*-

MAKAIAH SEMINAR NASIOML BIODIVERSITAS

BIOLOGI- FMIPA, UNAIR

SURABAYA, 22 JULI 2006

ISBN:979-9E109-'l-4

AI(I'IVASI PARTHT]NOGENUSIS OOSI'I' KAMBINGMELALUI PENINGKATAN KALSIUM INTRASELULER DAI\

PENGHAMBATAN SINTESIS PROTETN

Hari Soepriandonor, Gatot Ciptadiz, M. Sasmito Djati3 dan Arief Boedionool Jurusan Biologi FMPA Unair2 Fakultas Peternakan Unibraw

3 Jurusan Biologi FMIPA Unibraw

oFakultas Kedokteran Hewan IPB

Ko respondensi penuli s: andon o _b io @yah o o. co m. s g, telp I faks : 0 3 1 -5 926804.

ABS'I'RAKEfektifitas aktivasi oosit resipien merupakan factor penting dalam prosedur

kloning. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efektifitas prosedur aktivasi untukparthenogenesis oosit kambing dengan menggunakan bahan stimulasi Kalsiumintraseluler Calcium ionophore A23187 (CaI), dibandingkan kombinasimenggunakan Calcium ionophore A23187 (CaI) yang diikuti dengan bahanpenghambat sintesis protein, Cycloheximide (ClD{) dengan mengamati persentase

oosit yang mencapai fase pembelahan (cleavage) maupun fase morula. Oositkambing yang telah dimaturasi selama 30 jam dalam TCM 199 yang disupiementasidengan FBS, FSH dan LH kemudian diaktivasi dengan perlakuan aktivasi tunggdCaI20 pM selama 7 menit dan kombinasi Cal20 pM selama 7 menit yang diikutidengan CHX l0 pglml selama 3,5 jam. Setelah diaktivasi, oosit dikultur selama 48jam. Hasii peneiitian menunjukkan bahwa aktivasi kombinasi secara nyata lebihbanyak menghasilkan oosit yang membelah (cleavage) dibanding aktivasi tunggalyaitu secara berturut-turut untuk aktivasi Cal rata-rata pembelahannya 52,15 o/o, CaIyang diikuti dengan CHX 68,48 %. Aktivasi kombinasi CaI yang dikuti dengan CID(secara nyata menghasiikan jumiah embrio parihenot tahap moruia iebih banyak

QAJ3 %) dibanding aktivasi tunggal (CaI, 0,00 7o) yang diamati pada jam ke-48.Penelitian ini menyimpulkan bahwa parthenogenesis oosit kambing dengan Calciumionophore A23187 yang diikuti dengan Cycloheimide lebih efektif dibandingaktivasi tunggal dengan Calcium ionophore A23187.

Kata Kunciz parthenogenesis, ahitx,i, Calcium ionophore A23187, Cyclohexinide,oosit kambing.

PENDAHULUANAktivasi oosit resipien sesudah transfer inti merupakan sebuah kunci dalam

prosedur kloning. Meski secara alami, sperma memprakarsai aktivasi oo.11 sslamafertilisasi, tetapi banyak prosedur telah dikembangkan unark aktivasi buatan bagioosit cian men<iapatkan perkembangao hingga blastosis (Atberio et sl-,2uri). Yin, eta/. (2000) menyetakzn bahwa sal* s6r fddor pdi4g 1ry menfeo,-lli pdEsdperkembmgru oosit ymg d& mmim tr& li ffi tE:i...i &is.dparthenogenesis. Istilah prteoogcoads ilGrrt Eft Oryl b l5hAan WerU (2001) didefinisilrm s€bagd Foffii *- Gttu d:i r*hil

