sementara itu

pada hidrolisis basa, ikatan amida dapat diputus dengan perlakuan peptida

menggunakan NaOH 2M pada suhu 100oC. Hidrolisis basa menghasilkan

destruksi arginin, sistein, serin, dan treonin. Selain itu ada pula hidrolisis

enzim. Peristiwa ini terjadi didalam tubuh. Untuk menghancurkan

makanan perut memiliki enzim dengan kadar tertentu yang dapat

dikatalisasi untuk memotong ikatan peptida yang dikenal peptidase.

9


Aminopeptidase bekerja cepat dan efisien dalam hidrolisis ikatan peptida

sekaligus memotong suatu residu asam amino mulai dari ujung N. Tahap

selanjutnya yaitu pemisahan. Pemisahan yang umum dilakukan adalah

dengan cara kromatografi (Bailey, 1990)

2.3 Gelatin

Gelatin merupakan campuran heterogen polipepetida yang

diperoleh melalui hidrolisis parsial kolagen dari jaringan ikat hewan

dengan perlakuan asam atau basa (Fischer, 2012). Gelatin merupakan

protein yang larut yang bisa bersifat sebagai gelling agent (bahan pembuat

gel) atau sebagai non gelling agent. Sumber bahan baku gelatin dapat

berasal dari sapi (tulang dan kulit), babi (kulit) dan ikan (kulit). Gelatin

memiliki fungsi yang masih sulit untuk digantikan dalam industri pangan

maupun obat-obatan. Hal ini dikarenakan gelatin memiliki fungsi yang

banyak yaitu bisa berfungsi sebagai bahan pengisi, pengemulsi

(emulsifier), pengikat, pengendap, pemerkaya gizi, sifatnya juga dapat

membentuk lapisan tipis yang elastis, membentuk film yang transparan

dan kuat, kemudian memiliki sifat penting lainnya yaitu daya cernanya

yang tinggi (Dewi and Iriane, 2007).

2.3.1 Komposisi Asam Amino dalam Gelatin

Gelatin sangat kaya dengan asam amino glisin (Gly) (hampir

sepertiga dari total asam amino), prolin (Pro) dan 4-hidroksiprolin (4Hyp).

Struktur gelatin yang umum adalah -Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-4Hyp-Gly-

Pro-. Kandungan 4-hidroksiprolin (4-Hyp) juga berpengaruh pada

kekuatan gelatin. Semakin tinggi asam amino ini, kekuatan gel juga lebih

baik. Meskipun gelatin mayoritas diturunkan dari hewan, gelatin

sebenarnya tergolong memiliki nilai biologis yang rendah dan sering juga

dianggap sebagai protein yang tidak lengkap. Pasalnya, gelatin kekurangan

kandungan triptopan (Trp) yang merupakan salah satu asam amino

esensial, serta rendah dalam sistein (Cys) dan tirosin (Tyr) (Jaswir, 2007).

10


Berikut beberapa komposisi asam amino yang terdapat dalam gelatin

dengan berbagai sumber bahan baku yang berbeda:

Gambar 2.4 Komposisi Asam Amino Gelatin dari Beberapa Jenis Bahan

Baku (Fischer, 2012).

2.4 Validasi Metode Analisa

Syarat utama dari suatu penelitian yang dapat diterima dan layak

untuk dipublikasi terutama untuk penelitian yang bersifat kuantitatif yaitu

data yang diperoleh harus valid, data atau hasil dari penelitian tersebut

harus memenuhi persyaratan dan dapat dipertanggung jawabkan

kebenarannya untuk mendapatkan suatu data yang valid maka dibutuhkan

metode yang valid pula. Salah satu cara agar suatu metode dikatakan valid

adalah dengan cara melakukan suatu validasi metode.

Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk

membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk

penggunaannya (Harmita, 2004). Beberapa manfaat validasi metode

analisis adalah untuk mengevaluasi suatu kerja metode analisis, menjamin

suatu prosedur analisis, menjamin keakuratan dan keterulangan hasil

prosedur anlisis dan mengurangi resiko penyimpangan yang mungkin

timbul (Wulandari, 2007).

11


2.4.1 Parameter Validasi Metode

Menurut Harmita (2004) ada beberapa parameter analisis yang

harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis, yaitu:

1. Kecermatan (Accuracy)

Kecermatan adalah ukuran yang menunjukan kedekatan hasil yang

diperoleh dari hasil pengamatan dengan hasil yang sebenarnya.

Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik

di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai

kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi

galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah

dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan

suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat dan sesuai prosedur.

Untuk mendokumentasikan akurasi, ICH (2005)

merekomendasikan pengumpulan data dari 9 kali penetapan kadar dengan

3 konsentrasi yang berbeda (misal 3 konsentrasi dengan 3 kali replikasi).

Uji akurasi dinyatakan dengan persen differensial (% diff). Syarat akurasi

yang baik jika nilai rata-rata % diff tidak lebih dari ±2% (Harmita, 2006).

Perhitungan untuk menentukan % diff adalah sebagai berikut:

% diff =

Keterangan:

B = konsentrasi hasil analisis

A = konsentrasi sesungguhnya

2. Keseksamaan (Precision)

Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian

antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari

rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel

yang diambil dari campuran yang homogen. Keseksamaan diukur sebagai

simpangan baku atau simpangan baku relatif (%RSD). Keseksamaan dapat

12


dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability) atau ketertiruan

(reproducibility).

Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan

baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (KV) sebesar ≤ ±2% dan standar

deviasi (SD) sebesar ≤ ±2 (Harmita, 2004). Akan tetapi kriteria ini sangat

fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah

sampel, dan kondisi laboratorium. Ditemukan bahwa koefisien variasi

meningkat seiring dengan menurunnya konsentrasi analit. Keseksamaan

dapat dihitung dengan cara sebagai berikut:

Jika hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,..............xn, maka simpangan

bakunya adalah:

SD = √ )

)

Simpangan baku relatif (RSD) adalah:

RSD =

(Harmita, 2004)

3. Selektifitas (Spesifitas)

Selektifitas atau Spesifitas suatu metode adalah kemampuannya

yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan

adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel.

Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan

(degree of bias). Cara yang dapat digunakan untuk menentukan selektifitas

adalah dengan cara membandingkan hasil sampel yang mengandung

bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis,

senyawa asing lainnya, dengan hasil analisis sampel yang tidak

mengandung bahan lain yang ditambahkan. Penyimpangan hasil dapat

terlihat apabila ada selisih dari hasil uji kedua sampel.

13


4. Linearitas dan Rentang

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan

respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik

yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang

metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah

ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan

linearitas yang dapat diterima. Linearitas biasanya dinyatakan dalam

istilah variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung berdasarkan

persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit dalam

sampel dengan berbagai konsentrasi analit.

Di dalam pustaka, sering ditemukan rentang konsentrasi yang

digunakan antara 0-200%. Sebagai parameter adanya hubungan linier

digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier y=a+bx.

Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b=0 dan r=+1 atau –1

bergantung pada arah garis. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan

analisis instrumen yang digunakan. Nilai koefisien korelasi yang

memenuhi persyaratan adalah sebesar ≥ 0,9970 (ICH, 2005), ≥ 0,9700

(SNI) atau ≥ 0,9980 (AOAC, 2002)

5. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)

Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang

dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan

dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas

kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai

kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria

cermat dan seksama.

Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung

pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis

yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan

mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada

analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon

14


blangko beberapa kali. Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara

statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi.

Rumus untuk menghitung batas deteksi (LOD):

LOD =

Dan batas kuantitasi (LOQ):

LOQ =

Dimana Simpangan baku (Sb) sama dengan simpangan baku residual

(Sy/x.).

Sy/x = √ )

2.5 Spektrofotometri UV-VIS

Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi

antara radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia.

