Abstrak

Giberelin (GAs) diidentifikasi dan dikuantifikasi saat perkembangan bunga dan buah

di mawar Natal (Helleborus niger L.), yang berasal dari Eropa Tenggara dengan tradisi

hortikultura internasional panjang. Secara fisiologis, tanaman tersebut berbeda dari spesies

contoh yang populer dalam dua hal utama: (1) anthesis, awalnya putih atau perianthum

mawar (dibentuk oleh sepal) yang berubah hijau dan bertahan sampai pematangan buah, dan

(2) biji dilepaskan dengan embrio yang belum matang, sebuah miniatur endosperma, dan

perisperm yang menonjol sebagai jaringan penyimpan utama. GA1 dan GA4 diidentifikasi

oleh spektrum massa fullscan sebagai bioaktif utama GA di sepal dan buah. Sistem LC-

MS/MS yang sesuai dengan protokol yang sebelumnya telah diverifikasi juga diberi analisis

data pada 12 prekursor dan metabolit dari GAs. Dalam buah, GA4 memuncak selama

pertumbuhan cepat pericarp dan perkembangan embrio dan GA1 memuncak selama periode

lanjutan dari akumulasi nutrisi yang cepat dalam benih dan dilanjutkan dengan pembesaran

pericarp. Dalam sepal, fluks yang melalui jalur biosintesis GA merupakan yang tertinggi

sebelum tahap light green saat sistem fotosintetik terinduksi. Bunga yang tidak terbuahi dan

dibuang bijinya, menjadi kurang hijau dibandingkan benih kontrol. Akumulasi klorofil dapat

dipulihkan dengan aplikasi GA1, GA4, dan, GA3 yang kurang efisien, menuju buah tanpa

biji. Pada sepal dari bunga yang tidak dibuahi dan depistilasi memang mengandung tingkat

GA4yang sangat rendah dan secara bertahap menurunkan kadar GA1. Namun, konsentrasi

prekursor dan metabolit yang kurang terpengaruh. Data ini menunjukkan bahwa sinyal (s)

dari buah merangsang biosintesis GA di sepal mengakibatkan sepal menghijau. GA buah

yang diturunkan tampaknya terutama terlibat dalam pertumbuhan pericarp dan perkembangan

biji.

Pendahuluan

Pengecualian untuk tumbuhan model Arabidopsis thaliana, penelitian pada

metabolisme dan aksi mode Giberelin (GA) (Hedden and Kamiya 1997; Hedden and others

2002; MacMillan 2002; Sponsel dan Hedden 2004; Yamaguchi 2008) telah difokuskan

terutama pada spesies tanaman untuk meningkatkan kinerja dan hasil (Hedden dan Phillips

2000; Hedden 2003). Beberapa tanaman Hias telah ditreatment dengan GA eksogen untuk

meningkatkan tingkat pemasaran (Halevy 1986), dan zat penghambat pertumbuhan telah

diaplikasikan untuk memanipulasi biosintesis GA dan ukuran tanaman (Rademacher 2000),

namun fisiologi GA endogen menerima sedikit perhatian (Greyson dan Tepfer 1967; Greyson

dan Raman 1975; Weiss dan lain-lain 1995). Hal ini sangat disayangkan karena memahami

latar belakang biokimiawi suatu sifat penting estetika dan ekonomis akan membantu untuk

meminimalkan input yang diperlukan untuk membuat tanaman hias ditampilkan pada

kebutuhan pasar.

Peran GAs dalam perkembangan reproduksi (Pharis Raja dan 1985) telah dieksplorasi

dalam spesies seperti kacang (Rodrigo dan lain-lain 1997, Swain dan lain-lain 1997; Ozga

dan Reinecke 2003, Ozga dan lain-lain 2003), tomat (Rebers dan lain-lain 1999), tembakau

(Itoh dan lain-lain 1999), beras (Kaneko dan lain-lain 2003), dan Arabidopsis thaliana (Fei

dan lain-lain 2004, Hu dan lain-lain 2008). penggunaan mutan jantan-steril (ditinjau oleh

Sawhney dan Shukla 1994) dan ekspresi gen meneliti tapetum dan serbuk sari biji yang

teridentifikasi di anter sebagai sumber utama Ga yang memacu perkembangan awal pada

bunga (Itoh dan lain-lain 1999; Kaneko dan lain-lain 2003). percobaan secara khusus dan

terperinci di Arabidopsis (Hu dan lain-lain 2008) mengaitkan perkembangan buah dan Buah

terhadap ekspresi diferensial dari empat gen GA 3-oksidase yang ada di spesies ini.