i

i

MAKAI.AH SEMIf\IAR NASIOML BIODIVERSITAS

BIOLOGI. FMIPA, UNAIR

SURABAYA, 22 JULI 2006

ISBN:979-98109-1-4

betina yang tanpa konfiibusi gamet jantan dengan atau tanpa berakhir dengan

perkembangan dewasaOosit Mammalia umumnya tertahan pada metaphase II (MII) sesudah owlasi dan

akan mengalami meiosis lengkap setelah fertilisasi atau terjadi parthenogenesis

(Albeno et a1.,2001; Lia et al., l99Ea). Spenna yang menghduksi osilasi Kalsium

akan memprakarsai suatu rangkaian peristiwa biokimiawi utama hingga oosit

teraktivasi penuh, sehingga spelma merupakan stimulus alami yang

bertanggungiawab untuk aktivasi oosit yang telatr masak (Alberio et a1.,2001)'

Tujuan aktivasi buatan adalah untuk meniru proses yang sedang terjadi saat

fertilisasi alami, diantaranya yaitu gelombang kalsium intrasitoplasmik, dengan

menyertai penurunan aktivitas maturation&[-phase promoting factor (MPF),

mitogen-activated protein kinase (MAPK) dan cytostatic factor (CSF) (Liu dan

Yang, i999; Liu et al., 2004). Beberapa agen aktivasi buatan termasuk stimuiasi

mekanik, kimia dan fisik antara lain stimulai elekfiik, pendinginan, ethanol, Calcium

Ionophore A23187 (CaI23l87),6-DMAP (Dimethylamino Purine), Cycloheximide,

cytochalasin, sffontium chloride, phorbol ester, ionomycin, inositol 1,4,5-

tiphosphate (iP3) dan thimerosoi. agen aktivasi tersebut teiah digunakan baik

sebagai agen tunggal ataupun kombinasi untuk aktivasi parthenogenesis oosit, ICSI(intracytoplasmic spenn injection) dan hasil transfer inti (embrio rekonstruksi).

Agen aktivasi buatan untuk parthenogenesis dan hasil transfer inti antara lainyaitu bahan kimia Calcium lonophore A23187 (CO untuk menstimulasi kenaikan

kadar Ca2* intraseluler dan Cycloheximide (CHX), suatu inhibitor sintesis protein

telah digunakan baik sebagai agen tunggal ataupun kombinasi untuk aktivasi,

diantaranya pada oosit mencit, tikus, kelinci, sapi, kambing, babi (kumi et a1.,2043;Sedmikova' ei a1.,2003; Suzuki et a1.,2012;Liu ei aL,Z0t2; fuIoos et a1.,1996).

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efektifitas prosedur aktivasi untukparthenogenesis oosit kambing dengan menggunakan bahan stimulasi Kalsiumintraseluler Calcium ionophore A23187 (CO, dibandingkan kombinasi

urcrrggurrarkan Cailoiurn ionophore A23187 (CaI) yailg diikuti tiengan traharr

penghambat sintesis protein, Cycloheximide (C,II{) dengan mengamati persentase

oosit yang mencapai fase pembelahan (cleavage) maupun fase morula. . Hasilpenelitian tentang prosedur aktivasi yang efektif untuk parthenogenesis oosit

kambing ini diharapkan dapat rJigunahan seliagai prosedur aktivasi turtuk penelitian

klsning, terutama transfer inti pada kambing.

BAHAN DAN CARA KEfrJABahan dan Alat

Bahan penelitian yang digunakan yaitu oosit kambing yang diperoleh dengan

cara aspirasi ovarium kambing dari RPH Kambing Sukun Malang, TCM 199

(GIBCO-BRL), penicilin (Meiji Seika), streptomycin (Meiji Seika), DI (deionized

w*dter, PT Ctsula), FBS (Fetal Bovitte Serum, GIBCO-BRL), Paiafin oll (Merck),FSH (ntervet), LH (Intervet), Calcitrm Ionophore A23187 (Sigma Chemical Co),

Cycloheximide (j-(2(3,5 Dimethyl 2-oxocyclohexyl)-2-hydroxyethyl) glutarimide,,

Sigma Chemical Co), Hyalurunidase (Signa Chemical Co).

