gukosa oksida

7/23/2019 gukosa oksida

1/9

Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2012 ISBN : 978-979-028-550-7

Surabaya, 25 Pebruari 2012

D - 26

PRODUKSI DAN PEMURNIAN ENZIM GLUKOSA

OKSIDASE DARIASPERGILLUS NIGERISOLAT LOKAL

(IPBCC.08.610)

PRODUCTION AND PURIFICATION OF GLUCOSE

OXIDASE FROMASPERGILLUS NIGERISOLATE

(IPBCC.08.610)

Popi Asri Kurniatin1, Laksmi Ambarsari

1,2, , Restu Prianti Putri

1

1Departemen Biokimia FMIPA IPB

2Corresponding author: [email protected]

Abstrak. Glukosa oksidase (GOD) merupakan enzim yang mengkatalisis oksidasi

-D-glukosa menjadi glukonolakton dan hidrogen peroksida, dengan molekul

oksigen sebagai akseptor elektronnya.

Glukosa oksidase diproduksi oleh banyakmikroorganisme seperti Penicillium notatum, Penicillium chrysosporium,Aspergillus niger, dan Botrytis cinerea. A. niger diketahui dapat menghasilkan

enzim glukosa oksidase yang lebih stabil dibandingkan fungi lain. Penelitian inibertujuan menentukan waktu inkubasi optimum untuk produksi glukosa oksidase

dari isolat A. niger (IPBCC.08.610), serta menentukan aktivitas spesifik dariekstrak kasar dan fraksi amonium sulfat enzim tersebut. Melalui data tersebut

dapat diketahui fraksi terbaik enzim glukosa oksidase yang dapat digunakandalam aplikasi enzymatic fuel cell. Produksi glukosa oksidase di dalam media

dilakukan dengan kecepatan aerasi 200 rpm, suhu 30oC dengan lima variasi

waktu, yaitu 48 jam, 72 jam, 96 jam, 120 jam, dan 144 jam. Hasil penelitianmenunjukkan bahwa glukosa oksidase pada isolat A.niger (IPBCC.08.610) lebih

banyak diproduksi dalam bentuk enzim intraseluler daripada enzim ekstraseluler.Waktu inkubasi optimum untuk produksi glukosa oksidase ialah 72 jam dengan

aktivitas spesifik enzim mencapai 2156.67 unit/mg. Nilai aktivitas spesifik enzimsemakin meningkat setelah dilakukan pemurnian dengan amonium sulfat 80%,

yaitu menjadi sebesar 25369.46 unit/mg. Proses pemurnian tersebut berhasilmeningkatkan kemurnian enzim sampai 12 kali, dengan rendemen sebesar

23.21%.

Kata Kunci: Glukosa oksidase, Aspergillus niger, waktu inkubasi optimum,

ammonium sulfat

Abstract. Glucose oxidase (GOD) is an enzyme that catalyzes the oxidation of -

D-glucose to gluconolacton and hydrogen peroxide, with oxygen molecule as anelectron acceptor. Glucose oxidase may be produced by Penicillium notatum,

Penicillium chrysosporium, Aspergillus niger, dan Botrytis cinerea. A. niger

produce more stable glucose oxidase than Penicillium sp. The aims of this

research were to determine the optimum incubation time for the production of

glucose oxidase from A. Niger isolate (IPBCC.08.610) and measure the specific

activity of crude extracts and ammonium sulphate fraction of the enzyme. Thedata showed the best glucose oxidase fraction which can be used in enzymatic fuel

POSTER


2/9



D - 27

cell applications. Glucose oxidase was produced in the medium with 200 rpm

aeration, 30 C temperature, and five time variations, ie 48 hours, 72 hours, 96hours, 120 hours, and 144 hours. The results showed that glucose oxidase in

isolate A. niger (IPBCC.08.610) was expressed more intracellular enzyme thanextracellular enzyme. Optimum incubation time for glucose oxidase production is

72 hours with a specific activity of the enzyme reached 1568.20 units/mg.Specific activity of the enzyme increased after purification using 80% ammonium

sulphate to 12409.64 units/mg. Purification was successful for increasing thepurity of the enzyme up to 8 fold, with a yield of 23.21%.

Keyword: Glucose oxidase, Aspergillus niger, optimum incubation time,

ammonium sulphate

PENDAHULUAN

Glukosa oksidase (GOD) adalah enzim

yang mengkatalisis oksidasi -D-glukosamenjadi glukonolakton dan hidrogen

peroksida, dengan molekul oksigen sebagaiakseptor elektron (Sabir et al. 2007). Dalam

aplikasi farmasi, glukosa oksidase biasadigunakan sebagai biosensor untuk penentuan

kadar glukosa darah. Dalam bidang industrimakanan, enzim ini sering dimanfaatkan

untuk menghilangkan glukosa dan oksigen

dalam pengolahan suatu produk. Glukosa

oksidase juga berperan menghilangkanbeberapa bakteri patogen pada makanan,seperti Salmonella infantis, Staphylococcus

aureus, Clostridium perfringens, Bacillus

cereus, Campylobacter jejuni, dan Listeriamonocytogens (Bankar et al. 2009). Saat ini

glukosa oksidase banyak dikembangkan

dalam sistem enzymatic fuel cell (Bhatti &

Saleem 2009).Enzymatic fuel cell (EFC) adalah sistem

elektrokimia yang bekerja denganmengkonversi energi kimia menjadi energi

listrik. Sistem ini menggunakan enzim sebagaikatalisnya sehingga dapat menghasilkanefisiensi tinggi dan emisi polutan yang rendah