Di sini kita menyelidiki perkembangan bunga dan buah pada mawar Natal

(Helleborus niger L.) yang telah diklasifikasikan sebagai dikotil dasar (Finch-Savage dan

Leubner- Metzger 2006) oleh ahli taksonomi. Genus Helleborus terdiri dari sekitar 20 spesies

perennial dunia lama dengan besar (3 cm hingga lebih), bunga mencolok pada musim semi

dengan berbagai nuansa ungu, hijau, dan putih (Schiffner 1891; Damboldt dan Zimmermann

1965; Mathew 1989). Baik spesies asli dan kultivar hibrida sama-sama populer sebagai

tanaman hias (Burrell dan Tyler 2006). Sebagian besar dari mereka mempertahankan

perianthum (dibentuk oleh sepal) sampai pematangan biji, dengan warna biasanya berubah

menjadi kehijauan. H. niger memiliki periode pembungaan yang sangat panjang (2-6 bulan

dimulai sekitar Natal) dan bunga sangat besar (6 - 13 cm), yang berubah warna dari putih

menjadi sangat hijau, keduanya tercampur dengan warna ungu pada lokasi yang terkena sinar

matahari (Salopek-Sondi dan Magnus 2007). Akumulasi klorofil pada perianthum ini terkait

dengan perkembangan buah, yang membuat bunga mawar Natal yang telah dibuahi sebagai

contoh baik untuk induksi aktivitas fotosintesis dengan asimilasi yang mebutuhkan jaringan

“sink”. Proses “greening” di perianthum dari bunga yang telah terbuahi atau terdepistillatasi

stalls pada tahap awal, namun bisa distimulasi menuju penyelesaian dengan aplikasi

giberelin dan sitokinin pada sepal dengan (Salopek-Sondi dan lain-lain 2002).

Di sini kita menunjukkan bahwa sepal greening dapat diinduksi dengan aplikasi GA1,

GA3, atau GA4 pada ovarium yang telah dibuang bijinya. GA1 dan GA4 juga diidentifikasi

sebagai GA endogen fisiologis aktif yang utama dalam ovarium dan jaringan bunga lainnya.

Kadar GA bersama dengan prekursor dan katabolitnya, yang dikuantifikasi dalam jaringan

bunga yang berbeda dan pada tahap perkembangan buah yang berbeda serta pada bunga yang

terdepistilasi dan tidak terbuahi. Dinamika Konsentrasi GA dibahas dalam hal sepal greening

dan perekmbang biji-perikarpium.

Bahan dan Metode

Tanaman Bahan

Bunga mawar Natal (Helleborus niger L. ssp. niger sensu B. Mathew 1989)

dikumpulkan pada dua lokasi dalam empat musim pertumbuhan yang berbeda. Habitat 1

adalah gunung hutan alam di Gorski Kotar, Kroasia (ketinggian: 800 m, jenis pohon yang

dominan: Abies alba Mill, Fagus. silvatica L., Picea abies L.). Habitat 2 adalah woodlot di

kebun raya Fakultas Farmasi dan Biokimia dari University of Zagreb. Bahan yang

dikumpulkan untuk mendapatkan wawasan tentang dinamika GA selama seluruh siklus hidup

dari bunga mawar Natal yang tercantum dalam Tabel 1 dan terdiri dari serangkaian enam

tahapan perkembangan sampel di 2008 dan ulangan untuk sebagian besar tahapan dari tahun

2002, 2003, atau 2004 (semua sampel dari habitat 1). Dua tahap anthesis didapatkan. Setelah

pembukaan kuncup, Bunga proterogynous pertama melewati fase 'betina' mereka, selama

stigma masih bersifat reseptif, sedangkan kepala sari matang yang tersusun dalam dalam

bentuk cincin di dasar karpel. Fase ‘jantan’ dimulai dengan pemanjangan filamen dan

berakhir dengan absisi antera. buah yang masih berkembang dan diambil pada empat tahap

dibedakan oleh tingkat akumulasi klorofil dalam sepal (Yang bertahan sampai jatuh tempo

buah): 'hijau muda' (semburat kehijauan), 'Hijau' (greening berkembang baik), 'Setengah

matang' (biji setengah matang , greening sepal mencapai tingkat stasioner), dan 'Hampir

matang' (biji hampir matang, sepal pada perkiraan akhir fase diam setelah tingkat klorofil

mulai menurun). Untuk menentukan tahapan perkembangan yang tersampel pada kerja yang

lebih kuantitatif, mereka juga terkarakterisasi oleh berat dari sepal dan putik atau buah yang

sedang berkembang, panjang buah, dan pembacaan klorofil meter (Tabel 1).