Alat pcnclitian ,'arg diggnakan yaitt autacl6*'e, aven,waterbath, inkubator CCz,

mikroskop inverted, dissposible syringe 5 ml dengm jrum 2l G, tabung reaksi,

cawan petri 50 mm, dan cawan petri 35 mm {tissae aiture clis},IWAKI).

j

i

rl

MAKAIAI-I SEMINAR NASIOML BIODIVERSITAS

BIOLOGI.FMIPA, UMIRSURABAYA, 22 JULI 2006

ISBN:979-98109-1-4

Cara KerjaPembuatan Medium Stok . a? ,,^n q -^-^;^;t;- al4Dnt^rrrt,'

Medium stok terdd dari rcM 1gg bubuk, NaHCO3, penicilin, streptomycm,

FSH, LH dan DI @riooiiea watur). ivtemUuat stot TCM 199 sebanyak 100 ml :

Mencampur 0,95 g'firra rqg bubuk, oiz e NaHCO3,.0,006 g penicilin' 0,01 g

streptomycin, a,Z3B ! rm*S.;;;g; liio *t DI kemudian dihomogenkan dengan

magnetic stirertau iisaring dengan millipore dengan porus A'22 pm dan disimpan

pada suhu dingin.

MembuatmedrumlVMdankulturoositdenganmenam.bahkanl0plFs}U10ml,10 IU LH, dan FBS (Fera I Bovine t:ii> tt$"t-*l lenjadi

medium denganl0%

FBS, kemudi* d;;^,,t*g* Tilliporc' qetJ{u itu' medium dibuat 4 drop

masing-masing 100 pl pada ggtridish :i;; dan ditutup dengan patafin oll steril'

Selanjuhya petrdrsildiinaroi.k* f.e oJam inLubator dengan Ct-t' s o/o' suhu 38 oC

dengan kelembaban maksimum selama i ii,*r(minimum i ju*) sebelum digrrnakan

*totIVM ataupun kultur sesudah aktivasi'

Koleksi dan Seleksi oositKoleksi oosit diawali de'ngan pengumpul'" oIT'IT kambing' ovarium yang

diperoleh dari RPH ai*urrtL* k.'lr*ii* NaCl fisiologis yang mengandung

antibiotik lalu dibersihd dari jarinean di sekitamya dan dipindahkan \11ry*fisioiogis y-g ,.trn ;i;*pr,iio di dd; wateriath dengan suhu 't8

oC' oosit

dikoleksi deogan dilakgkan aspirasi *"ogg*.k?" dissposible sy'inge 5 ml dengan

ukuran jarum 2L G-Dengan syringS {;;id"'h !eri$ 0'5' *1 washing medium' tepi

ovarium ditusuk d-ai"firk* urp"i*rr. iiurit aspirasi oosit dari kira-kira r0 ovarium

ditaruh pada tabung reaksi yang teiah ;;r.d" di waterbath' Seianjumya diiakukan

pencucian oosit.Seleksi oosit dilakukan di bawah mikroskop inve.rted detsan mqinl*ft*vu

menggunakan pipet pasteur uou *ffi-u.*'"tor,rit. oosit yang dipilih untuk

dimaiurasi vr* oorif a.og* i*aiitas va"g lait (tyiitas i) dengan dit*njui<kan

kekompakan ,"t-iiirno -radiata dan'cuiulus oophorus' Selain itu sitoplasna

;;p; k;.pak dall tidak pucat (Tanaka 2001)'

ilIaturasi oosit secara invifro Gl,}DHasil seleksi oosit diprqdah ke oawan petri 50 mm yang berisi washiryS medium 2

kati, tatu oorit v#g r.i,tilrS'*nritil;,i.k;sat aipinaan ke dalam drop 100 pl

dalam cawan petri 35 mm, masing--"riog d.or ugtitlang-lebih 10 oosit' setelah

iiu fii,kubasi ttcrrg"ai,;;;;;k6 t"-Cri*" i"kubor" CO2 dougaur kadar COz5 on'

