VII.            Analisis dan PembahasanPada praktikum ini kami melakukan percobaan secara invitro mengenai faktor-faktor yang

mempengaruhi aktivitas enzim amilase yang terdapat pada air liur dalam memecah larutan pati. Faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim diantaranya adalah konsentrasi enzim, konsentrasi ion hydrogen (pH), suhu dan konsentrasi substrat.Dalam praktikum kali ini digunakan bahan pati yang diindikasikan sebagai substrat. Sedangkan air liur digunakan untuk mengetahui reaksi enzimatik dari enzim amilase di dalamnya. Larutan Iodium digunakan sebagai indikator perubahan warna dari larutan uji.

a.       Pengaruh Konsentrasi Enzim Terhadap Aktivitas EnzimPercobaan ini dilakukan untuk mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim amilase yang terdapat pada saliva dalam memecah amilum menjadi glukosa. Reaksi enzimatis merupakan suatu reaksi dengan menggunakan penambahan katalis enzim. Enzim berfungsi untuk mempercepat suatu reaksi kimia organik. Salah satu faktor yang mempengaruhi kerja dari enzim adalah konsentrasi, yaitu baik dari konsentrasi enzim itu sendiri maupun dari  konsentrasi substrat.Dalam hal ini pati berperan sebagai substrat, sedangkan saliva merupakan enzimnya. Saliva digunakan untuk mengetahui reaksi enzimatik dari enzim amilase di dalamnya. Sedangkan larutan Iodium berperan sebagai indikator perubahan warna dari larutan uji yang spesifik untuk menguji adanya kandungan amilum dan digunakan untuk membentuk larutan kompleks pada larutan pati.Larutan pati merupakan larutan yang tidak berwarna, sehingga untuk melakukan pengukuran absorbansi menggunakan spektrofotometer larutan pati harus dijadikan larutan kompleks agar menjadi berwarna dan dapat diukur absorbansinya. Jika larutan pati tidak dikomplekskan maka tidak dapat diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer, karena larutan pati tersebut tidak menyerap warna komplementer dari sinar putih sehingga tidak ada warna yang diteruskan.

Warna Radiasi Elektromagnetik Yang Diserap Dan Diteruskan Pada Daerah Visible

λ yang diserap (nm) diserap diteruskan

380-450 Ungu Kuning-hijau450-495 Biru Kuning495-570 Hijau Ungu570-590 Kuning Biru590-620 Oranye Hijau-biru620-750 Merah Biru-hijau

Pada percobaan ini untuk pengukuran absorbansi semuanya dilakukan pada panjang gelombang 680 nm. Sesuai dengan tabel di atas pada panjang gelombang tersebut λ yang diserap larutan pati terkomplekskan untuk mengahasilkan warna Biru-Hijau (yang dilihat oleh mata kita) terletak pada rentang λ = 620-750 nm.Sebelum melakukan pengujian, hal pertama yang dilakukan dalam percobaan ini adalah membuat larutan dari larutan enzim yang mengalami pengenceran 100,200,300,400 hingga 500 kali pengenceran. Tahapannya adalah sebagai berikut:

         Pengenceran 100 kali dilakukan dengan cara mengambil 0,5 mL saliva yang dimasukkan pada labu ukur 50 mL kemudian ditambahkan dengan aquades hingga tanda batas.

         Pengenceran 200 kali dilakukan dengan cara mengambil 1mL larutan enzim yang telah mengalami pengenceran 100 kali lalu ditambah dengan 1mL

         Pengenceran 300 kali dilakukan dengan cara mengambil 1 mL larutan enzim dari pengenceran 100 kali lalu ditambah 2 mL aquades

         Pengenceran 400 kali dilakukan dengan cara mengambil 1 mL larutan enzim hasil pengenceran 100 kali lalu ditambah 3 mL aquades

         Pengenceran 500 kali dilakukan dengan cara mengambil 1 mL saliva dari pengenceran 100 kali lalu ditambah 4 mL aquadesSetiap pengenceran digunakan larutan induknya pada larutan hasil pengenceran 100 kali kemudian diencerkan 200,300,400 dan 500 kali dikarenakan konsentrasi dijaga agar tidak berubah setiap pengencerannya, karena akan dibuat kurva ΔA vs pengenceran bukan kurva ΔA vs konsentrasi.