(Neto et al. 2011; Steele 2001). Saat inipengembangan EFC banyak ditujukan untuk

penggunaan aplikasi khusus seperti perangkat

implan, sensor, penghantaran obat, kepingmikro, dan cadangan listrik portabel

(Kim et al. 2006).Lee et al. (2011) menyatakan bahwa daya

yang dapat dihasilkan oleh glukosa oksidase

dalam sistemfuel cellmencapai 190 W/cm2.

Angka ini cukup tinggi dibandingkan daya

yang dihasilkan oleh enzim lain, misalnyaglukosa dehidrogenase yang hanya

menghasilkan 9.3 W/cm2(Desriani et al.

2010). Glukosa oksidase juga memiliki

spesifitas tinggi terhadap glukosa (Ahmad etal. 2007). Hal ini sangat menguntungkan

karena glukosa merupakan substrat yang

jumlahnya melimpah serta aman untukdigunakan.

Glukosa oksidase diproduksi oleh banyakmikroorganisme seperti Penicillium notatum,

Penicillium chrysosporium, Aspergillus niger,dan Botrytis cinerea. Penapisan terhadap

beberapa jenis fungi memperlihatkan bahwa

A. nigermerupakan sumber glukosa oksidaseyang paling baik (Khurshid et al. 2011).

Aspergillus niger menghasilkan glukosaoksidase yang bersifat lebih stabil

dibandingkan hasil produksi Penicillium sp.Saat ini kebutuhan terhadap glukosa

oksidase semakin meningkat sehubungan

dengan pemanfaatannya dalam EFC danaplikasi lain. Pemanfaatan glukosa oksidase

yang berasal dari isolat lokal A. nigersebagaikatalis dalam EFC belum dilakukan, padahal

iklim tropis dengan tingkat kelembaban tinggi

di Indonesia sangat mendukung pertumbuhanA. niger. Oleh karena itu diperlukan

eksplorasi terhadap isolat lokal A. niger yangdapat menghasilkan glukosa oksidase dalam

jumlah yang tinggi dan memiliki aktivitas

spesifik tinggi.

Pada penelitian ini dilakukan penentuanwaktu inkubasi optimum untuk produksi

glukosa oksidase dari isolat lokal Aspergillus

niger (IPBCC.08.610) serta penentuanaktivitas spesifik ekstrak kasar enzim dan

ekstrak enzim hasil pemurnian

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan adalah mortar,

kertas saring, neraca analitik OHAUS


3/9



D - 28

GA 200, autoklaf TOMY High PressureSteam SterilzerES-315, inkubator bergoyang,

waterbath, pH meter, vortex, magnetic stirrer,

spektrofotometer UV-Vis, Beckman High

Speed Centrifuge,ultrasentrifus, dan peralatan

laboratorium yang biasa digunakan di

laboratorium analitik.Bahan yang digunakan ialah isolat lokal

Aspergillus niger (IPBCC.08.610) koleksi

Departemen Biologi IPB yang merupakan

hasil isolasi dari tanah di daerah Tarakan,Kalimantan Timur. Media pertumbuhan terdiri

atas 0.04% (NH4)2HPO4, 0.02% KH2PO4,

0.02% MgSO4.7H2O, 1% pepton, dan 7%

sukrosa. Media produksi terdiri atas 0.4%

(NH4)2HPO4, 0.2% KH2PO4, 0.2%

MgSO4.7H2O, 40% CaCO3, 33% sukrosa, dan

0.35% glukosa. Bahan untuk isolasi glukosaoksidase ialah glassbead dan bufer fosfat

0.1 M pH 6.0. Penentuan waktu awal,

aktivitas enzim glukosa oksidase, analisiskadar protein, serta pemurnian enzim glukosa

oksidase menggunakan bufer fosfat sitrat

0.1 M pH 4.5, larutan glukosa 1 M,o-dianisidin 0.31 mM, enzim peroksidase

60 U/mL, larutan standar Bovine Serum

Albumin(BSA), reagen Lowry A (2% Na2CO3

dalam NaOH 0.1 N), reagen Lowry B(0.5% CuSO4 dalam 1% NaK tartrat), reagen

Folin Cioucalteau yang telah diencerkan dua

kali, dan amonium sulfat 80% (561 g/L).

