Modul Praktikum Pengantar Teknologi Bioproses

Gram Staining

Tujuan :

1. Agar mahasiswa dapat mempersiapkan gram stain fixed smear dengan pengamatan2. Agar mahasiswa dapat mengamati dan mengidentifikasi jenis bakteri dengan pewarnaan

gram

Latar belakang :

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri  dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk identifikasi diperlukan suatu metode yaitu dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.

Pewarnaan yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi jika mengenai bagian tubuhnya, karena pewarna tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif atau negatif. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarna yang bermuatan positif misalnya metilen biru, maka akan hasil pewarnaan akan nampak jelas.

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya

Alat yang digunakan :1. Tray untuk meletakkan slide2. Slide gelas (object glass dan cover glass)3. Loop/ oose4. Lampu spiritus/ bunsen5. Mikroskop

Bahan yang digunakan :

1

Modul Praktikum Pengantar Teknologi Bioproses

1. Kultur mikroorganisme (gram positif, gram negatif dan yeast)2. Satu set bahan pewarnaan gram : crystal violet, iodine, alkohol 95%, safranin3. Aquadest

Prosedur percobaan :

Persiapan fixed smear

1. Panaskan slide (object glass) dengan cara melewatkannya beberapa kali pada nyala api kemudian biarkan hingga dingin.

2. Letakkan kawat loop yang sudah dilewatkan nyala api ke dalam aquadest steril sehingga sebagian kecil dari kawat loop penuh dengan air, kemudian letakkan pada slide. Dengan loop steril ambil sejumlah kecil kultur yang akan diamati dengan meletakkannya dan mencampurkan pada slide. Sterilkan loop.

3. Sebarkan untuk membentuk lapisan tipis.

4. Sterilkan loop dan kembalikan ke tempat semula.

5. Keringkan slide di tempat terbuka. Fix smear dengan melewatkan slide secara cepat sebanyak 3 kali melalui nyala api (smear pada bagian atas). Dinginkan slide.

6. Stain bagian kultur yang ada.

Pewarnaan gram stain1. Teteskan crystal violet pada lapisan kultur yang ada. Diamkan selama 1 menit.2. Secara perlahan- lahan alirkan air pada slide untuk mencucinya, kemudian kering

anginkan.3. Teteskan iodine di atas slide dan diamkan selama 1 menit.4. Cuci dengan air, kemudian kering anginkan.5. Tambahkan alkohol 95% tetes demi tetes hingga alkohol yang turun berwarna jernih,

kemudian bilas dengan air dan kering anginkan.6. Teteskan safranin dan diamkan selama 45 detik, kemudian bilas dengan air dan kering

anginkan. 7. Amati sel yang telah diwarna dengan menggunakan mikroskop dan gambarkan dalam

laporan.

2

Modul Praktikum Pengantar Teknologi Bioproses

Tugas :1. Buatlah gambar sel bakteri yang terlihat pada mikroskop !2. Deskripsikan bentuk morfologi bekteri tersebut dan tentukan termasuk jenis gram apakah

bakteri tersebut? Bandingkan dengan literatur !3. Carilah di literature apakah keuntungan penggunaan pewarnaan gram stain dibandingkan

dengan pewarnaan biasa !4. Terangkan apa fungsi dari crystal violet, iodine, alkohol 95%, dan safranin dalam

pewarnaan gram stain ! 5. Apa perbedaan antara bakteri dengan yeast sesuai dengan pengamatan yang dilakukan!

3