.om la "C dengarikelembaban maksimum selama 24 jasl

Evaluasi hasil IVMseteiali zi iit dnntriurasi, o,tsii rlizutlati uutuk firengaflrati kebefira*lan I'{iv1

dengan *.rrgr*fr .J..*;ri ; mulus oophorus dan keberadaan polar bodi pertama

(pB I) Untuk *.igu-'"tl t"Ueradaan PIi I dengan meng.gunduli oosit da,' cumulw

oophonts oengan "*.-i"ornm **it t iyoto*rriartt dao dibmt' dengan

pemipetan <pipwgi. sarr.u *si-tot ur" dai cmrulus oophorus (gund"l)

dike,mbalikan ke dalam drop untuk dtirkrb"d kembali di inkubmor coz hingga jam

ke-30 (Tanaka,2001)'

MAKAISH SEMII\IAR NASIONAL BIODIVERSITAS

BIOLOGI-FMIPA, UNAIR

SURABAYA, 22 JULI 2006

ISBN:979-98109-1-4

Aktivasi oosit untuk parthenogensisSetelah 30 jam IVM diamati lagi keberadaan polar bodi dan dilakukan aktivasi

dengan aktivasi tunggal menggunakan Calcium Ionophore (CaI) untuk meningkatkanKalsium intaseluler ataupun kombinasi yaitu CaI yang diikuti dengan

Cycloheximide (CHX), suatu inhibitor sintesis protein. Perlakuan aktivasi tunggaldengan Cal:20 FM selarna 7 menit sedangkan perlakuan aktivasi kombinasi CaI20 trM selema 7 menit yang diikuti dengan CID( 10 pglml selama 3,5 jam. Sesudatr

aktivasi oosit dicuci deogan medium 3 kali kemudian dipindah ke dalarn dropbaru.

Evaluasi hasil akfivasi oositSetelah 48 jam (2 hari), kultur oosit hasil aktivasi diamati dengan variabel

pengamatan laju pembelahan (cleavage) dengan mengamati persentase oosit yangmencapai cleavage dan morula.

Analisis DataData yang diperoleh berupa oosit teraktivasi yang mencapai tingkat pembelahan

(cleavage rate) dan yang mencapai tahap morula dianalisis dengan ANOVA.

HASIL DAN PEMBAHASANRespon aktivasi terhadap embrio parthenogenesis dengan parameter jumlah

oosit yang membelah (cleavage) dapat diikuti pada Tabel l. Perlakuan CaI, dari 75

oosit (6 pengamatan/ulangan), diperoleh nilai rat*rata persentase banyak sel yangmembelah sebesar 48,13 Yo. Perlakuan kombinasi CaI yang diikuti dengan CHX, dmi85 oosit (6 pengamatarlulangan), diperoleh nilai rata-rata persentase banyak sel yang

membelah sebesar 68,A7 o . Hasil analisis ragam menunjullcan bahwa terdapatperbedaan yang nyata antar perlakuan. Dari Tabel I dapat diketahui bahwa dengan

aktivasi kombinasi dengan CaI yang diikuti CliX secara nyata <iapat meningkatkanpersentase banyaknya sel yang membelatr dibanding aktivasi tunggal dengan CaI.

Tabel 1. Respon aktivasi oosit hasil IVM dengan parameter jumlah sel oosit

yang membelah(cleavage) yang diamati setelah 48 jam kultur.

No,Perlakuan af*"atsi' Jumlah Oosit

(ulangan)Jumlah oosit

^r-^,---vttsva6v

(Rata-raa %)*I C.al A-23187 (20 UM 7 menit) 75

(5)52,15'

2. Cal A-23187 (20 trlvl, 7 menit) +

CID( (10 pglml, 3,5 jam)85(6)

68,48

*Huruf yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan berbeda nyata.