b.      BlankoPembuatan larutan blanko dilakukan dengan cara mengambil 1 mL pati yang berwarna putih keruh dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dalam percobaan ini pati (amilum) berperan sebagai substratnya. Selanjutnya pati didiamkan 5 menit yang bertujuan agar pati terdegradasi secara sempurna. Lalu ditambahkan 1 mL iodium yang berwarna kuning kecoklatan dan larutan berubah menjadi ungu. Penambahan larutan Iodium digunakan sebagai indikator perubahan warna dari larutan uji dan untuk menentukan adanya amilum kemudian ditambahkan 8 mL aquades, dimana aquades ini berfungsi agar larutan tidak terlalu pekat dan dapat diukur aborbansinya pada Spektrofotometer UV - Vis, karena pada Spektrofotometer UV - Vis jika larutan terlalu pekat maka tidak dapat terbaca absorbansi pada larutan. Pada larutan blanko tidak diberi penambahan enzim, karena larutan blanko disini sebagai pembanding larutan uji. Larutan blanko hanya berisi larutan pati dan iodium sehingga menghasilkan warna ungu(+++++). Pada percobaan ini akan dihasilkan nilai absorbansi blanko yang berfungsi sebagai larutan sebenarnya yang tanpa adanya pengotor-pengotor. Pengukuran dengan spektrometer UV pada λ= 680 nm didapatkan nilai absorbansi blanko sebesar 0,002.

c.       Larutan ujiPembuatan larutan uji pada percobaan pengaruh konsentrasi enzim terhadap aktivitas enzim yaitu dengan cara mengambil masing-masing 1 mL pati pada 5 tabung reaksi, dalam percobaan ini pati (amilum) berperan sebagai substratnya. Selanjutnya pati didiamkan 5 menit yang bertujuan agar pati terdegradasi secara sempurna. Selanjutnya ditambahkan 0,2 mL saliva dari larutan enzim dengan pengenceran 100-500 kali pada tiap-tiap tabung, dan didiamkan selama 1 menit. Dimana pada keadaan ini akan terjadi hidrolisis parsial. Larutan pati merupakan polisakarida yang dapat dihidrolisis oleh enzim amilase pada saliva sehingga menjadi glukosa. Larutan air liur yang telah diencerkan menjadi 100x, 200x, 300x, 400x dan 500x. Dari konsentrasi ini sebelum praktikum kita dapat memprediksikan jika laju reaksi akan mencapai titik tertinggi pada konsentrasi 0,01 dan titik terendah pada konsentrasi 0,0017. Keadaan ini adalah seperti pada teori yang menyebutkan bahwa Hubungan antara laju reaksi dengan

konsentrasi enzim ternyata berbanding lurus. Jadi, makin besar konsentrasi enzim, maka makin cepat laju reaksi yang tertera pada kurva ( Mohamad Sadikin, 2002).Kemudian tiap-tiap tabung tersebut dimasukkan kedalam penangas, hingga mencapai suhu 600 C dan 1000 C. Setelah itu, ditambahkan larutan iodium  1 ml  dalam 8 ml aquadest pada masing-masing tabung, untuk suhu 600 C dan 1000 C dilakukan di luar penangas, perlakuan tersebut bertujuan untuk menghindari terjadinya bumping selama proses pemanasan. Penambahan iodium ini berfungsi sebagai indikator untuk menentukan adanya amilum.Tabung I          : larutan ungu pekat (++++)Tabung II        : larutan ungu pekat (+++) Tabung III       : larutan ungu pekat (++)Tabung IV       : larutan ungu pekat (+)Tabung V        : larutan ungu pekatBerdasarkan data di atas terlihat bahwa semakin besar pengenceran yang dilakukan maka mengakibatkan warna larutan semakin berkurang.

Konsentrasi enzim mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatik. Pengaruh konsentrasi enzim ini yaitu pembentukan produk, dimana makin besar konsentrasi enzim  makin banyak pula produk yang dihasilkan sehingga dapat dinyatakan bahwa laju reaksi berbanding lurus dengan konsentrasi enzim.