Bunga yang tidak dibuahi dipanen dari habitat 1, mengikuti kondisi cuaca yang

dilainkan terhadap serangga penyerbuk selama periode reseptivitas stigma. Mereka juga

“diproduksi” (habitat 2) dengan menyertakan bunga kebiri dalam karung kain kasa untuk

mencegah penyerbukan silang dalam bunga depistilasi, putik dan kepala sari dihilangkan

sesaat sebelum pembukaan kuncup.

Dalam bunga yang dikumpulkan untuk analisis hormon, sepal dipisahkan dari klaster

putik atau Buah yang sedang berkembang (folikel), dan benang sari serta nektar dibuang.

Beberapa buah yang hampir matang dipisahkan menjadi biji dan perikarpium. Bahan tanaman

tersebut disimpan pada suhu -80ᵒ C. Sampel yang dipilih untuk analisis GA dibeku-

keringkan dan diproses menjadi bubuk untuk memfasilitasi pengiriman.

mikroskopi

Bahan paraplast-tertanam dipreparasi berdasarkan Ruzin (1999). Karpel dengan biji yang

dikumpulkan, diatur segera dalam FAA (etanol 50%, 10% formalin, 5% asam asetat glasial)

semalam (16 jam) pada 4 C, diproses melalui serangkaian dehidrasi etanol dan xilena,

tertanam dalam Paraplast (Fluka), kemudian dipotong dengan rotary mikrotom (Leica RM

2.255). bagian tebal 7-lm deparafinasi, direhidrasi, dan diwarnai dengan hematoxylin. Bagian

potongan tersebut diamati di bawah mikroskop cahaya Olympus BX51.

Untuk studi histologis dan ultrastruktural, jaringan itu tetap diposisikan dalam

glutaraldehid 2% dalam 0,05 buffer cacodylate M (pH 7,2) selama 30 menit pada 4 C, dan

diposisikan setelahnya dalam 1%osmium tetroksida dalam buffer yang sama selama 1 jam

pada 4 C. setelah dehidrasi dalam serangkaian bergradasi etanol, jaringan tersebut ditanam

dalam resin Spurr. Potongan semi tipis (tebal 1 lm) dari jaringan distaining dengan campuran

2%toluidine biru dan 2% borax (1:1) dan diamati menggunakan mikroskop cahaya Olympus

BX51. Potongan ultra tipis distaining dengan uranil asetat dan lead sitrat, dan diperiksa

menggunakan mikroskop elektron Zeiss EM10A (beroperasi pada 60 kV akselerating

voltase). Perlakuan GA pada Bunga mawar Natal potong dalam fase 'jantan' dari bunga

mekar (anthesis) yang dipanen dalam habitat 1 dengan memotong scape-nya di tingkat dasar.

Bunga tersebut disuplai dengan air suling seperlunya dan disimpan pada 5 C (yaitu sekitar

suhu rata-rata di mana bunga-bunga berkembang di bawah kondisi alamiah), di bawah lampu

neon (* 40 lmol m-2 s-1 PAR), padasiklus siang / malam 10/14 jam. Bagian atas 0,5 mm

dari ovarium, dan stilus serta stigma dihilangkan. Ovula diambil menggunakan jarum gigi

Kerr. Cotton plug disisipkan ke dalam rongga ovarium dan segera dibasahi dengan 30 ll air.

Larutan encer (30 ll per cluster dari ovarium) yang mengandung GA1, GA3, atau GA4 (20,

50, atau 100 Lm) kemudian diaplikasikan setiap hari selama 40 hari. Air suling digunakan

dalam kontrol. bunga potong yang Dibuahi yang tidak menerima terapi hormon juga

disimpan di bawah kondisi yang sama. Sepal greening dipantau secara in situ menggunakan

Konten Klorofil Meter (CCM-200, Opti-Sciences, Inc, Hudson, NH, USA) yang diberikan

klorofil tingkat unit berdasarkan pada perbedaan absorbansi pada 600-700 nm (dikaitkan

dengan klorofil a dan b) dan pada 900-1000 nm (dikaitkan dengan cahaya hamburan oleh

struktur sel dan absorbansi nonspesifik). Pengukuran dilakukan untuk masing-masing sepal

secara terpisah di bagian subterminal. Evaluasi didasarkan pada rata-rata level klorofil pada

tiga sepal paling hijau yang berdekatan. Jumlah bunga ulangan termasuk pada perawatan

yang bervariasi bergantung pada ketersediaannya dan dinyatakan dalam deskripsi dari

eksperimen individual.