Teknik yang sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi

spektrofotometri ultraviolet, cahaya tampak, infra merah, dan serapan

atom. Menurut Ditjen POM (1995) daerah spektrum dapat dibagi menjadi

dalam:

1. Daerah ultraviolet : 190-380 nm

2. Daerah cahaya tampak : 380-780 nm

3. Daerah infra merah dekat : 780-3000 nm

4. Daerah infra merah : 2,5-40 µm atau 4000-250 cm-1

Spektrofotometri UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk

mengukur serapan yang dihasilkan dari interaksi kimia antara radiasi

elektromagnetik dengan molekul atau atom dari suatu zat kimia pada

daerah UV-Vis (Ditjen POM, 1995). Spektrofotometri UV-Vis adalah

teknik analisa spektroskopi yang memakai sumber radiasi elektromagnetik

ultraviolet (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai

instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis merupakan salah

satu metode yang sering digunakan baik untuk analisa kualitatif maupun

kuantitatif karena metode ini memiliki beberapa keuntungan, yaitu:

15


1. Dapat digunakan untuk analisis suatu zat dalam jumlah kecil

2. Cukup sensitif dan selektif

3. Pengerjaannya mudah dan sederhana

4. Biaya yang relatif murah

5. Dan mempunyai kepekaan analisis yang cukup tinggi (Munson, 1991).

2.5.1 Instrumentasi Spektrofotometri UV-VIS

Gambar 2.6 Skema Kerja Alat Spektrofotometri UV-Vis

(Sumber : wocono.wordpress.com)

Komponen spektrofotometri UV-Vis terdiri atas (Gholib dan Abdul, 2007;

Harmita, 2006)

1. Sumber lampu

Sumber lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada panjang

gelombang 190-380 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu

tungsten digunakan untuk daerah visibel (panjang gelombang antara

380-780 nm).

2. Monokromator

Monokromator digunakan untuk mendispersikan sinar kedalam

komponen-komponen panjang gelombangnya yang selanjutnya akan

dipilih oleh celah (slit). Monokromator akan memisahkan radiasi

cahaya putih yang polikromatis menjadi cahaya monokromatis

(mendekati monokromatis).

3. Kuvet

Wadah atau cell untuk menempatkan larutan.

16


4. Detektor

Mengubah energi radiasi yang mengenainya menjadi suatu besaran

yang dapat diukur.

5. Amplifer

Fungsinya untuk memperkuat sinyal listrik

6. Rekorder

Alat untuk mencatat dapat berupa gambar atau angka-angka

Prinsip kerja instrumen spektrofotometri UV-Vis :

Prinsip kerja dari spektrofotometri UV-Vis berdasarkan pada

penyerapan cahaya atau energi oleh suatu larutan. Jumlah cahaya atau

energi radiasi yang diserap memungkinkan pengukuran jumlah zat

penyerap dalam larutan secara kuantitatif. Cahaya adalah suatu bentuk

energi radiasi yang mempunyai sifat sebagai gelombang dan partikel.

Sifatnya sebagai gelombang dapat dilihat dengan terjadinya pembiasan

dan pemantulan cahaya oleh suatu medium sedangkan sifatnya sebagai

pertikel dapat dilihat dengan terjadinya efek foto listrik. Sedangkan energi

radiasi terdiri dari sejumlah besar panjang gelombang elektromagnetik

dengan panjang gelombang yang berbeda-beda (Pecsok et al., 1976;

Skoog and West, 1971).

Pada instrumen spektrofometer ultraviolet dan visible, suatu

sumber cahaya akan dipancarkan melalui monokromator. Monokromator

menguraikan sinar yang masuk dari sumber cahaya tersebut menjadi pita-

pita panjang gelombang yang diinginkan untuk pengukuran suatu zat

tertentu, dan menunjukkan bahwa setiap gugus kromofor mempunyai

panjang gelombang maksimum yang berbeda. Dari monokromator tadi

cahaya atau energi radiasi diteruskan dan diserap oleh suatu larutan yang

akan diperiksa di dalam kuvet. Kemudian jumlah cahaya yang diserap oleh

larutan akan menghasilkan signal elektrik pada detektor, yang mana signal

elektrik ini sebanding dengan cahaya yang diserap oleh larutan tersebut.

Besarnya signal elektrik yang dialirkan ke pencatat dapat dilihat sebagai

angka (Pecsok et al., 1976; Skoog and West 1971).

17


Metode Spektrofotometri ultraviolet dan visible berdasarkan pada

hukum LAMBERT-BEER. Hukum tersebut menyatakan bahwa jumlah

radiasi cahaya tampak, ultraviolet dan cahaya-cahaya lain yang diserap

atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen

dari konsentrasi zat dan tebal larutan. Hukum ini secara sederhana dapat

dinyatakan dalam rumus berikut:

A = log (Io/I1) = a b c

Io = Intensitas sinar datang

I1 = Intensitas sinar yang diteruskan

a = Absorbsivitas

b = Panjang sel atau kuvet

c = Konsentrasi (g/l)

Persyaratan suatu sampel dapat dianalisa menggunakan spektrofotometri

UV-Vis adalah :

1. Bahan mempunyai gugus kromofor

2. Bahan tidak mempunyai gugus kromofor tapi berwarna

3. Bahan tidak mempunyai gugus kromofor dan tidak berwarna, maka

ditambahkan pereaksi warna (Vis)

4. Bahan tidak mempunyai gugus kromofor dibuat turunannya yang

mempunyai gugus kromofor (UV). (Harmita, 2006).

Sampel yang sering dianalisis dengan metode spektroftometri UV-

Vis adalah senyawa organik yang memiliki gugus kromofor dan

ausokrom. Gugus kromofor adalah gugus fungsional tidak jenuh yang

memberikan serapan pada daerah ultraviolet atau cahaya tampak. Hampir

semua kromofor mempunyai ikatan rangkap seperti alkena (C=C), C=O, -

NO2, benzen, dan lain-lain. Sedangkan ausokrom adalah gugus fungsional

seperti –OH, -NH2, -X, yaitu gugus yang mempunyai elektron nonbonding

dan tidak mengabsorpsi radiasi pada λ diatas 200 nm (Harmita, 2006).

18


2.5.2 Tipe Instrumentasi Spektrofotometri UV-VIS

Tipe instrumentasi dari spektrofotometri UV-Vis terbagi menjadi

dua (Harmita, 2006):

1. Spektrofotometri Single Beam

Pada spektrofotometer UV-Vis tipe singel beam absorbsinya

berdasarkan pada sinar tunggal dimana sampel akan ditentukan

jumlahnya pada satu panjang gelombang atau fix wave lenght. Hasil

biasanya dibandingkan dengan blanko (biasanya pelarut).

Gambar 2.6 Skema Spektrofotometri UV-Vis Tipe Single Beam

(Sumber: www.slideshare.net)

Keterangan gambar skema spektrofotometri tipe single beam:

1. Dari celah mengeluarkan satu sinar monokromatis

2. Wadah atau kuvet yang dapat dilalui sinar hanya satu

3. Setiap perubahan panjang gelombang alat harus dinolkan

2. Spektrofotometri Double Beam

Pada spektrofotometri UV-Vis tipe double beam absorpsinya

siasanya mempunyai variabel panjang gelombang atau multi wave

length. Hasilnya bisa langsung dibandingkan dengan blanko

Gambar 2.7 Skema Spektrofotometri UV-Vis Tipe Double Beam

(Sumber: www.slideshare.net)

http://www.slideshare.net/

http://www.slideshare.net/

19


Keterangan gambar skema spektrofotometri tipe double beam:

1. Dari celah mengeluarkan dua sinar monokromatis

2. Sinar melalui dua wadah atau kuvet sekaligus

3. Alat hanya di auto zero satu kali dengan cara mengisi kedua kuvet

dengan larutan blanko.


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di laboratorium kimia obat dan laboratorium

penelitian II di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta sejak

bulan maret hingga agustus 2016.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Bahan Kimia

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah Standar

Asam Amino Hidroksiprolin (Trans-4-Hidroksi-L-Prolin) (Sigma),

Natrium Asetat Trihidrat (Merck), Asam Sitrat Monohidrat (Merck), Asam

Asetat Glasial (Merck), Asam Klorida 36,7% (J.T.Baker), Natrium

Hidroksida (Merck), Natrium Klorida (Merck), Isopropanol (Merck),

Chloramin T Hidrat (Sigma), 4-dimetilamino-benzaldehid (PDAB)

(Merck), Etanol Absolute (Merck), Asam Sulfat (Merck), Aquades dan

Sampel Gelatin.