Pada larutan uji, larutan pati yang ditambah dengan enzim amilase akan terhidrolisis menjadi glukosa. Sehingga ketika ditambah dengan larutan iodium warna larutan uji menjadi ungu pekat, sebab polisakarida yang terkandung di dalam larutan pati telah terdegradasi menjadi glukosa. Hal tersebut sesuai dengan percobaan yang dilakukan. Oleh karena itu walaupun telah diencerkan 100x, 200x, 300x, 400x, dan 500x konsentrasinya hanya sedikit berkurang. Pada percobaan ini akan menghasilkan nilai absorbansi sampel yaitu absorbansi yang masih memiliki pengotor – pengotor di dalamnya sehingga untuk mencari absorbansi yang sebenarnya dengan cara nilai absorbansi blanko dikurangi nilai absorbansi sampel. Digunakan cara demikian karena adanya kemampuan enzim dalam mendegradasi pati. Pada percobaan ini sebelum pengujian dengan UV dilakukan pengenceran terhadap larutan uji dengan cara mengambil 1mL larutan uji pada tiap-tiap tabung lalu dilakukan pengenceran hingga 10 mL. Hal ini dikarenakan larutan uji yang terlalu pekat sehingga menghindari agar larutan tidak terlalu pekat dan dapat diukur aborbansinya pada UV-vis, karena pada UV-vis jika larutan terlalu pekat maka tidak dapat terbaca absorbansi pada larutan.

Kurva konsentrasi vs kecepatan reaksi enzimatika.       Secara teori

b.      Hasil percobaanPengenceran Absorbansi

BlankoAbsorbansi

SampelΔA = blanko-

sampel100x200x300x400x500x

0,0020,0020,0020,0020,002

-0,031-0,033-0,039-0,0100,004

0,0330,0350,0410,012-0,002

Adapun kurva hasil percobaan memperlihatkan laju reaksi dari enzim semakin cepat

seiring bertambahnya suhu ini terlihat pada kenaikan pengenceran namun terjadi penurunan

aktifitas enzim saat pengenceran 400-500 kali. Kecenderungan ini diakibatkan karena pada saat

penambahan iodium diluar penangas, tidak dilakukan secara bersamaan hal ini akan

mengakibatkan perbedaan benturan antara enzim dan substrat. Pada keadaan pertama yaitu saat

penangas terasa panas dan semakin lama akan terjadi penurunan suhu saat di luar penangas,

akibatnya terlihat peningkatan laju reaksi karena adanya gerak termodinamik yang secara

perlahan membentuk produk dan pada titik optimum yaitu pada saat pengenceran 300 kali dapat

dikatakan membentuk secara sempurna karena kemungkinan pada saat dilakukan penambahan

iodiom tersebut suhu berada pada suhu optimum karena enzim amylase yang merupakan enzim

yang terdapat tubuh memilki suhu optimum 37oC. Pada keadaan kedua yaitu suhu mengalami

kenaikan hingga saat penambahan pada pengenceran 400-500 kali ini perbenturan antara enzim

dan substrat terus berlangsung namun keadaan ini tidak menambah laju reaksi namun

mengurangi laju reaksi ini disebabkan karena enzim mengalami denaturasi sehingga bangun tiga

dimensinya berubah secara bertahap. Jika suhu jauh lebih tinggi dari suhu optimum, maka makin

besar deformasi struktur tiga dimensi tersebut dan makin sukar bagi substrat untuk menempati

secara tepat di bagian aktif molekul enzim. Akibatnya, kompleks E-S akan sukar terbentuk,

sehingga produk juga makin sedikit dan ini terlihat ( Mohamad Sadikin, 2002 ) dari kurva laju

reaksi yang semakin menurun. Dari kurva terlihat bahwa pada pengenceran 300 kali terjadi

kenaikan nilai absorbansi, sehingga didapatkan kurva yang tidak sesuai teori. Hal ini disebabkan

telalu lamanya tabung reaksi berada di luar penangas, sehingga diperkirakan suhu dalam tabung

berada di bawah 60 oC pada saat pencampuran sehingga tumbukan antara enzim dan substrat

mengalami penurun dan mendekati suhu optimum sehingga menghasilkan absorbansi yang

tinggi. Dari hasil percobaan kami tidak dapat membuktikan bahwa konsentrasi mempengaruhi

kecepatan reaksi enzimatik. Kurva yang berbeda pada hasil percobaan dikarenakan adanya

kesalahan dalam prosedur kerja. Kesalahan dalam prosedur kerja ini yaitu ketidaktelitian

dalam  pengenceran. Pengenceran yang dimaksud adalah ketika mengencerkan sebelum diuji

dengan UV-vis sehingga mempengaruhi hasil pengamatan pada hasil nilai absorbansi.