Analisis GAs endogen

Untuk menaksir status dinamika GA selama perkembangan perianthum dan buah

mawar Natal, level GA endogen (prekursor, GAs bioaktif, dan katabolit-katabolitnya)

ditentukan pada jaringan yang berbeda dengan LCMS / MS [terdiri dari quadrupole /

spektrometer massa tandem waktu-penerbangan (Q-Tof Premier, Waters, Milford, MA,

USA) dan Kromatografi Cair Ultra Kinerja / Ultra Performance Liquid Chromatography

ACQUITY (Waters) dilengkapi dengan kolom fase terbalik (ACQUITY UPLC BEH-C18,

Waters)] menggunakan GA label-2H2 sebagai standar internal, seperti yang dijelaskan

sebelumnya (Varbanova dan lain-lain 2007). Secara singkat, jaringan lyophilized (200 mg

DW per sampel) dihomogenkan dengan 80% aseton (5 ml/100 mg DW), dan 500 pg masing-

masing [17, 17-2H2] GA ditambahkan ke setiap ekstrak. Ekstrak aseton diinkubasi pada -20

C selama sekitar 12 jam, disaring melalui reservoir Bondi Elut (Varian, Palo Alto, CA,

USA), dan kemudian diuapkan sampai kering. ekstrak Residu dilarutkan dalam 4 ml

asetonitril cair 50% dan dipartisi tiga kali terhadap n-heksana (2 ml). Fase cair diuapkan

untuk melengkapkan kondisi keringnya. Residu kemudian dilarutkan dalam buffer fosfat

kalium 1 M (1 ml), dituang kembali kedalam reservoir Bond Elut, yang memiliki kepala

sekitar 3 ml polivinilpirolidon tak larut dan disuspensi dalam air, kemudian dielusi dengan

bufer kalium fosfat 1 M. pH eluat ini di-adjust menjadi 3 dengan 6 N HCl yang diisikan ke

dalam fase cartridge terbalik (Oasis HLB, 60 mg; Waters), yang diprekondisikan dengan

asetonitril 100% diikuti oleh 2%asam format cair. Kolom kemudian dicuci dengan 2% asam

formiat cair dan dielusi dengan asetonitril 80% mengandung asam formiat 1%.

Eluat dikeringkan sepenuhnya menggunakan konsentrator Speedvac, dilarutkan

dalam metanol, dan dimuatkan kedalam kolom pertukaran anion (Obligasi Elut DEA, 500

mg, Varian), yang kemudian dicuci dengan metanol 100% sebelum elusi GA dengan metanol

yang mengandung asam asetat 0,5%. Eluat diuapkan sampai kering. Residu dilarutkan dalam

kloroform: etilasetat (1:1 v / v) yang mengandung asam asetat 1%, diisikan ke dalam

cartridge Bond Elut SI (100 mg, Varian), diprekondisikan dengan etil asetat dan kloroform:

etilasetat (1:1 v / v) yang mengandung asam asetat 1%, dan dielusi dengan kloroform:

etilasetat (1:1 v / v) mengandung asam asetat 1%. GA yang mengandung diuapkan dan

Residu dilarutkan dalam 20 ll asam format cair 2% sebelum analisis LC-MS/MS. Sampel

dielusi pada 200 ll min-1 menggunakan gradien linier air (pelarut A) dan asetonitril yang

mengandung asam asetat 0,05% (v / v) (pelarut B): 3% pelarut B selama 0,1 menit , gradien

terhadap 65%pelarut B selama 20 menit, dan pelarut B isokratik 98% selama 2 menit. GA

diidentifikasi dengan membandingkan waktu retensi LC, dan ion menonojol pada MS / MS

(baik molekul fragmendan ion ) dari GA endogen dengan standar internal masing-masing.

Kadar GA Endogen dihitung dengan menghasilkan kurva kalibrasi dari serangkaian GA

encer yang tidak terlabel terhadap konsentrasi tetap GA berlabel 2H.