METODE PENELITIAN

Penentuan waktu produksi optimum

(Jafari et al. 2007)

Penentuan waktu produksi optimumdilakukan untuk mengetahui waktu inkubasi

optimum Aspergillus niger yang dapatmenghasilkan enzim glukosa oksidase denganaktivitas yang tinggi. Tahap produksi

biomassa dilakukan di Laboratorium

Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan

Indonesia (LIPI), Cibinong. Mediapertumbuhan disiapkan sebanyak 100 mL di

dalam labu erlenmeyer 250 mL. Media diaturpada pH 5.5, kemudian disterilisasi. Isolat

A. niger (IPBCC.08.610) diinokulasi dalam

media tersebut kemudian diinkubasi selama24 jam dengan kecepatan 200 rpm dan suhu

30

o

C.Sebanyak lima buah labu Erlenmeyer

disiapkan, selanjutnya masing-masing diisidengan 200 mL media produksi. Media diatur

pada pH 5.5. Suspensi spora dari isolat lokal

Aspergillus niger yang berumur 24 jamdtumbuhkan dalam lima labu Erlenmeyer

tersebut masing-masing sebanyak 10 mL.

Kultur tersebut kemudian diinkubasi dengankecepatan aerasi 200 rpm suhu 30oC dengan

lima variasi waktu, yaitu 48 jam, 72 jam,

96 jam, 120 jam, dan 144 jam. Hal ini

dilakukan untuk mengetahui waktu produksiyang paling optimum. Setelah inkubasi

dilakukan, biomassa dipisahkan dari mediapertumbuhan dengan cara penyaringanmenggunakan kertas saring. Supernatan bebas

sel disimpan sebagai ekstrak kasar enzim

glukosa oksidase ekstraseluler. Berat basah

biomassa yang dihasilkan ditimbang,kemudian rendemen biomassa masing-masing

fraksi dihitung .

Isolasi enzim glukosa oksidase intraseluler

dari Aspergillus niger (Firman &

Aryantha 2003)Biomassa hasil penyaringan digerus

sampai halus menggunakan glassbeaddengan

perbandingan 1:1. Sel yang telah lisisditambahkan dengan bufer natrium fosfat0.1 M pH 6.0 hingga larut semuanya. Sel yang

telah ditambahkan bufer tersebut kemudian

disentrifugasi pada kecepatan 12000 rpm

selama 20 menit sebanyak dua kali.Supernatan yang dihasilkan merupakan enzim

kasar glukosa oksidase intraseluler.

Pemurnian enzim glukosa oksidase dengan

amonium sulfat (Sherbeny et al.2005)

Pemurnian enzim glukosa oksidase denganamonium sulfat dilakukan pada fraksi glukosa

oksidase yang memiliki aktivitas spesifikpaling tinggi. Pemurnian dilakukan denganpenambahan amonium sulfat 80%. Amonium

sulfat ditambahkan sedikit demi sedikit sambildiaduk menggunakan magnetic stirrer.

Larutan didiamkan selama 24 jam pada suhu

4oC, kemudian disentrifus pada kecepatan

12000 rpm selama 15 menit. Fraksi yang

terendapkan dilarutkan dalam bufer fosfat

sitrat 0.1 M pH 4.5. Hasil pemurnian ini

selanjutnya diukur kadar protein sertaaktivitasnya.

Analisis kadar protein (Lowry et al. 1951)

Analisis kadar protein dilakukan denganmetode Lowry, dan kurva standarmenggunakan larutanBovine serum albumine

(BSA). Absorbansinya dibaca pada panjanggelombang 700 nm. Pengukuran kadar protein

enzim glukosa oksidase dilakukan denganmetode yang sama untuk setiap fraksi.


4/9



D - 29

Pengukuran laju awal dan aktivitas enzim

glukosa oksidase (Kelley & Reddy 1986)

Laju awal reaksi enzim glukosa oksidaseditentukan dengan mengukur aktivitas enzim

glukosa oksidase hasil inkubasi 72 jam.Pengukuran aktivitas dilakukan dengan

menggunakan assay enzim. Dua buah tabungdisiapkan untuk campuran assay glukosaoksidase. Tabung pertama berisi 1.5 mL bufer

fosfat sitrat 0.1 M pH 4.5, 0.3 mL larutanglukosa 1 M, dan 0.1 mL larutan glukosa

oksidase. Tabung kedua berisi 1 mL o-dianisidin 0.31 mM dan 0.1 mL horseradish

peroksidase. Masing-masing tabung

diinkubasi selama 5 menit pada suhu 30oC,

kemudian dicampurkan. Pengukuran

dilakukan setelah campuran diinkubasi

terlebih dahulu selama 5 menit. Nilaiabsorbansi pada panjang gelombang 460 nm

diukur dan dilihat setiap satu menit, hingga

nilainya konstan. Laju awal ditentukan saatlaju linear maksimum tercapai. Waktutercapainya laju awal digunakan sebagai

waktu pengukuran untuk fraksi enzim lainnya.Aktivitas glukosa oksidase ialah nilai

mikromol substrat yang dioksidasi oleh enzim

glukosa oksidase. Nilai aktivitas glukosa

oksidase dihitung sebagai nilai absorbansi per

waktu (A/t) dibagi dengan nilai absorbansisetimbang (As), kemudian dikalikan dengan

mol substrat. Sedangkan penentuan aktivitas

spesifik suatu enzim, dilakukan berdasarkannilai aktivitas serta kadar protein enzim

tersebut. Jumlah unit enzim dibagi dengan

miligram protein ialah nilai aktivitas spesifikenzim.