f.     Pengaruh pH Enzim Terhadap Aktivitas EnzimUmumnya kecepatan reaksi enzimatik meningkat hingga mencapai pH optimal dan

menurun setelah pH lebih besar dari pH optimal. Pada pH 1, 3 dan 5, aktivitas enzim masih ada, tetapi kecil (ditunjukkan oleh kecepatan reaksi enzimatik yang kecil pula). Hal ini disebabkan pada pH kurang dari 4, enzim amilase menjadi tidak aktif. Pada pH 8 aktivitas enzim menurun karena telah terlewati pH optimal dari enzim tersebut. Kerja enzim sebagai katalis dipengaruhi oleh pH. Adanya nilai pH tertentu, yang memungkinkan enzim bekerja maksimum. pH tersebut dinamakan pH optimum. Pada kondisi asam protein enzim mengambil struktur 3 dimensi yang sangat tepat, sehingga ia dapat mengikat dan mengolah substrat dengan kecepatan yang setinggi-tingginya. Di luar nilai pH optimum tersebut struktur 3 dimensi enzim mulai berubah, sehingga substrat tidak dapat lagi menempati posisisnya dengan tepat pada bagian molekul enzim yang mengolah substrat. Akibatnaya, proses katalisis berjalan tidak optimum. Oleh karena itu, struktur 3 dimensi berubah akibat pH yang tidak optimum.

Pada percobaan ini digunakan 7 tabung reaksi, 1 untuk blanko dan 5 untuk enzim.a.       Blanko

Pembuatan blanko disini yaitu dengan cara mengambil 1 mL pati 1% yang berwarna putih keruh kedalam tabung reaksi. Dalam percobaan ini pati (amilum) berperan sebagai substratnya. Selanjutnya pati didiamkan 5 menit, hal ini bertujuan agar pati terdegradasi secara sempurna. Lalu ditambahkan 1 mL iodium dan warna larutan menjadi biru keunguan. Penambahan iodium berfungsi sebagai indikator untuk menentukan adanya amilum dan ditambahkan 8 mL aquades, dimana aquades ini berfungsi agar larutan tidak terlalu pekat dan dapat diukur aborbansinya pada Spektrofotometer UV - Vis, karena pada Spektrofotometer UV - Vis jika larutan terlalu pekat maka tidak dapat terbaca absorbansi pada larutan. Pengukuran dengan spektrometer UV pada λ= 680 nm didapatkan nilai absorbansi blanko sebesar -0,005. Nilai absorbansi yang minus disini dikarenakan larutan blanko yang diuji telah mengalami pengenceran 10 kali dengan mengambil 1 mL larutan blanko dalam 9 mL akuades. Hal ini menyebabkan nilai absorbansinya menjadi semakin kecil sehingga enzim amylase tidak bekerja dalam menghirdrolis larutan pati karena struktur 3 dimensi dari enzim amylase telah berubah sehingga tidak dapat mengolah substrat dengan baik.

b.       Larutan ujiCara pembuatan larutan uji dilakukan dengan mengambil 1 mL pati dengan pH sebagai berikut, tabung I pH 1, tabung II pH 3, tabung III pH 5, tabung IV pH 7, tabung V pH 9, dan tabung VI pH 11. Dalam percobaan ini pati (amilum) berperan sebagai substratnya. Selanjutnya pati didiamkan 5 menit, hal ini bertujuan agar pati terdegradasi secara sempurna. Selanjutnya ditambahkan 0,2 mL saliva pada semua tabung, dan didiamkan selama 1 menit. Dimana pada keadaan ini akan terjadi hidrolisis parsial. Larutan pati merupakan polisakarida yang dapat dihidrolisis oleh enzim amilase pada saliva sehingga menjadi glukosa. Lalu ditambahkan 1 mL iodium dan warna larutan menjadi:Tabung I    : biru keunguan  (+)Tabung II  : biru keunguan (++)Tabung III: biru keunguan (+++)Tabung IV : biru keunguan (++)Tabung V  : biru keunguan (+)

Penambahan larutan iodium pada larutan pati menghasilkan larutan kompleks berwarna biru keunguan. Pada keadaan ini menandakan bahwa di dalam larutan pati masih terdapat karbohidrat berupa polisakarida. Pada pH 1, 3, 5, 7 dan 9  ini dapat dikatakan sudah tidak adanya karbohidrat (dari larutan pati yang terdiri dari amilosa dan amilopektin) karena dihidrolisis oleh amilase terlihat dengan tidak didapatkan warna biru kehitaman (menandakan adanya amilosa) ataupun merah ungu (menandakan adanya amilopektin) ketika ditambahkan larutan iodium. Kerja enzim amilase dikatakan sebagai hidrolisis parsial dan memperlihatkan bahwa enzim amilase berada pada kondisi 3 dimensi yang tepat sehingga dapat menghidrolisis karbohidrat dari larutan pati dengan sangat cepat.