I

MAKALAH SEMINAR NASIONAL BIODIVERSITASBIOLOGI- FMIPA, UNAIRSURABAYA, 22 JULI 2006

ISBN:979-98109-1-4

Tabel2. Respon aktivasi oosit hasil IVM dengan parameter jumlah embrio

parthenot tahap morulayang diamati setelah 48 jam kultur.

No.Pedakuan aktivasi

Jumlah Oositmembelah(ulanean)

Jumlah embriotahap moda

(Rata-rata %) *Cal A-23187 (20 pM, 7 menit) 39

(6) 0,0d

2. Cal A-23187 (20 trlvt 7 menit) +CID( (10 up/ml- 3-5 iam)

58

(6) 20J3b

* Hurufyang berbeda pada kolom yang sama menuqjukkan berbeda nyata.

Unfuk mengetahui etbktrtitas kedua perlakuan, drlakukan analisis respon aktivasiterhadap jumlah monrla yang terbentuk pada 48 jam sesudah aktivasi, yang dapatdiikuti pada Tabel 2. Ditunjukkan bahwa perlakuan kombinasi CaI yang diikutidengan CFD( dapat meningkatkan persentase banyak morula terbentuk dalampembelahan secara nyata.

Selama maturasi oosit, oosit mencit berkembang melalui meiosis I dan tertahanpada metaphase meiosis dengan aktivitas CDKl-cyclin B yang tinggt. Penahananmeiosis dicapai dengan aksi dari cytostatic faclor (CSF), yang mengurangi degradasicycitn B. Penahanan meiosis dirusak oleh sinyai ca2* dari sperma sebagaistimulatornya. C** diperlukan dan pemacu untuk degradasi cyclinB selarna meioiisII (Hyslop et a1.,2004). Tujuan aktivasi buatan untuk meniru proses yang sedangterjadi saat fertilisasi alami, diantaranya yaitu gelombang kalsium intasitoplasmik.cyciin B merupakan kompone,n esensiai dari IviPF (M-phase promoting factor,maturation promoting factor) yang aktif dengan p34*"', yang ditemukan padaseluruh sel eukariota pada saat M-phase, dan degradasinya yang tergantung ubiquitinmenyebabkan sel keluar dari M-phase ke interphase (okada, et a1.,2003; Hyslop e/a1.,2004). Caicium Ionophore A 23i87 teiah diketahui bekerja untuk aktivasidengan memulai gelombang Kalsium dari lingkungan eksfraseluler dan simpanan diintraseluler seperti retikulum endoplasmik (Liu et al., 2002). Dari studi iniditunjukkan bahwa aktivasi CaI secara tunggal pada oosit kambing yang matanghasii maturasi secara in vitro G\1V0 marnpu menghasilkan rata-rata 52,15V'o embrioparthenot dari 75 oosit, meski tiddt-.ada morula yang dihasilkan hingga 48 jam(0,00%). Jika dibandingkan dengan aktivasi kombinasi dengan CHX hasil tersebutsangat rendah. Hal ini sesuai dengan penelitian-penelitian sebelumnya (Liu et al.,2042 ; Liu e i ul., 7998a; Sedmikova' e t ul.,ZAA3).

Setelatr Calcium ionophore (CaI) menginduksi peningkatan Kalsium, menurutSun er al. (1992) selanjutrya akan menghasilkan eksositosis cortical granule (CG),pembentukan pronukleus dan perkembangan awal. Sedangkan hasil purelitianViiiceiit el ui. (1992) derrgaii iiiergguiiakan CaI inenurrjukkan baiiwa tirigkat Kalsiurrrbebas dalam sel menentukan peralihan ke interphase. Dengan"konsentasi CaIrendah, kebanyakan oosit mencit melewati metaphase dan menghasilkan polar bodikedua (PB tr) tetapi tidak meneruskan hingga interphase, malahan khromatid-kliroiiratidnya bertahar terkondensasi dan mikrotubulus spindel metaphase terbenirik(metaphase III).