Akt. (unit/mL) =As

tA / x mol substrat x fp

Keterangan:

Fp = Faktor pengenceran

As = ialah nilai absorbansi saat seluruhsubstrat telah dikatalisis oleh enzim,sehingga nilai absorbansi tidak

meningkat lagi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Rendemen BiomassaAspergillus niger(IPBCC.08.610)

Proses pembentukan biomassa suatu

mikroorganisme dipengaruhi oleh beberapafaktor, yaitu jenis isolat yang digunakan, laju

pertumbuhan, substrat, kelembapan, suhu, pHlingkungan, penambahan surfaktan serta

polimer, gaya geser, aerasi, dan agitasi

(El-Enshasy 1998).

Isolat Aspergillus niger (IPBCC.08.610)ditumbuhkan dalam media yang mengandung

sukrosa, glukosa, pepton, serta kalsium

karbonat. Kalsium karbonat (CaCO3) yangditambahkan berperan sebagai penginduksi

sintesis glukosa oksidase (Bankar et al.2009).

Penambahan CaCO3 ke dalam mediafermentasi akan menjaga pH media pada

pH 5.5 yang merupakan titik produksi

optimum glukosa oksidase. CaCO3juga dapat

mengubah jalur metabolik A. niger dariglikolisis menjadi jalur pentosa fosfat,

sehingga dapat meningkatkan jumlah glukosa

oksidase (Simpson 2005).Produksi glukosa oksidase dilakukan pada

suhu 30oC dengan lima variasi waktu, yaitu

48 jam, 72 jam, 96 jam, 120 jam, dan 144 jam.

Media fermentasi A. niger digoyang padakecepatan aerasi 200 rpm untuk menyediakan

kebutuhan oksigen. Oksigen digunakan untuk

melakukan reaksi enzimatis dan respirasi yangdiperlukan untuk pertumbuhan A.nigersehingga dapat menghasilkan biomassa yanglebih banyak.

Pemanenan biomassaA. nigerpada mediacair yang digoyang dilakukan melalui suatu

penyaringan, sebab miselium tidak berada

diatas permukaan seperti biomassa padamedia tanpa digoyang (Gandjar et al. 2006).

Penyaringan dilakukan menggunakan kertassaring, kemudian bobotnya ditimbang untuk

mengetahui pertumbuhan A. niger tersebut.

Biomassa yang dihasilkan oleh A. nigerberupa sel bulat berukuran cukup besar

sehingga diukur berdasarkan bobotnya. Selaindengan mengukur berat kering massa sel,

penentuan pertumbuhan fungi juga dapatdilakukan dengan menentukan kadar total

nitrogen massa sel, kadar total asam nukleat

massa sel, maupun dengan mengukur optical

density dari medium pertumbuhan

(Gandjar et al.2006).Berdasarkan pengukuran, bobot biomassa

yang dihasilkan semakin meningkat seiringpenambahan waktu inkubasi. Peningkatanbiomassa sel A.niger mengikuti kurva

pertumbuhan diauxic. Kurva pertumbuhandiauxic menunjukkan terjadinya dua fase

pertumbuhan dengan laju berbeda pada mediapertumbuhan suatu mikroorganisme. Hal ini

disebabkan penggunaan dua jenis sumberkarbon (Lee & Lee 1996).

Gambar 1 menunjukkan bahwa rendemen

biomassa sel meningkat cukup signifikan dari32.6810 g/L pada waktu inkubasi 48 jam

menjadi 78.1585 g/L setelah 72 jam.Keadaan ini memperlihatkan terjadinya fase

pertumbuhan pertama, yaitu saat sel


5/9



D - 30

menggunakan sumber karbon yang lebihsederhana, yaitu glukosa. Nilai rendemen

biomassa hanya meningkat menjadi 83.2255

g/L pada waktu inkubasi 96 jam. Hal inimenunjukkan bahwa glukosa sebagai sumber

karbon utama A.niger telah habis digunakan.

Mikroorganisme tersebut selanjutnyamemasuki fase lag untuk persiapan

penggunaan sukrosa yang merupakan sumber

karbon lainnya. Pada fase lag laju

pertumbuhan cenderung konstan (Lee & Lee1996).

Gambar 1 Rendemen biomassaAspergillus

niger.

Rendemen biomassa kembali meningkat

pada waktu inkubasi 120 jam menjadi134.423 g/L, dan merupakan nilai rendemen

biomassa paling tinggi yang dihasilkan oleh

isolat A. niger(IPBCC.08.610). Nilai tersebut

jauh lebih tinggi dibandingkan dengan hasil

rendemen biomassa yang diproduksi olehisolat lain, misalnya isolat A. niger

PTTC 5012 yang hanya memiliki nilairendemen biomassa tertinggi sebesar 11,7 g/L(Jafari et al. 2007). Setelah inkubasi 120 jam

jumlah nutrien mulai berkurang dan senyawatoksik mulai terakumulasi sehingga laju

pertumbuhan sel mulai menurun. Selkemudian lisis dan mengalami kematian,

sehingga pada waktu inkubasi 144 jamrendemen biomassa sel berkurang menjadi

123.278 g/L.