3.2.2 Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Instrumen

Spektrofotometri UV-Vis Double Beam, timbangan analitik, shakingbath,

oven, vortex, micropipet dan tip, labu erlenmeyer, labu ukur, gelas kimia,

tabung reaksi, pH meter, batang pengaduk, alumunium foil, spatula, pipet

volume, dan pipet tetes.

21


3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyiapan Bahan Baku dan Pereaksi

1. Pembuatan larutan HCl 6 N

Larutan HCl 36,7% (12 N) dipipet sebanyak 50 ml kemudian

masukkan larutan ke dalam labu ukur 100 ml. Tambahkan aquades

sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.

2. Pembuatan larutan NaOH 4 N

Serbuk NaOH ditimbang sebanyak 16 gram kemudian

masukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Tambahkan aquades sampai

tanda batas dan kocok sampai homogen.

3. Pembuatan buffer asetat/sitrat pH 6 (George, 2009)

Masukkan 70 ml aquades ke dalam labu ukur 100 ml,

tambahkan 1,2 ml asam asetat glasial ke dalam labu secara perlahan,

tambahkan 5 gram asam sitrat monohidrat, 12 gram natrium asetat

trihidrat dan 3,4 gram natrium hidroksida, kocok sampai homogen dan

tambahkan aquades sampai 90 ml, cukupkan pH sampai 6 dengan

menambahkan HCl atau NaOH kemudian tambahkan aquades sampai

100 ml dan cek pH kembali.

4. Pembuatan NaCl 0,3 M

Serbuk NaCl ditimbang sebanyak 8,775 gram diatas timbangan

analitik, masukkan serbuk ke dalam labu ukur 500 ml. Tambahkan

aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.

5. Pembuatan larutan chloramin T 7% (w/v)

Serbuk Chloramin ditimbang sebanyak 350 mg diatas timbangan

analitik, masukkan serbuk ke dalam labu ukur 5 ml. Tambahkan

aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.

22


6. Pembuatan larutan oksidan (Chloramin T 7% (w/v) dan buffer

asetat/sitrat pH 6 rasio 1:4 (v/v))

Larutan Chloramin 7% dipipet sebanyak 2 ml, masukkan larutan

ke dalam labu ukur 10 ml kemudian tambahkan buffer asetat/sitrat pH

6, sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.

7. Pembuatan reagen ehrlich (George, 2009)

Serbuk p-dimetilamino-benzaldehid (PDAB) ditimbang

sebanyak 12 gram kemudian tambahkan 20 ml etanol absolut (larutan

A), selanjutnya larutan asam sulfat dipipet sebanyak 2,74 ml kemudian

tambahkan 20 ml etanol absolut (larutan B). Tambahkan larutan B ke

dalam larutan A kemudian aduk sampai homogen lalu masukkan

larutan ke dalam kulkas dan tunggu larutan sampai terbentuk kristal.

8. Pembuatan larutan induk hidroksiprolin 1000 ppm

Serbuk standar hidroksiprolin ditimbang sebanyak 10 mg diatas

timbangan analitik, kemudian masukkan serbuk ke dalam labu ukur 10

ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai

homogen.

9. Pembuatan larutan standar 100 ppm

Dipipet sebanyak 5 ml dari larutan induk hidroksiprolin 1000

ppm secara kuantitatif, kemudian masukkan larutan ke dalam labu

ukur 50 ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai

homogen.

10. Pembuatan larutan hidroksiprolin konsentrasi 3, 6, 9, 12, 15, dan 18

ppm

Dipipet sebanyak 0,3, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, dan 1,8 ml dari larutan

standar hidroksiprolin 100 ppm, kemudian masing-masing larutan

dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml. Tambahkan aquades sampai

tanda batas dan kocok sampai homogen. Masukkan masing-masing

23


larutan (10 ml) ke dalam labu ukur 25 ml kemudian tambahkan 2 ml

buffer asetat/sitrat pH 6 dan tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai

tanda batas dan kocok sampai homogen.

3.3.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum 9 ppm

Larutan standar hidroksiprolin 100 ppm dipipet sebanyak 0,9 ml,

kemudian masukkan larutan ke dalam labu ukur 10 ml. Tambahkan

aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen. Masukkan semua

larutan (10 ml) ke dalam labu ukur 25 ml kemudian tambahkan 2 ml

buffer asetat/sitrat pH 6 dan tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai tanda

batas dan kocok sampai homogen. Pipet sebanyak 1 ml larutan yang telah

dibuat dan masukkan larutan ke dalam tabung reaksi tertutup lalu

tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan 600 µl kemudian

vortex selama 4 menit. Selanjutkan tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4

ml ke dalam tabung dan inkubasi selama 25 menit pada suhu 60oC diatas

shakingbath. Amati serapan dengan menggunakan alat spektrofotometri

UV-Vis pada panjang gelombang 400-800 nm.

3.3.3 Validasi Metode

1. Pembuatan kurva kalibrasi 3, 6, 9, 12, 15, 18 ppm dan penentuan

linearitas

Larutan hidroksiprolin konsentrasi 3 ppm dipipet sebanyak 1 ml

kemudian masukkan larutan ke dalam tabung reaksi tertutup lalu

tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan 600 µl kemudian

vortex selama 4 menit. Selanjutkan tambahkan reagen ehrlich

sebanyak 4 ml ke dalam tabung dan inkubasi selama 25 menit pada

suhu 60oC diatas shakingbath. Amati serapan dengan menggunakan

alat spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 400-800 nm.

Dilakukan perlakuan yang sama untuk konsentrasi 6, 9, 12, 15, dan 18

ppm. Kemudian dibuat kurva kalibrasi sampai didapat persamaan

linear y=a+bx. Linearitas dari kurva kalibrasi dilihat dengan

menghitung koefisien korelasi (r) dari persamaan regresi linear.

24


2. Penentuan batas deteksi / limit of detection (LOD) dan batas

kuantitasi/ limit of quantitation (LOQ).

LOD dihitung melalui persamaan garis regresi linear dari kurva

kalibrasi dengan rumus:

LOD =

Sedangkan LOQ dihitung dengan rumus:

LOQ =

Dimana Simpangan baku (Sb) sama dengan simpangan baku residual

(Sy/x.), b adalah slope dari persamaan regresi.

Sy/x = √

3. Uji kecermatan (Akurasi)

Pada uji kecermatan dibuat larutan dengan konsentrasi 5, 10 dan

16 ppm dari larutan standar hidroksiprolin 100 ppm. Untuk konsentrasi

5 ppm, dipipet sebanyak 0,5 ml dari larutan standar hidroksiprolin 100

ppm, masukkan ke dalam labu ukur kemudian tambahkan aquades

sampai tanda batas kocok sampai homogen. Lalu untuk konsentrasi 10

ppm dipipet sebanyak 1 ml larutan standar hidroksiprolin 100 ppm

masukkan ke dalam labu ukur kemudian tambahkan aquades sampai

tanda batas kocok sampai homogen. Kemudian untuk konsentasi 16

ppm dengan mengukur 1,6 ml larutan standar hidroksiprolin 100 ppm,

masukkan ke dalam labu ukur kemudian tambahkan aquades sampai

tanda batas kocok sampai homogen. Labu ukur yang digunakan

volume 10 ml. Masukkan masing-masing larutan (10 ml) ke dalam

labu ukur 25 ml kemudian tambahkan 2 ml buffer asetat/sitrat pH 6

dan tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai tanda batas dan kocok

sampai homogen. Masing-masing konsentrasi dibuat 3 kali

pengulangan sehingga diperoleh 9 larutan.

25


Dari masing-masing konsentrasi dipipet sebanyak 1 ml larutan

yang telah dibuat dan masukkan larutan ke dalam tabung reaksi

tertutup lalu tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan 600 µl

kemudian vortex selama 4 menit. Selanjutkan tambahkan reagen

ehrlich sebanyak 4 ml ke dalam tabung dan inkubasi selama 25 menit

pada suhu 60oC diatas shakingbath. Amati serapan dengan

menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang

400-800 nm.