)

I

Kemampuan Ca2nuntuk memacu degradasi cyclin B pada oosit diikuti stabilisasilevel cyclin B beberapa iam kemudian, sehingga perlu kombinasi bahan untukmenghambat aktivasi MPF ataupun MAPK. Menurut Lilu et a/. (1998b), aktivitaskinase juga berhubungan dengan perkembangan mikrotubulus inti. Oosit denganmaturation/M-phase promoting factor (N{PF), yang tidak aktif tetapi aktivitasmitogen-activated protein kinase (MAPK) bertahan tinggr hanya mencapai aktivasisebagian, keluar dari metaphase II tetapi tidak membentuk pronukleus. Menurut Liudan Yang (1999) inaktivativasi MAPK pada oosit yang diperlakukan dengan CaI.A23187+CIIX terjadi kira-kira 15 jam sesudah aktivasi, yaitu ditandai denganperkembangan pronukleus, seperti pada oosit yang difertilisasi secara in vitro (IVF).Berkaitan dengan aktivasi dengan kombinasi, Hagemann et al. (1995) dalam Alberioet al. (2001) menyatakan bahwa oosit mencit yang diaktivasi dengan kombinasi CaIyang dikuti dengan Cycloheximide yang mencegah sintesis Cyclin B, yaifi subunitregulator MPF, akan menginduksi pembentukan pronukleus dengan rata-rata yangtinggi. Hasil penelitian dengan oosit kambing ini juga menunjukkan bahwa morulayang dihasilkan aktivasi kombinasi Calcium ionophore A23187 denganCycloheximide secara nyata meningkat dibanding aktivasi tunggal menggunakanCalcium ionophore A23187 . Beberapa morula tersebut dapat dilihat pada Gambar L

Gambar 1. Beberapa embrio parthenote tahap morulahasil aktivasi oosit kambing menggunakan kombinasiCalcium ionophorb. -423187 yang diikuti denganCycloheximide.

Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa prosedur aktivasi dengankombinasi peningkatan Kalsium intraseluler (Calcium ionophore A23187) yangdiikuti dengan inhibitor sintesis protein (Cycloheximide) lebih efektif untukparthenogenesis oosit kambing disbanding aktivasi tunggal. Untuk penelitianselanjuhya perlu dilakukan uji kromosom untuk mengetahui ploiditas embrio hasilaktivasi, serta dilakukan evaluasi pada 72 ja* (3 hari) hingga 120 jam (5 hari)sesudah aktivasi untuk mengetahui respon aktivasi tersebut terhadap perkembanganembrio phartenot.

,l1

MAKAIAH SEMINAR NASIONAL BIODIVERSITAS

BIOLOGI- FMIPA, UNAIR

SURABAYA, 22 JULI 2006

ISBN:979-98109-1-4

DA}"I'AR PUS 'AKAAlberio, R., Zakhartchenko, V., Motlik, J., dan Wolf, E. 2001. Mammalian oocyte

activation : lesson from the sperm and implications for nuclear transfer. Int. J.

Dev. Biol. 45:797-849.Hyslop, L.A., Nixon, V. L., Levasseur, M., Chapman, F., Cl4ba, K., McDougali$.,-

Vinables, J.P., Elliott, D.J., dan Jones, K.T.. 2004. Caz*-promoted cyclin 81degradation in mouse oocytes requires the establishment of a metaphase arrest.

D ev el opm ental B iol o g,t 269 : 206-219Ii<umi, S., Asaria, M., Sawai,K., dan Fukui,Y. 2003. Effect of Activation Metho<is for

Bovine Oocytes after Intracytoplasmic Injection. J. Reprod. Dev. 49:37'43.Liu, J., L. Sung, F. Du, M. Julian, S. Jiang, M. Barber, J. Xu, X.C. Tian dan X.