Glukosa Oksidase Intraseluler dan

Ekstraseluler

Glukosa oksidase yang dihasilkan oleh

Aspergillus niger dapat berupa enzim

ekstraseluler maupun enzim intraseluler

(Simpson 2005). Enzim intraseluler bekerjadi dalam sel, sementara enzim ekstraselulerialah enzim yang disekresikan ke luar sel dan

berdifusi di dalam media (Teal &

Wymer 2001). Pengetahuan mengenai

aktivitas spesifik enzim glukosa oksidasedapat menunjukkan apakah enzim tersebut

banyak diproduksi sebagai enzim ekstraseluleratau intraseluler.

Berdasarkan penentuan laju awal reaksienzim glukosa oksidase, diketahui bahwa laju

awal reaksi enzim glukosa oksidase adalah

sebesar 0.04 /menit, dan laju linear tertinggitercapai pada waktu 2.5 menit (vo). Penentuan

aktivitas enzim selanjutkan dilakukan

pengukuran pada menit ke 2.5. Inkubasidilakukan pada suhu 30 oC.

Berdasarkan hasil pengamatan, ekstrak

kasar enzim glukosa oksidase intraseluler

menunjukkan aktivitas spesifik yang jauhlebih tinggi dibandingkan ekstrak kasar enzim

glukosa oksidase ekstraseluler (Gambar 2).

Pada waktu inkubasi yang sama, misalnya 72jam, enzim glukosa oksidase intraseluler

memiliki aktivitas spesifik sebesar

1568.30 unit/mg, sementara ekstrak kasar

glukosa oksidase ektraseluler hanya memilikiaktivitas spesifik sebesar 21.70 unit/mg.

Gambar 2 Aktivitas spesifik enzim glukosa

Oksidase

Ekstrak kasar enzim glukosa oksidase

ekstraseluler memiliki aktivitas spesifiktertinggi pada enzim hasil inkubasi 144 jam,

yaitu sebesar 39.14 unit/mg. Hasil ini beradajauh di bawah aktivitas spesifik glukosa

oksidase intraseluler yang memiliki nilai

aktivitas spesifik sedikitnya mencapai1019.05 unit/mg, yaitu enzim hasil inkubasi

48 jam. Oleh karena itu dapat disimpulkanbahwa glukosa oksidase pada isolat A. niger

(IPBCC.08.610) lebih banyak diproduksi

sebagai enzim intraseluler. Hal ini sesuaidengan pernyataan Sabir et al.(2007) bahwa

glukosa oksidase pada Aspergillus sp.

merupakan enzim intraseluler, berbeda dengan

glukosa oksidase pada Penicillium sp. yangbanyak ditemukan dalam bentuk enzim

ektraseluler.

Waktu Inkubasi Produksi Optimum Enzim

Glukosa Oksidase

Waktu inkubasi optimum produksi enzim

glukosa oksidase bergantung pada karakterkhas masing-masing isolat, media produksi,

nutrisi, dan kondisi fisiologis produksi

0

50

100

150

0 24 48 72 96 120 144

Rendemen

biomassa

Jam ke- 1019.05

1568.2

1239.

1

1538.18

1184.

98

30.2821.721.9735.6739.14

0

500

1000

1500

2000

48 72 96 120 144

Akt.Spesifik

(unit/mg)

Jam ke-

intra

sel


6/9



D - 31

(Sabir et al.2007). Penentuan waktu inkubasioptimum produksi enzim glukosa oksidase

dari isolat Aspergillus niger (IPBCC.08.610)

dilihat berdasarkan nilai aktivitas enzim yang

paling tinggi diantara semua fraksi. Penentuan

waktu inkubasi optimum dilakukan terhadap

enzim intraseluler, karena glukosa oksidasepada isolat A. niger (IPBCC.08.610) lebihbanyak diproduksi sebagai enzim intraseluler.

Gambar 3 Hubungan antara aktivitas glukosaoksidase dengan biomassa sel

A. niger.

Hasil pengamatan memperlihatkan bahwa

pada waktu inkubasi 48 jam, aktivitas glukosaoksidase intraseluler sebesar 743.9 g/mL.

Aktivitas enzim glukosa oksidase semakinmeningkat seiring penambahan waktuinkubasi. Pada glukosa oksidase intraseluler,

peningkatan nilai aktivitas setara denganpeningkatan nilai rendemen biomassa

A. niger (Gambar 3). Hal ini menunjukkanbahwa glukosa oksidase merupakan metabolit

primer dari Aspergillus niger. Glukosaoksidase hasil inkubasi 72 jam dan 96 jammemiliki aktivitas paling tinggi, yaitu masing-

masing sebesar 2219 g/mL dan 2490.6 g/mL.