Nilai akurasi dapat diperoleh dengan menghitung nilai % diff,

dengan cara mengurangi nilai konsentrasi dari hasil analisis dengan

nilai konsentrasi yang sebenarnya dibagi nilai konsentrasi sebenarnya

dan dikali seratus persen. Syarat % diff yang dapat diterima yaitu tidak

lebih dari ±2% (Harmita, 2006).

% diff =

4. Uji keseksamaan (presisi)

Dibuat larutan hidroksiprolin dengan konsentrasi 5 ppm, 10

ppm, dan 16 ppm. Masing-masing konsentrasi dibuat 3 kali

pengulangan sehingga diperoleh 9 larutan. Setelah dipreparasi sesuai

prosedur. Larutan hidroksiprolin diukur absorbansinya menggunakan

spektrofotometri UV-Vis. Kemudian dihitung standar deviasi (SD) dan

persentase simpangan baku relatif atau %RSD (Relative Standard

Deviation) dari masing-masing konsentrasi dengan nilai ≤ ±2%

(Harmita, 2004).

SD = √

Simpangan baku relatif (RSD) :

RSD =

26


3.3.4 Analisis Sampel Gelatin Secara Kuantitatif

Kandungan hidroksiprolin dalam sampel gelatin ditentukan

menggunakan metode ISO (1978) dengan sedikit modifikasi (Rafik et al.,

2011). Sampel gelatin ditimbang sebanyak 10 mg diatas timbangan

analitik. Sampel gelatin dihidrolisis dengan HCl 6 N sebanyak 5 ml dan

diinkubasi selama 12 jam pada suhu 110oC di dalam oven. Setelah

diinkubasi larutan sampel dinetralkan dengan cara menambahkan NaOH 4

N. Larutan yang telah netral kemudian dipipet sebanyak 1 ml dan

dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml kemudian tambahkan larutan buffer

asetat/sitrat pH 6 sebanyak 2 ml dan tambahkan larutan NaCl 0,3 M

sampai tanda batas dan kocok sampai homogen. Larutan sampel dipipet

sebanyak 1 ml ke dalam tabung reaksi tertutup lalu tambahkan isopropanol

300 µl dan larutan oksidan 600 µl kemudian vortex larutan selama 4

menit. Selanjutnya tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4 ml dan inkubasi

selama 25 menit pada suhu 60oC diatas shakingbath. Amati serapan

dengan menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis pada panjang

gelombang 400-800 nm. Kadar asam amino hidroksiprolin dalam sampel

dapat dihitung menggunakan persamaan regresi dari kurva kalibrasi yang

telah dibuat.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Hidroksiprolin merupakan asam amino turunan dari prolin. Asam

amino ini adalah hasil dari reaksi prolin yang dikatalisis oleh enzim prolil-

4-hidroksilase di lumen retikulum endoplasma pada saat posttranslasi

protein. Hidroksiprolin dapat ditemukan pada jaringan hewan, sel tanaman

dan ganggang hijau. Selain itu hidroksiprolin juga dapat ditemukan dalam

gelatin dan merupakan salah satu parameter dalam menentukan kualitas

suatu gelatin.

Pada gelatin hidroksiprolin memiliki fungsi sebagai penstabil triple

helix. Semakin tinggi asam amino hidroksiprolin maka semakin baik

kualitas gelatin tersebut. Gelatin juga memiliki fungsi yang masih sulit

untuk digantikan dalam industri pangan dan obat-obatan. Hal ini

dikarenakan gelatin memiliki fungsi yang banyak yaitu dapat berfungsi

sebagai pengisi, pengemulsi, pengikat tablet, pengendap, pemerkaya giji,

dan dapat membentuk lapisan tipis yang elastis.

Validasi metode penetapan kadar asam amino hidroksiprolin pada

penelitian ini menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis. Metode

spektrofotometri UV-Vis merupakan metode yang pengerjaannya mudah

dan sederhana namun cukup sensitif dan selektif serta dapat mengukur

kadar dalam jumlah yang kecil. Selain itu metode ini juga mempunyai

kepekaan analisis yang cukup tinggi dan pengerjaannya yang relatif

murah. Syarat suatu senyawa dapat diukur serapannya dengan alat

spektrofotometri UV-Vis adalah senyawa tersebut memiliki gugus

kromofor dan ausokrom sehingga dapat diukur serapannya pada daerah

ultraviolet dan daerah visible. Daerah UV-Vis berada pada daerah 190-780

nm.

Asam amino hidroksiprolin merupakan asam amino yang tidak

mempunyai gugus kromofor sehingga tidak mempunyai serapan pada

daerah UV-Vis. Gugus kromofor merupakan gugus kovalen tidak jenuh

yang memberikan serapan pada daerah ultraviolet dan daerah visible.

28


Hampir semua gugus kromofor memiliki ikatan rangkap seperti C=C,

C=O, NO2, cincin benzen dan lain-lain.

Oleh karena itu pada penetapan kadar asam amino hidroksiprolin

harus dilakukan derivatisasi. Derivatisasi bertujuan untuk mengubah

hidroksiprolin menjadi berwarna dan dapat dibaca serapannya oleh alat

spektrofotometri UV-Vis. Proses derivatisasi pada penelitian ini dilakukan

dengan cara membuat larutan hidroksiprolin dengan konsentrasi yang

diinginkan. Selanjutnya dilakukan penambahan reagen untuk mengubah

larutan hidroksiprolin tersebut menjadi berwarna. Reagen yang

ditambahkan ke dalam larutan hidroksiprolin yaitu buffer asetat/sitrat pH

6, NaCl, isopropanol, larutan oksidan, dan reagen ehrlich.

Penambahan larutan buffer atau larutan penyangga ke dalam

larutan hidroksiprolin berfungsi untuk mempertahankan nilai pH (derajat

keasaman) agar tidak banyak berubah selama reaksi berlangsung dengan

penambahan sedikit asam kuat atau basa kuat serta pengenceran oleh air.

Pada penelitian ini buffer yang digunakan yaitu larutan buffer asetat/sitrat

dengan pH 6 karena reaksi yang ideal terjadi pada pH 6. Larutan NaCl

ditambahkan agar larutan hidroksiprolin lebih stabil sehingga serapan yang

terbaca oleh alat spektrofotometri UV-Vis lebih stabil. Penambahan

larutan isopropanol berfungsi untuk membantu pelarutan oksidan yang

akan ditambahkan ke dalam larutan hidroksiprolin yang telah dibuat

sehingga larutan yang akan terbentuk lebih homogen. Larutan oksidan

terdiri atas chloramin T hidrat dan larutan buffer asetat/sitrat pH 6.

Penambahan larutan oksidan berfungsi untuk mengubah hidroksiprolin

menjadi pirol-2-karboksilat atau pirol. Selanjutnya larutan hidroksiprolin

ditambahkan reagen ehrlich yang terdiri dari PDAB (para-dimetilamino-

benzaldehid), etanol absolut dan asam sulfat. Penambahan reagen ehrlich

berfungsi untuk mengubah larutan menjadi berwarna. Larutan

hidroksiprolin yang telah ditambahkan reagen ehrlich akan berwarna

kuning. Setelah larutan di inkubasi pada suhu 60oC selama 25 menit

larutan akan berubah menjadi berwarna merah, fungsi dari pemanasan

sendiri agar reaksi terjadi lebih cepat. Semakin tinggi kadar hidroksiprolin

29


maka warna merah yang dihasilkan akan semakin pekat. Hidroksiprolin

hasil dari derivatisasi mempunyai serapan pada daerah visible. Daerah

visible berada pada daerah 380-780 nm.

Gambar 4.1 Proses Oksidasi Hidroksiprolin Menjadi Pirol

Penelitian didahului dengan proses penentuan panjang gelombang

maksimum atau serapan maksimum dari larutan hidroksiprolin yang

sebelumnya telah diderivatisasi sehingga menjadi berwarna menggunakan

spektrofotometri UV-Vis pada rentang panjang gelombang 400-800 nm.

Menurut beberapa literatur hidroksiprolin yang telah diderivatisasi

memiliki panjang gelombang maksimum pada 560 nm (George, 2009),

660 nm (Rafik et al., 2011), 558 nm (Jitender et al., 2012).