Yang. 20A4 . Differential Development of Rabbit Embryos Derived FromParthenogenesis and Nuclear Transier. Mol Reprod Dev 68: 58-04.

Liu, L., Ju, J., dan Yang, X.. 1998a. Parthenogenetic Development and ProteinPattems of Newly Matured Bovine Oocytes After Chemical Activation. MolReprod Dev 49:298-307.

Liu, L., Ju, i., dan Yang,X. i998b. Differentiai lnaciivaiion of ivlaruradon-PromotingFactor and Mitogen-Activated Protein Kinase Following ParthenogeneticActivation of Bovine Oocytes. Biol Reprod 59: 537-545.

Liu, C-T, Chen, C.H., Cheng, S.P., dan Ju, 1.C..2A02. Parttrenogenesis of RabbitOocytes Activated by Different Stimuli. Anim. Rep. Sci.70:26i'276.

Liu, L. dan Yang, X. 1999. Interplay of Maturation'Promoting Factor and Mitogen-Activated Protein Kinase Inactivation during Metaphase-to-Interphase Transitionof Activated Bovine Oocytes. Biol. Reprod. 61,l-7 .

N{oos, J., Kopf, G.S., dan Schultz, R..}vL1996. Cycloheximide-induced autivation ofmouse eggs: effects on cdc2lcyclin B and MAP kinase activities. Journal of CellScience 109:739-748.

Okada, K., MyanoT., dan Myake, M. 2003. Artificial Activation of Mouse and Pigiviaiur's Oosytes by Divarlcut Caiiuri duiuirt Satu, E., H. Ivliyaiuoio, arrri i.i.Manabe (ed.), Animal Frontier Sciences, Life science update in animal science.

Hokuto Shobo, Kyoto, p.213-217.Rougier, N. dan Werb, 2.. 2001. Minireview: Parthenogenesis in Mammals. Mol

Reprod Dev 59.468-474.Sedmikova', M., Burdova', J., Peff, J., Etrych, M., Rozinek, J., dan Jilek, F.. 2003.

Induction and activation of meiosis and subsequent parthenogenetic developmentof growing pig oocytes usin!.'ealcium ionophore A23187. Theriogenologt 601 lnn 1 Zanr u\r7- 1\rz.\r.

Sun, F.2., Hoyland, J., Huang, X., Mason, W., dan Moor, R.M. 1992. A Comparisonof tnfiacellular Changes in Porcine Eggs After Fertilization andElecfioactiv ation. D ev elopm ent I I 5 : 9 47 -9 56.

Suzuki, H., Kagawa, N., dan Toyokawa, K.. 2002. Pronuclcur Mgration andCytoskeletal Organization of Porcine Oocytes Activated by Various Stimuli. J.Mamm. Ova Res.19: 96-103.

Tanak4 H. 2001 . Reproductive Biologt and Biotechnolog,t. Japan InternationalCooperation Agency Indonesia.

I

i

I

MAKATA}I SEMII\IAR I{ASIOI\IAL BIODIVERSITASBIOLOGI.FMIPA UMIRSURABAYA, 22 JULI 2006

ISBN:979-98109- 1-4

vincent, c., cheek, T.R., dan Johnson, M.H.. 1992. cen cycle progression ofparthenogenetically activated mouse oocytes to interphase is deien&ri-ria.level of intemal calcium. J. Cell. Sc. 103: 3g9_396.

Yin, XJ., Tani, T., Kato, y., dan Tsunoda, y.. 2000. Development of Rabbitlarthenogenetic Oocytes and Nuclear-'l'ransferred Oocytes Receiving CuttureACumulus Cells. Theriogenolog 54: 1469-1476.

l*.