Tingginya nilai aktivitas glukosa oksidase

hasil inkubasi 72 jam dan 96 jammenunjukkan bahwa glukosa oksidase banyakdiproduksi oleh isolat A. niger

(IPBCC.08.610) pada waktu inkubasi tersebut.Hal ini disebabkan pada waktu inkubasi

72 jam dan 96 jam A. niger mulaimemanfaatkan sukrosa sebagai sumber

karbonnya. Menurut Bankar et al. (2009)

sukrosa merupakan substrat yang dapat

memproduksi glukosa oksidase secara

optimum.

Waktu inkubasi optimum produksi enzimglukosa oksidase dari isolat A. niger(IPBCC.08.610) sama dengan waktu inkubasi

produksi optimum yang dibutuhkan oleh isolat

Aspergillus niger NCM 545 untukmenghasilkan glukosa oksidase

(Bankar et al. 2009). Enzim glukosa oksidase

yang masuk ke dalam tahap pemurnian pada

penelitian ini ialah enzim glukosa oksidasehasil inkubasi 72 jam, bukan enzim glukosa

oksidase hasil inkubasi 96 jam. Hal ini

dilakukan karena waktu produksi enzim

glukosa oksidase yang dibutuhkan lebih

singkat. Selain itu, hal ini dilakukan untuk

menghindari penurunan aktivitas yangmungkin saja terjadi pada inkubasi 96 jamakibat berkurangnya jumlah nutrisi dan

terjadinya akumulasi autotoksik di dalam

media (Bodade et al. 2010).Aktivitas enzim berhubungan dengan

jumlah protein di dalam fraksi tersebut(GAC 2003). Penentuan aktivitas spesifik

enzim glukosa oksidase perlu dilakukansebelum proses pemurnian dilakukan, sebab

nilai aktivitas spesifik enzim glukosa oksidase

dapat menunjukkan kemurnian enzim tersebut(Lehninger et al. 2004).

Glukosa Oksidase Fraksi Amonium SulfatEkstrak kasar glukosa oksidase hasil

inkubasi 72 jam yang memiliki aktivitas tinggiselanjutnya masuk ke dalam tahap pemurnian

amonium sulfat. Tahap ini merupakan metodeawal pemurnian enzim yang berfungsimeningkatkan konsentrasi protein enzim,

mereduksi volume larutan enzim, danmemisahkan protein target dari sebagian

kontaminan yang tidak dikehendaki(Yuningtyas 2008).

Masing-masing protein membutuhkankonsentrasi garam yang berbeda agar dapatmengendap (Berg et al. 2002). Amonium

sulfat yang digunakan untuk pemurnian enzimglukosa oksidase memiliki tingkat kejenuhan

80%, karena menurut Sherbeny et al. (2005)

amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan

80% efektif dalam meningkatkan kemurnian

glukosa oksidase. Konsentrasi yangdibutuhkan untuk mengendapkan glukosa

oksidase secara optimum sangat tinggi karenaenzim ini banyak mengandung asam amino

serin dan glisin. Keberadaan serin dan glisinmenyebabkan protein di dalam enzim glukosaoksidase bersifat hidrofilik

(Lehninger et al. 2004). Konsentrasi amoniumsulfat yang dibutuhkan untuk mengendapkan

0

5000

0

200

48 72 96 120 144

Aktivitas

(unit/mL)

Rendemen

Biomassa

Waktu (Jam)

Tabel 2 Hasil pemurnian enzim glukosa oksidase dengan amon

Tahapan

Total

Protein(mg)

Total

Aktivitas(unit)

Aktivitas

Spesifik(unit/mg

protein)

Ekstrak kasar 1.4150 2219 1568.20


7/9



D - 32

protein yang memiliki lebih banyak gugushidrofilik lebih tinggi dibandingkan dengan

protein yang memiliki gugus hidrofilik sedikit

(UCL 2006).Total aktivitas dan total protein glukosa

oksidase hasil pemurnian ditunjukkan oleh

Tabel 1 . Total aktivitas ialah jumlah unitenzim yang terdapat di dalam satu mililiter

enzim, sementara total protein ialah jumlah

miligram protein di dalam satu milliliter

enzim. Total aktivitas dan total protein enzimmenurun seiring tahap pemurnian.

Aktivitas enzim menurun karena terdapat

beberapa substansi penting diluar gugusprostetik enzim yang hilang akibat pemurnian

(Holme & Peck 1998). Total protein menurun

karena beberapa protein yang tidak diinginkan

atau non spesifik berhasil dihilangkan.Aktivitas spesifik glukosa oksidase hasil

pengendapan amonium sulfat meningkat

menjadi 12409.64 unit/mg. Hal inimenunjukkan proses pemurnian berjalandengan baik karena jumlah kehilangan proteinnon spesifik tersebut lebih besar daripada

penurunan aktivitas enzim. Rendemen glukosaoksidase pada tahap pemurnian amonium

sulfat sebesar 23.21%. Nilai rendemen

tersebut sangat rendah dibandingkanrendemen glukosa oksidase hasil penelitian

Bhatti & Saleem (2009), yang mencapai 88%.Hal ini dapat disebabkan oleh kurang

homogennya penambahan amonium sulfat

saat pemurnian. Tingkat kemurnian sementaraitu meningkat menjadi 8 kali, lebih tinggi

dibandingkan hasil penelitian Bhatti & Saleem(2009) yang hanya mencapai 2 kali.