Gambar 4.2 Panjang Gelombang Maksimum Hidroksiprolin

Setelah dilakukan pengukuran panjang gelombang maksimum

sebanyak 3 kali pengulangan dihasilkan panjang gelombang maksimum

30


pada serapan 563.5 nm. Spektrum hidroksiprolin pada spektrofotometri

UV-Vis dapat dilihat pada Gambar 4.2. Penentuan panjang gelombang

maksimum hidroksiprolin dilakukan agar dapat mengetahui daerah dimana

hidroksiprolin memberikan serapan warna maksimal yang dapat diabsorbsi

oleh alat spektroftometri UV-Vis, sehingga dapat dihasilkan nilai berupa

absorbansi.

4.2 Validasi Metode

Syarat utama dari suatu penelitian yang dapat diterima dan layak

untuk dipublikasi terutama untuk penelitian yang bersifat kuantitatif yaitu

data yang diperoleh harus valid. Untuk mendapatkan suatu data yang valid

maka dibutuhkan metode yang valid pula. Salah satu cara agar suatu

metode dikatakan valid adalah dengan cara melakukan suatu validasi

metode. Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk

membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk

penggunaannya (Harmita, 2004). Parameter validasi yang akan ditetapkan

pada penelitian ini yaitu pembuatan kurva kalibrasi dan uji lineariras, LOD

(Limit of Detection), LOQ (Limit of Quantitation), uji akurasi (% diff), uji

presisi (%RSD dan SD).

4.2.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas

Pada validasi metode diawali dengan pembuatan kurva kalibrasi.

Kurva kalibrasi merupakan hubungan antara nilai absorbansi terhadap

konsentrasi. Kurva kalibrasi yang dihasilkan dapat digunakan untuk uji

linearitas. Tujuan dari uji linearitas yaitu untuk membuktikan adanya

hubungan linear antara konsentrasi zat yang sebenarnya dengan respon

alat. Linearitas atau kecenderungan korelasi antara dua variabel biasanya

dinyatakan dalam koefisien korelasi (r). Linearitas yang baik atau adanya

korelasi yang erat ditunjukan dengan harga koefisein korelasi mendekati

atau sama dengan 1. Menurut AOAC (2002) syarat uji linearitas yang baik

yaitu dengan nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,9980.

31


Pada pembuatan kurva kalibrasi dibuat deret larutan standar

hidroksiprolin dari larutan induk hidroksiprolin 100 ppm. Konsentrasi

yang digunakan pada kurva kalibrasi adalah 7 konsentrasi yang bertingkat

yaitu 0 ppm, 3 ppm, 6 ppm, 9 ppm, 12 ppm, 15 ppm dan 18 ppm.

Gambar 4.3 Kurva Kalibrasi Hidroksiprolin

Berdasarkan hasil kurva yang didapat pada Gambar 4.3

menunjukan bahwa nilai absorbansi yang dihasilkan meningkat sejajar

dengan peningkatan konsentrasi hidroksiprolin. Dari kurva kalibrasi

hidroksiprolin didapatkan persamaan linier antara konsentrasi dan

absorbansi yaitu y=0,0312x-0,0026 dengan nilai koefisien korelasi yaitu

r=0,9991. Berdasarkan hasil yang diperoleh nilai koefisien korelasi yang

didapat telah memenuhi persyaratan AOAC (2002) yaitu ≥ 0,9980.

Persamaan linear yang dihasilkan dapat digunakan untuk mencari

konsentrasi hidroksiprolin dalam sampel dengan memasukkan nilai

absorbansi. Data hasil percobaan dapat dilihat selengkapnya pada lampiran

5 tabel 5.1.

y = 0,0312x - 0,0026 R² = 0,9991

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20

Ab

sorb

an

si

Konsentrasi

Kurva Kalibrasi Hidroksiprolin

Series1

Linear (Series1)

32


4.2.2 Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi

Setelah didapatkan kurva kalibrasi yang telah memenuhi

persyaratan selanjutnya data yang diperoleh dapat diolah untuk

menentukan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ). Batas

deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi

yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko

(Harmita, 2004). Sedangkan batas kuantitasi adalah kuantitas terkecil

analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan

seksama. Batas deteksi (LOD) dari pengujian yaitu 0,691 ppm sedangkan

batas kuantitasi (LOQ) yaitu 2,094 ppm. Data mengenai uji batas deteksi

dan batas kuantitasi dapat dilihat pada tabel 4.1 dan data hasil percobaan

selengkapnya tercantum pada lampiran 6 tabel 5.2.

Tabel 4.1 Hasil Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Hidroksiprolin

4.2.3 Uji Kecermatan (Akurasi)

Selanjutnya dilakukan uji kecermatan atau uji akurasi. Kecermatan

adalah ukuran yang menunjukan kedekatan hasil yang diperoleh dari hasil

pengamatan dengan hasil yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan

sebagai % diff. ICH Guideline (2005) merekomendasikan uji akurasi

dilakukan dengan menggunakan minimal 9 kali penentuan terhadap

minimal 3 tingkat konsentrasi yang mencakup rentang konsentrasi yang

telah ditetapkan. Pada penelitian ini uji kecermatan dilakukan dari 3

konsentrasi berbeda hidroksiprolin yaitu 5 ppm, 10 ppm dan 16 ppm.

Masing-masing konsentrasi dibuat 3 kali pengulangan sehingga diperoleh

Parameter Nilai

0,00021361

S (y/x) 0,006536207

LOD (Limit of Detection) 0,691 ppm

LOQ (Limit of Quantitation) 2,094 ppm

33


9 larutan. Selanjutnya masing-masing larutan diukur serapannya

menggunakan spektrofotometri UV-Vis.

Kadar

(ppm)

Rata-rata

% diff Rata-Rata % diff

5 0,384

-0,386 10 -1,089

16 -0,454

Tabel 4.2 Hasil Uji Rata-Rata % diff

Dari percobaan yang dilakukan didapatkan nilai rata-rata % diff

masing-masing konsentrasi yaitu untuk konsentrasi 5 ppm nilai rata-rata %

diff sebesar 0,384%, untuk konsentrasi 10 ppm nilai rata-rata % diff

sebesar -1,089%, untuk konsentrasi 16 ppm nilai rata-rata% diff sebesar

-0,454%. Syarat nilai % diff yang baik yaitu tidak lebih dari +2% dan -2%

(Harmita, 2006). Hasil rata-rata % diff semua konsentrasi yaitu -0,386%.

Dari hasil percobaan yang dilakukan diperoleh data yang telah memenuhi

persyaratan sehingga dapat dikatakan memberikan hasil uji akurasi yang

baik sehingga metode analisis yang dilakukan cukup akurat dan dapat

memberikan hasil yang baik pada pengukuran sampel. Hasil uji akurasi

dapat dilihat pada Tabel 4.2 Data hasil uji presisi selengkapnya dapat

dilihat pada Lampiran 7 tabel 5.3.

4.2.4 Uji Keseksamaan (Presisi)

Uji selanjutnya yang dilakukan yaitu uji keseksamaan (uji presisi).

Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara

hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-

rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang

diambil dari campuran yang homogen. Pada uji presisi dilakukan pada 3

konsentrasi yaitu 5 ppm, 10 ppm, dan 16 ppm. Dibuat 3 kali pengulangan

masing-masing konsentrasi sehingga diperoleh 9 larutan. Selanjutnya

34


masing-masing larutan diukur serapannya menggunakan spektrofotometri

UV-Vis.