Penambahan iodium berfungsi sebagai indikator untuk menentukan adanyaamilum, sehingga dapat dikatakan pada pH ini enzim amilase tidak bekerja optimum dalam menghirdrolis larutan pati karena struktur dari enzim amilase telah berubah sehingga tidak dapat mengolah substrat dengan baik. Lalu ditambahkan 8 mL aquades, dimana aquades ini

berfungsi untuk agar larutan tidak terlalu pekat dan dapat diukur aborbansinya pada Spektrofotometer UV - Vis, karena pada Spektrofotometer UV - Vis jika larutan terlalu pekat maka tidak dapat terbaca absorbansi pada larutan. Pada percobaan ini akan menghasilkan nilai absorbansi sampel yaitu absorbansi yang masih memiliki pengotor – pengotor di dalamnya sehingga untuk mencari absorbansi yang sebenarnya dengan cara nilai absorbansi blanko dikurangi nilai absorbansi sampel. Digunakan cara demikian karena kemampuan enzim dalam mendegradasi pati.

Terlihat  pada kurva di bawah ini:Kurva pH vs kecepatan reaksi enzimatik

a.       Secara teori

b.      Hasil percobaanpH Absorbansi

BlankoAbsorbansi

SampelΔA = absorbansi blanko-sampel

13579

0,0050,0050,0050,0050,005

-0,033-0,018-0,041-0,024-0,031

0,0380,0230,0460,0290,036

Pada percobaan pengaruh pH terhadap aktivitas enzim ini dihasilkan aktivitas enzim pada pH 5 dan pada teori mengatakan bahwa enzim amylase bekerja pada pH optimum dengan rentang 5 – 8. Hal ini dikarenakan pada pH 1 dan pH 9 mikroba pada enzim bereaksi sehingga pati telah terhidrolisis terlebih dahulu pada pH tersebut. Kerja enzim amilase dikatakan sebagai hidrolisis parsial dan memperlihatkan bahwa enzim amilase berada pada kondisi 3 dimensi yang tepat sehingga dapat menghidrolisis karbohidrat dari larutan pati dengan sangat cepat.

VIII.            Kesimpulan1.      Konsentrasi enzim mempengaruhi kecepatan aktifitas enzim. Secara teori Semakin besar

kandungan enzim maka kecepatan menghidrolisis pati juga makin tinggi, makin kecil kandungan enzim maka kecepatan menghidrolisis pati juga makin rendah. Dari hasil percobaan kami tidak dapat membuktikan bahwa konsentrasi mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatik. Kurva yang berbeda pada hasil percobaan dikarenakan adanya kesalahan dalam prosedur kerja yaitu ketidaktelitian dalam  pengenceran. Pengenceran yang dimaksud adalah ketika mengencerkan sebelum diuji dengan UV-vis sehingga mempengaruhi hasil pengamatan pada hasil nilai absorbansi

2.      pH dapat mengaruhi aktivitas enzim. Pada percobaan pengaruh pH terhadap aktivitas enzim ini dihasilkan aktivitas enzim pada pH 5 dan pada teori mengatakan bahwa enzim amylase bekerja pada pH optimum dengan rentang 5 – 8. Hal ini dikarenakan pada pH 1 dan pH 9 mikroba pada enzim bereaksi sehingga pati telah terhidrolisis terlebih dahulu pada pH tersebut.

Jawaban Pertanyaan1.      Buatlah kurva yang menggambarkan hubungan antara kecepatan reaksi enzimatis dengan pH

2.      Buatlah kurva yang menggambarkan hubungan antara kecepatan reaksi enzimatis dengan pH 

IX.            Daftar Pustaka

Ahira, Anne. 2011. Mengenal Enzim-enzim Pencernaan Manusia. (online).http://www.anneahira.com. Diakses pada tanggal 16 Oktober 2012.

Anonim. 2008. Enzim. (online). http://www.wikipedia.com. Diakses pada tanggal 16 Oktober 2011.Lehninger AL. 1982. Dasar – Dasar Biokimia Jilid I. Maggy Thenawijaya, penerjemah. Jakarta:

Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.Ruddin, Choi.2010. LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA II PERCOBAAN II ENZIM. Jayapura :

Universitas CendrawasihSadikin, Mohamad. 2002. Biokimia Enzim. Jakarta : Widya Medika.

Soewoto, Hafiz, dkk. 2000. Biokimia Eksperimen Laboratorium.Jakarta: Widya Medika.Tim . 2013. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: Unesa Press.

http://ndoetpeseg.blogspot.com/2013/12/laporan-praktikum-biokimia-i-pengaruh.html