KESIMPULAN

Glukosa oksidase lebih banyak diproduksi

dalam bentuk enzim intraseluler pada isolat

Aspergillus niger (IPBCC.08.610). Produksi

optimum enzim glukosa oksidase dari isolatlokal A.niger terjadi pada waktu inkubasi 72

jam hingga 96 jam, yang ditunjukkan oleh

aktivitas tertinggi yaitu masing-masingsebesar 2219 unit/mL dan 2490 unit/mL.

Ekstrak kasar glukosa oksidase hasil inkubasi72 jam yang digunakan dalam tahap

pemurnian memiliki aktivitas spesifik 1568.20unit/mg dan meningkat menjadi 12409.64unit/mg setelah dimunikan dengan amonium

sulfat. Fraksi hasil pemurnian ini 8 kali lebih

murni dibandingkan ekstrak kasar, dengannilai rendemen 23.21%.

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad A, Syaiful A, Firman AP, Patong AR.2007. Imobilisasi enzim glukosaoksidase dari Penicillium sp-3 galur

lokal.Indo. J. Chem. 7: 97 - 104.

Anwar YAS. 2006. Produksi dan karakterisasienzim tanin asil hidrolase dari

Aspergillus niger. [tesis]. Bogor:Sekolah Pascasarjana, IPB.

Baker SE. 2006. Aspergillus niger genomics:

Past, present and into the future.Medical Mycology44: 17 - 21.

Bankar SB, Bule MV, Singhal RS,

Ananthanarayan L. 2009. Optimizationof Aspergillus niger fermentation for

the production of glucose oxidase.Food Bioprocess Technol2: 344 - 352.

Berg JM, Tymoczko JL, Sttyrer L. 2002.Biochemistry 5

th Ed. USA: WH.

Freeman & Company.

Bergmeyer HU, Gawehn K, Grassl M. 1974.

Methods of Enzymatic Analysis. New

York: Academic Press Inc.

Bhatti HN, Saleem N. 2009. Characterizationof glucose oxidase from Penicilliumnotatum. Food Technol. Biotechnol47:

331 - 335.

Bodade RG, Chandarahas N, Khobragade,

Arfeen S. 2010. Optimization of cultureconditions for glucose oxidase

production by a Penicillium

chrysogenum SRT 19 strain. Eng. Life

Sci. 10: 3539.

Chaplin M. 2004. Concentration byprecipitation. London South Bank

University. [terhubung berkala].

http://www. lsbu. ac. uk/ biology/

enztech/ concentration. html. [29Desember 2011].

Desriani, Hanashi T, Yamazaki T, Tsugawa

W, Sode K. 2010. Enzyme fuel cell for

cellulolytic sugar conversionemploying FAD glucose

dehydrogenase and carbon cloth

electrode based on direct electrontransfer principle. The Open

Electrochemistry Journal2: 6 - 10.


8/9



D - 33

El-Enshasy H. 1998. Optimization of glucoseoxidase production and excretion by

recombinant Aspergillus niger.

[disertasi]. Jerman: UniversitasBraunschweig.

[EPA] Environmental Protection Agency.

1997. Aspergillus niger final riskassessment. Biotechnology Program

under the Toxic Substances Control Act

(TSCA). [terhubung berkala].http://www.epa.gov/biotech_rule/pubs/fra/ fra006.htm [7 Maret 2011].

Firman P, Aryantha INP. 2003. Eksplorasi dan

isolasi enzim glukosa oksidase darifungi inperfekti (genus Penicilliumdan

Aspergillus) indigenus. Pertemuan

Ilmiah Tahunan (PIT) Perhimpunan

Mikrobiologi Indonesia; Bandung,29 - 30 Agustus 2003.

GAC [Gustavus Adolphus College]. 2003.Enzymes. Gustavus. [terhubung

berkala]. http://homepages. gac. edu/~cellab/ chpts/ chpt5 /intro5. html. [18

Januari 2012].

Gandjar I, Samson RA, Tweel-Vermeulen K,

Oetari A, Santoso I. 2000. Pengenalan

Kapang Tropik Umum. Jakarta:

Yayasan Obor Indonesia.

Gandjar I, Sjamsuridzal W, Oetari A. 2006.Mikologi Dasar dan Terapan. Jakarta:

Yayasan Obor Indonesia.

Gautam AK, Sharma S, Avasthi S, BhadauriaR. 2011. Diversity, pathogenicity andtoxicology of A. niger: An important

spoilage fungi. Res. J. Microbiol 6:

270 - 280.

Goodsel D. 2006. Glucose oxidase. RCSB

Protein Data Bank. [terhubung

berkala]. http://www. pdb. org/ pdb/101/ motm. do? momID=77. [13

Desember 2011].

Holme DJ, Peck H. 1998. AnalyticalBiochemistry 3rd Ed. London: PerasonEducation.