Tabel 4.3 Hasil Uji Rata-Rata Presisi

Dari percobaan yang dilakukan untuk konsentrasi 5 ppm diperoleh

nilai %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar 0,035% dan nilai SD

(Standard Deviation) sebesar 0,178, untuk konsentrasi 10 ppm diperoleh

nilai %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar 0,021% dan nilai SD

(Standard Deviation) sebesar 0,215, dan untuk konsentrasi 16 ppm

diperoleh nilai %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar 0,092% dan

nilai SD (Standard Deviation) sebesar 1,477. Syarat uji presisi yang baik

yaitu nilai %RSD (Relative Standard Deviation) ≤ ±2% dan nilai SD

(Standard Deviation) sebesar ≤ ±2 (Harmita, 2004). Hasil rata-rata %RSD

semua konsentrasi yaitu 0,050% dan rata-rata standar deviasi semua

konsentrasi yaitu 0,623. Dari hasil percobaan yang telah dilakukan

diperoleh data yang telah memenuhi persyaratan sehingga dapat dikatakan

memberikan hasil presisi atau keseksamaan yang baik. Hasil uji presisi

dapat dilihat pada Tabel 4.3. Data hasil uji presisi selengkapnya dapat

dilihat pada Lampiran 8 tabel 5.4.

Kadar (ppm) Rata-rata kadar yang

diperoleh (ppm) SD RSD (%)

5 5,019 0,178 0,035

10 9,891 0,215 0,021

16 15,927 1,477 0,092

Rata-rata 0,623 0,050

35


Tabel 4.4 Hasil Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino

Hidroksiprolin

Berdasarkan hasil yang diperoleh dapat dilihat bahwa semua hasil

uji yang didapat telah memenuhi syarat sebagai parameter uji validasi

metode penetapan kadar hidroksiprolin. Sehingga metode yang digunakan

untuk penetapan kadar hidroksiprolin dikatakan valid dan dapat

memberikan hasil yang baik dalam pengukuran sampel selanjutnya.

4.3 Analisis Sampel Gelatin

Pada proses preparasi sampel gelatin, dilakukan reaksi hidrolisis

asam terlebih dahulu menggunakan HCl 6 N pada suhu 110oC

selama 12

jam dalam tabung kaca tertutup agar sampel tidak menguap pada saat di

inkubasi dalam oven. Hidrolisis ini dilakukan untuk memecah ikatan amin

pada asam amino sehingga diperoleh asam amino dalam keadaan bebas.

Setelah sampel dihidrolisis dengan HCl 6 N sampel dinetralkan dengan

penambahan NaOH 4 N. Larutan yang telah netral dipreparasi sesuai

prosedur. Larutan sampel yang mengandung hidroksiprolin akan berubah

warna menjadi merah. Selanjutnya masing-masing larutan sampel diukur

absorbansinya menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada panjang

gelombang maksimal 563,5 nm.

No Parameter Hasil Persyaratan

1. Koefisien korelasi (r) 0,9991 0,9980 (AOAC,

2002)

2. LOD (Limit of Detection) 0,691 ppm -

3. LOQ (Limit of Quantitation) 2,094 ppm -

4. Akurasi % diff -0,384 ≤ ±2% (Harmita,

2006)

5. Presisi

% RSD 0,050 ≤ ±2% (Harmita,

2004)

SD 0,623 ≤ ±2 (Harmita,

2004)

36


Gambar 4.4 Grafik Hasil Analisis Kadar Hidroksiprolin Dalam Sampel

Gelatin

Hasil dari penetapan kadar dari seluruh sampel yang telah diperiksa

akan menghasilkan data absorbansi. Kadar hidroksiprolin dalam sampel

dapat dihitung menggunakan persamaan linier yang didapat dari kurva

kalibrasi yaitu y=0,0312x-0,0026 dengan cara memasukkan nilai

absorbansi sampel. Sampel pertama yaitu sampel sapi dan diperoleh rata-

rata absorbansi setelah 3 kali pengukuran sebesar 0,255 dan kadar

hidroksiprolin dalam sampel yang diperoleh sebesar 8,277 ppm. Sampel

kedua yaitu sampel babi dan diperoleh rata-rata absorbansi setelah 3 kali

pengukuran sebesar 0,430 dan kadar hidroksiprolin dalam sampel yang

diperoleh sebesar 13,886 ppm. Sampel ketiga yaitu sampel sapi dan

diperoleh rata-rata absorbansi setelah 3 kali pengukuran sebesar 0,313 dan

kadar hidroksiprolin dalam sampel yang diperoleh sebesar 10,126 ppm.

Sampel keempat yaitu sampel sapi dan diperoleh rata-rata absorbansi

setelah 3 kali pengukuran sebesar 0,529 dan kadar hidroksiprolin dalam

sampel yang diperoleh sebesar 17,038 ppm. Sampel kelima yaitu sampel

kambing dan diperoleh rata-rata absorbansi setelah 3 kali pengukuran

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1

Grafik Kadar Hidroksiprolin Dalam Sampel Gelatin

Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3 Sampel 4 Sampel 5

37


sebesar 0,325 dan kadar hidroksiprolin dalam sampel yang diperoleh

sebesar 10,500 ppm. Semua sampel mengandung hidroksiprolin dengan

kadar yang berbeda-beda karena menggunakan sumber bahan baku yang

berbeda yaitu sapi, babi dan kambing. Pada sampel nomor 1, 3, dan 4

menggunakan bahan baku yang sama yaitu sapi tetapi proses ekstraksi

bahan baku menjadi gelatin dilakukan dengan cara yang berbeda sehingga

diperoleh kandungan kolagen pada gelatin yang berbeda pula. Hal ini

mengakibatkan kadar hidroksiprolin dalam gelatin juga tidak sama. Hasil

uji analisis sampel dapat dilihat pada Gambar 4.4. Data hasil analisis

hidroksiprolin pada sampel dapat dilihat selengkapnya pada lampiran 9

tabel 5.5.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Parameter validasi untuk penetapan kadar asam amino hidroksiprolin

meliputi uji linearitas, LOD (batas deteksi), LOQ (batas kuantitasi), uji

akurasi (% diff), dan uji presisi (relatif standar deviasi dan standar

deviasi). Berdasarkan hasil validasi metode tersebut dapat disimpulkan

bahwa metode analisis hidroksiprolin yang digunakan dalam penelitian

ini valid karena telah memenuhi persyaratan.

2. Sampel pertama mengandung hidroksiprolin sebesar 8,277 ppm,

sampel kedua sebesar 13,886 ppm, sampel ketiga sebesar 10,126 ppm,

sampel keempat sebesar 17,038 ppm dan sampel kelima sebesar

10,500 ppm.

5.2 Saran

Sebaiknya pada penelitian selanjutnya dilakukan analisis penetapan

kadar hidroksiprolin dalam produk yang beredar dipasaran seperti kapsul

lunak dan kapsul keras.


DAFTAR PUSTAKA

Almatsier, S. 2006. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama.

Amin, B., Viviane, P., Alain, R., Jacques, P.B. 1982. A New Sensitive Method for

the Quantitative Evaluation of the Hydroxyproline Isomers. Analytical

Biochemistry, 122:52-57.

Anonim. 2005. ICH Harmonised Tripartite Guideline, Validation of Analytical

Procedures : Text and Methodology.

Ardianingsih, Retno. 2009. Penggunaan HPLC Dalam Deteksi ION. Berita

Dirgantara, 4 (10):101-104.

Association of Analytical Communities. 2002. AOAC Guidelines for Single

Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplement and

Botanicals.

Bailey, P.D. 1990. An Introduction to Peptide Chemistry. Wiley Interscience.

New York.

Bustillos, R.J.A., C.W. Olsen., D.A. Olson, B. Chiou, E. Yee, P.J. Bechtel and

T.H. McHugh. 2006. Water vapor permeability of mammalian and fish

gelatin films. Journal of Food Science, 4(71):202-207.

Cassab, Gladys I. 1998. Plant Cell Wall Protein. Plant Mol Biol, 49:281-309.

Daniela, O.A. 2014. Study and determination of meat products quality. Journal of

Agroalimentary Processes and Technologies, 20(4):363-368.

Darwin, J.Prockop and Sidney, Udenfriend. 1960. Specific Method for the

Analysis of Hydroxyproline in Tissues and Urine. Analytical Biochemistry,

1:228-239.

Dewi, H., and Iriane, S. 2007. Pengenalan dan Proses Pembuatan Gelatin. Jurnal

ilmu-ilmu pertanian, 1(3):39-48.

Dhillon, M.K. Sandeep,K., G.T,Gujar. 2014. A Common HPLC-PDA Method For

Amino Acid Analysis In Insects and Plants. Indian Journal of Experimental

Biologi, 52:73-79.

Ditjen POM. 1995. Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta: Departemen

Kesehatan RI. Jakarta.

Elijah, Adams and Leonard, Frank. 1980. Metabolism of Proline And The

Hydroxyproline. Ann. Rev. Biochem, 49:1005-1061.

40


Eriawan, R., Idah, R., Prasetyawan, Y., Olivia, B., Erna, Y. 2013. Efektifitas

Khasiat Pengobatan Luka Bakar Sediaan Gel Mengandung Fraksi Ekstrak

Pegagan Berdasarkan Analisis Hidroksiprolin dan Histopatologi Pada Kulit

Kelinci. Bul Penelit Kesehatan, 1(41):45- 60.

Fischer, E. 1902. Gelatin Manufacturers Institute of America.USA. 35:2660-2665.

George, Carlson. 2009. Determination of Hydroxyproline Content as a Measure of

Fibrosis in Nondystrophic and Dystrophic Skeletal Muscle.

Gholib, Ibnu dan Abdul, Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta :

Pustaka Pelajar.

Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksananaan Validasi Metoda dan Cara

Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian, 3(1):117-135.

Harmita. 2006. Analisa Fisikokimia. Jakarta : UI Press.

Jaswir, Irwandi. 2007. Memahami Gelatin, http//www.BeritaIptek.Com.

Jitender, K.J., A. Devi, Varaprasad, Reddy, Sunita,M, Hanjabam, M.D., G. Vidya

Sagar Reddy and G. Venkateshwarlu. 2012. Characterization of fish gelatin

from Blackspotted Croaker (Protonibea diacanthus). Archives of Applied

Science Research, 4(3):1353-1358.

Jun, G., Yi, Z., Guiyou,Z., Chengyin,W., Qishu,Q., Xiaoya,H,. Guoxiu,W. 2014.

Determination of Proline, Hydroxyproline, and N–Ethylglycine In Urine By

Using A New HPLC Labeling Reagent and its Application In Detection of

Tumor Markers. Journal of Liquid Chromatography & Related

Technologies.

Kelly, L., Gorres, Ronald, T., Raines. 2010. Review Artikel Prolyl 4-hydroxylase.

USA. University of Wisconsin Madison.

Merinda, H. 2013. Analisis Kadar Protein dan Identifikasi Asam Amino Pada

Ikan Patin. Jurusan Kimia Universitas Jember. (Skripsi).

Munson, J.W. 1991, Analisis Farmasi Metode Modern. Surabaya : Airlangga

University Press.

N. Yu. Ignat’eva., N. A. Danilov., S. V. Averkiev., M. V. Obrezkova., V. V.

Lunin., E. N. Sobol,. 2007. Determination of Hydroxyproline in Tissues and

the Evaluation of the Collagen Content of the Tissues. Journal of Analytical

Chemistry, 1(62):51-57.

41


Pecsok, R.L., L.D.Shileds, T. Cairns, and I.G. Mcwilliam. 1976. Modern methods

of chemical analysis. 2nd ed. John Wiley and Sons, Inc.. New York.

Pier, A.B., Luca, M.C., Maria, R.S. 1997. A New Procedure for the Specific

High-Performance Liquid Chromatographic Determination of

Hydroxyproline. Journal of Chromatographic Science, Vol. 35.

Poedjiadi, A. 2009. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press.

Rafik, B., Mourad, J., Assaad, S., Nabil, S., Naima, N.A., Didier, G., Moncef, N.

2011. Extraction and functional properties of gelatin from the skin of

cuttlefish (Sepia officinalis) using smooth hound crude acid protease-aided

process. Journal Food Hydrocolloid.

Rajesh, Kamble, Shrangdher, S.T., Koli, J.M. 2014. Physico-Chemical Properties

Of Gelatin Extracted From Calta Skin (Calta Catla) (Hamilton, 1822).

Indian Journal of Fundamental and Applied Life Sciences, 4:328-337.

Rizky, A.R., Fatimah,N., Elok,M. 2013. Ekstraksi Gelatin dari Tulang Tenggiri

Melalui Proses Hidrolisis Menggunakan Larutan Basa. Jurusan Farmasi

UHAMKA Jakarta.

Sidik, Abubakar. 2009. Struktur dan Fungsi Protein Kolagen. Jurnal Pelangi Ilmu

5(2).

Shila, G. and Natasa, S.B. 2009. Wound healing properties of Carica papaya

latex: In vivo evaluation in mice burn model. Journal of

Ethnopharmacology, 121:338–341.

Skoog, D.A. and D.M. West. 1971. Principles of instrumental analysis. Holt,

Rinehart and Winston, Inc., New York.

Suzanne, M., et al. 1998. High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of

Amino Acid- and Peptide-Derived Chloramines. Journal of

Chromatographic Science, Vol. 36.

Tobias, L., Natividad, G.V., Ralf, H. 2007. Analysis of hydroxyproline isomers

and hydroxylysine by reversed-phase HPLC and mass spectrometry.

Journal of Chromatography B, 847:282-288.

Winarno, FG. 2008. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.

Wulandari, N. 2007, Validasi Metode Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet untuk

Penentuan Reserpin dalam Tablet Obat, Departemen Kimia FMIPA IPB,

Bogor. (Skripsi).

Yan, X., Xin, W., Xiao, J., Nai, Y., Kuo, C. 2014. Predicting Hydroxyproline and

Hydroxylysine in Proteins by Incorporating Dipeptide Position Specific

42


Propensity into Pseudo Amino Acid Composition. International Journal of

Molecular Sciences, 15:7594-7610.