Jafari AR, Sarrafzadeh MH, Alemzadeh I,Vosoughi M. 2007. Effect of stirrer

speed and aeration rate on theproduction of glucose oxidase by

Aspergillus niger. J. Bio. Sci 7:270 -275.

Kelley RL, Reddy CA. 1986. Purification and

characterization of glucose oxidase

from ligninolytic cultures of

Phanerochaete chrysosporium.Journalof Bacteriology166: 269 - 274.

Khurshid S, Kashmiri MA, Quershi Z, AhmadW. 2011. Optimization of glucose

oxidase production by Aspergillus

niger. African Journal of

Biotechnology10: 1674 - 1 678.

Kim J, Jia H, Wang P. 2006. Challenges in

biocatalysis for enzyme-based biofuel

cells. Biotechnology Advances 24:

296 - 308.

Koolman J, Roehm KH. 2005. Color Atlas of

Biochemistry. New York: ThiemeStuttgart.

Lee TK, Lee WS. 1996. Diauxic growth

carbon in rice suspension cells grown

on mixed carbon sources of acetate and

glucose. Plant Physiol110 : 465-470.

Lee JY, Shin HY, Kang SW, Park C, KimSW. 2011. Application of an enzyme-

based biofuel cell containing a

bioelectrode modified withdeoxyribonucleic acid-wrapped single-walled carbon nanotubes to serum.

Enzyme and Microbial Technology 48:80 - 84.

Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM. 2004.

Principles of Biochemistry. USA: W

H Freeman & Co Publication.

Lowry OH, Roserbrough NJ, farr AL, RandallRJ. 1951. Protein measurement with

the folin phenol reagent. J. Biol.Chem: 265 - 275.

McDowall J. 2006. Glucose oxidase andbiosensors. European Bioinformatics

Institute. [terhubung berkala].http://embl-ebi. org/ interpro/ potm/

2006_5/ Page1. htm. [29 Desember

2011].

Murray RK, Granner DK, Rodwell VW. 2009.

Biokimia Harper. Pendit BU,

penerjemah. Jakarta: EGC.

Nakamura S, Fujiki S. 1967. Comparativestudies on the glucose oxidases of

Aspergillus niger and Penicilliumamagasakiense.J. Biochem63: 51-58.

Neto SA, Forti JC, Zucolotto V, Ciancaglini

P, Andrade de AR. 2011. Development

of nanostructured bioanodes containingdendrimers and dehydrogenases

enzymes dor application in ethanolbiofuel cells. Biosensors and


9/9



D - 34

Bioelectronics26: 2922 - 2926.

Ogawa A, Ando F. 2009. Sucrose

metabolism for the development of

seminal root in maize seedlings. J.Plant Production: 9 - 16.

Poedjiadi A, Supriyantini FMT. 2007.Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UIPress.

Sabir S, Bhatti HN, Zia MA, Sheikh MA.

2007. Enhanced Production ofglucose oxidase using Penicilliumnotatum and rice polish. Biotechnol45: 443 - 446.

Sherbeny El GA, Shindia AA, SheriffYMMM. 2005. Optimization of

various factors affecting glucose

oxidase activity produced byAspergillus niger.Int. J. Agri. Biol7:953 - 958.

Simpson C. 2005. Isolation, purification and

characterization of a novel glucoseoxidase from Penicillium canescens

Tt42. [tesis]. Afrika: Rhodes

University.

Steele BCH, Heinzel A. 2001. Material forfuel-cell technologies. Nature 414:

345 - 352.

Teal AR, Wymer PEO. 2001. Enzymes andtheir role in biotechnology.

Biochemistry. [terhubung berkala].

http://www. biochemistry. org/Portals/ 0/ Education/ Docs/

BASC03_full. pdf. [17 Januari 2012].

[UCL] University College London. 2006.Ammonium sulphate fractionation.

UCL. [terhubung berkala].

http://www. ucl. ac. uk/ ~ucbcdab/enzpur/ amso4. htm. [15 Januari

2012].

Wilson K, Walker J. 2000. Principles andTechniques of Practical Biochemistry

5th Ed. UK: Cambridge University

Press.

Wirakartakusumah et al. 1987. Isolasi dankarakterisasi enzim dari Aspergillus

niger serta pemanfaatan dalampembangunan industri gula cair.

[laporan penelitian].

Wrolstad RE, Decker EA, Schwartz SJ.2005. Handbook of Food Analytical

Chemistry: Water, Proteins, Enzymes,

Lipids, and Carbohydrates. New

York: Wiley - Interscience.

Yamaguchi M, Tahara Y, Nakano A,

Taniyama T. 2007. Secretory and

continuous expression of Aspergillus

nigerglucose oxidase gene in Pichia

pastoris. Protein Expression and

Purification55: 273 - 278.

Yuningtyas S. 2008. Isolasi dan karakterisasi

-Galaktosidase bakteri asam laktatdari makanan hasil fermentasi.

[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika

dan Ilmu Pengetahuan Alam, InstitutPertanian Bogor.

gukosa oksida

Documents

Transcript of gukosa oksida