43


LAMPIRAN

Lampiran 1. Skema Pembuatan Reagen

a. Skema pembuatan HCl 6 N

b. Skema pembuatan NaOH 4 N

c. Skema pembuatan NaCl 0,3 M

Dipipet sebanyak 50 ml larutan HCl

36,7%

Masukkan ke dalam labu ukur

100 ml

Tambahkan aquades sampai

tanda batas

Kocok sampai homogen

Ditimbang sebanyak 16 gram

NaOH


100 ml


tanda batas


Ditimbang sebanyak 877,5

gram NaCl


500 ml


tanda batas


44


d. Skema pembutan larutan chloramin T 7%

e. Skema pembuatan larutan oksidan

f. Skema pembuatan buffer asetat/sitrat pH 6

Ditimbang sebanyak 350 mg chloramin-

T-hidrat


5 ml


tanda batas


Dipipet sebanyak 2 ml larutan chloramin T

Masukkan larutan ke dalam labu ukur 10 ml

Tambahkan buffer asetat/sitrat pH 6

sampai tanda batas


Masukkan 70 ml aquades ke

dalam labu ukur 100 ml

Ditambah 1,2 ml asam asetat glasial

ke dalam labu secara perlahan

5 gram asam sitrat

monohidrat

12 gram natrium asetat

trihidrat

3,4 gram natrium hidroksida


90 ml

Cukupkan pH sampai 6

Tambahkan aquades sampai 100 ml dan cek

pH kembali

45


g. Skema pembuatan reagen ehrlich

PDAB ditimbang sebanyak 12 gram

Tambahkan 20 ml etanol absolut

Larutan A

Larutan asam sulfat dipipet sebanyak 2,74 ml

Tambahkan 20 ml etanol absolut

Larutan B

Tambahkan larutan B ke dalam larutan A

Aduk sampai homogen lalu masukkan larutan ke dalam

kulkas

Tunggu larutan sampai terbentuk kristal

46


Lampiran 2 Skema Kerja Pembuatan Larutan Blanko

Pipet aquades sebanyak 10 ml

larutan

Masukkan larutan ke dalam labu ukur

25 ml

Tambahkan 2 ml buffer asetat/sitrat

pH 6

Tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai

tanda batas


Pipet larutan sebanyak 1 ml

larutan

Masukkan larutan ke dalam tabung reaksi tertutup

Tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan

600 µl

Vortex selama 4 menit

Tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4

ml

Inkubasi selama 25 menit pada suhu 60oC

diatas shakingbath

Amati serapan dengan spektrofotometri UV-Vis pada panjang

gelombang 400-800 nm

47


Lampiran 3 Bagan Skema Kerja

a. Skema pembuatan larutan baku hidroksiprolin

Larutan Baku

Larutan baku induk hidroksiprolin 1000

ppm

Ditimbang sebanyak 10 mg standar hidroksiprolin

Masukkan serbuk ke dalam labu ukur 10 ml

Tambahkan aquades sampai tanda batas dan

kocok sampai homogen

Larutan baku kerja 100 ppm

Dipipet sebanyak 5 ml dari larutan induk hidroksiprolin 1

mg/ml

Masukkan larutan ke dalam labu ukur 50 ml

Tambahkan aquades sampai tanda batas dan

kocok sampai homogen

48


b. Skema penentuan panjang gelombang maksimum 9 ppm

Dipipet sebanyak 0,9 ml larutan

standar hidroksiprolin 100

ppm

Masukkan larutan ke dalam labu ukur

10 ml


tanda batas


Masukkan semua larutan (10 ml) ke

dalam labu ukur 25 ml


pH 6


tanda batas


Pipet sebanyak 1 ml larutan



600 µl



ml

Inkubasi selama 25 menit pada suhu

60oC diatas shakingbath

Amati serapan dengan

spektrofotometri UV-Vis pada panjang

gelombang 400-800 nm

49


c. Skema kerja pembuatan kurva kalibrasi 3, 6, 9, 12, 15, 18 ppm dan penentuan

linearitas

Pipet sebanyak 0,3, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, dan

1,8 ml dari larutan standar

hidroksiprolin 100 ppm

Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam labu ukur

10 ml

Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai

homogen

Masukkan masing-masing larutan (10 ml) ke dalam labu

ukur 25 ml


pH 6


tanda batas


Pipet masing-masing larutan sebanyak 1 ml

larutan

Masukkan masing-masing larutan ke

dalam tabung reaksi tertutup


600 µl



ml

Inkubasi selama 25 menit pada suhu 60oC

diatas shakingbath

Amati serapan dengan spektrofotometri UV-Vis pada

panjang gelombang 400-800 nm

50


Lampiran 4 Skema Analisis Hidroksiprolin dalam Sampel Gelatin Secara

Kuantitatif

Timbang sebanyak 10 mg

sampel

Hidrolisis sampel dengan

menambahkan HCl 6 N sebanyak 5 ml

Inkubasi sampel selama 12 jam

pada suhu 110oC di dalam oven

Sampel dinetralkan dengan cara

menambahkan NaOH 4 N

Pipet larutan sampel sebanyak

1 ml larutan

Masukkan larutan ke dalam labu

ukur 25 ml


pH 6

Tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai tanda

batas


Pipet larutan sebanyak 1 ml

larutan


Tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan 600 µl


Tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4 ml

Inkubasi selama 25 menit pada suhu

60oC diatas shakingbath

Amati serapan dengan spektrofotometri UV-Vis pada

panjang gelombang 400-800 nm

51


Lampiran 5 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas

Tabel 5.1 Hasil Data Uji Linearitas Larutan Standar Hidroksiprolin

Keterangan :

Persamaan regresi : y=0,0312x-0,0026

Koefisien korelasi (r) : 0,9991

Panjang gelombang maksimum : 563,5 nm

Konsentrasi (ppm) Absorbansi

0 0

3 0,089

6 0,185

9 0,280

12 0,368

15 0,455

18 0,568

52


Lampiran 6 Batas Deteksi dan Kuantitasi

Tabel 5.2 Hasil Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Hidroksiprolin

Konsentrasi (ppm) Absorbansi (y) y' y - y' (y - y')2

0 0 -0,0026 0,0026 0,00000676

3 0,0895 0,091 -0,0015 2,25E-06

6 0,1850 0,1846 0,0004 1,6E-07

9 0,2805 0,2782 0,0023 5,29E-06

12 0,3685 0,3718 -0,0033 1,089E-05

15 0,4555 0,4654 -0,0099 9,801E-05

18 0,5685 0,559 0,0095 9,025E-05

Jumlah 0,00021361

S(y/x) = √

= √

= √

= √ = 0,006536207

LOD =

=

= 0,691 ppm

LOQ =

=

= 2,094 ppm

53


Lampiran 7 Uji Kecermatan (Akurasi)

Tabel 5.3 Data Uji Akurasi (%diff)

Kadar

(ppm) Absorbansi

Kadar yang

diperoleh (ppm) % diff

Rata-rata

% diff

5

0,148 4,826 -3,461

0,384 0,159 5,179 3,589

0,155 5,051 1,025

10

0,300 9,698 -3,012

-1,089 0,320 10,339 3,397

0,298 9,634 -3,653

16

0,521 16,782 4,887

-0,454 0,503 16,205 1,282

0,459 14,794 -7,532

Rata-rata -0,386

54


Lampiran 8 Uji Keseksamaan (Presisi)

Tabel 5.4 Data Uji Keseksamaan Pada Tiga Konsentrasi Hidroksiprolin

Kadar

(ppm) Absorbansi

Kadar yang

diperoleh

(ppm) (x)

x-x' (x-x')2

SD RSD (%)

5

0,148 4,826 -0,192 0,036

0,178 0,035 0,159 5,179 0,160 0,025

0,155 5,051 0,032 0,001

x’ = 5,019 ∑ = 0,063

10

0,300 9,698 -0,192 0,036

0,215 0,021 0,320 10,339 0,448 0,201

0,298 9,634 -0,256 0,065

x’ = 9,891 ∑ = 0,304

16

0,521 16,782 0,854 0,730

1,477 0,092 0,503 16,205 0,277 0,077

0,459 14,794 -1,132 1,282

x’ = 15,927 ∑ = 2,090

Rata-rata 0,623 0,050

55


Lampiran 9 Uji Sampel Gelatin

Tabel 5.5 Data Uji Kandungan Hidroksiprolin Dalam Sampel Gelatin

Sampel Absorbansi Rata-rata

absorbansi Kadar (ppm)

Rata-rata

kadar (ppm)

Sampel 1

0,280

0,255

9,057

8,277 0,247 8,000

0,240 7,775

Sampel 2

0,450

0,430

14,506

13,886 0,401 12,935

0,441 14,217

Sampel 3

0,275

0,313

8,897

10,126 0,345 11,141

0,320 10,339

Sampel 4

0,500

0,529

16,109

17,038 0,587 18,897

0,500 16,109

Sampel 5

0,322

0,325

10,403

10,500 0,334 10,788

0,319 10,307

56


Lampiran 10 Rumus-Rumus

Tabel 5.6 Rumus-Rumus

Nama Rumus Formula

Sb Sy/x = √

LOD LOD =

LOQ LOQ =

%diff % diff =

SD SD = √

%RSD RSD =

57


Lampiran 11 Perhitungan Konsentrasi Hidroksiprolin

Konsentrasi awal = 10 mg dalam 10 ml aquades = 1000 ppm

Konsentrasi untuk larutan kerja 100 ppm

5 ml Hidroksiprolin 1000 ppm dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml,

kemudian dicukupkan dengan aquades hingga tanda batas.

V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 1000 ppm = 50 ml x 100 ppm

V1 = 5000 / 1000

= 5 ml

Dari larutan kerja 100 ppm, kemudian diambil beberapa ml dan dicukupkan

dengan aquades hingga garis batas pada labu 10 ml sehingga diperoleh larutan

yang mengandung 3 ppm, 6 ppm, 9 ppm, 12 ppm, 15 ppm dan 18 ppm.

Contoh untuk larutan hidroksiprolin yang mengandung 9 ppm

V1 x C1 = V2 x C2

V1 x 100 ppm = 10 ml x 9 ppm

V1 = 900 / 100

= 9 ml

58


Lampiran 12 Perubahan Warna Larutan Hidroksiprolin Hasil Derivatisasi

Gambar 5.1 Perubahan Warna Larutan Hidroksiprolin Hasil Derivatisasi

Penambahan

Buffer asetat/sitrat pH 6

Nacl

Isopropanol

Chloramin T

Penambahan

Reagen ehrlich

Setelah inkubasi selama 25

menit suhu 60oC

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS -...

Documents

Transcript of HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS -...