Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Rabu/5 November 2014

Mikrobiologi Waktu : 11:00 WIB

PJP : Ivone W B. S.Si M.Si

Asisten : Ade Setiawan, AMd.

Embun Novita A., AMd.

UJI AKTIVITAS ENZIMATIS MIKROORGANISME

Kelompok 2

Aang Febrizal J3L113020

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA

PROGRAM DIPLOMA IPB

2014

A. Pendahuluan

1. Latar Belakang

Mikroba ialah jasad renik yang mempunyai kemampuan sangat baik

untuk bertahan hidup. Jasad renik tersebut dapat hidup hampir di semua tempat

di permukaan bumi. Mikroba mampu beradaptasi dengan lingkungan yang

sangat dingin hingga lingkungan yang relatif panas, dari lingkungan yang asam

hingga lingkungan yang relatif panas, serta dari lingkungan yang asam hingga

basa. Mikroba ini tidak dapat dilihat secara kasat mata. Oleh karena itu, untuk

melihat miroorganisme diperlukan alat bantu berupa mikroskop (Afriyanto

2005).

Aktivitas metabolisme tidak terlepas dari adanya enzim. Enzim adalah

molekul biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam amino dalam

komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim memegang peranan

penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. Sebagai protein, enzim diproduksi

dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi, antara lain konversi

energi dan metabolisme pertahanan sel (Volk 1998). Berdasarkan tempat

kerjanya, bakteri juga memiliki jenis enzim yaitu endoenzim dan eksoenzim.

Endoenzim yaitu enzim yang bekerja di dalam sel. Sistem endoenzim selain

bersifat anabolik dapat juga bersifat katabolik. Sedangkan eksoenzim yaitu

enzim yang disekresikan ke luar sel dan berdifusi ke dalam media. Sebagian

besar eksoenzim bersifat hidroliktik, yang berarti bahwa eksoenzim

menguraikan molekul kompleks menjadi molekul yang molekul-molekul yang

lebih sederhana. Molekul-molekul yang lebih kecil ini kemudian dapat

memasuki sel dan digunakan untuk kepentingan sel (Waluyo 2004).

Contoh enzim atara lain enzim amylase, lipase, protease, katalase, dan

banyk lagi. Enzim amilase berfungsi untuk memecah amilum yang merupakan

polimer dari glukosa mencadi monomernya yaitu glukosa. Mekanisme kerja

dari enzim alfa amilase adalah dengan cara memecah ikatan α-1,4-glikosidik

rantai glukan pati dari sebelah dalam. Bakteri yang memiliki enzim amylase

berarti bersifat amililitik. Kebanyakan jenis mikroorganisme amilolitik adalah

kapang, tetapi beberapa jenis bakteri juga ada, jenis yang mempunyai spesies

bersifat Amilolitik misalnya Clostridium butyricium dan Bacillus subtilis

(Fardiaz 1992). Enzim protease adalah enzim yang memiliki daya katalitik

yang spesifik dan efesien terhadap ikatan peptida dari suatu molekul peptide

atau protein. Mikroorganisme melalui suatu sistem enzim yang kompleks,

memecah protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana.(Durham

1987). Bakteri proteolitik adalah bakteri yang memproduksi enzim protease

ekstraseluler, yaitu enzim pemecah protein yang diproduksi di dalam sel

kemudian dilepaskan keluar dari sel. Semua bakteri mempunyai enzim

protease di dalam sel, tetapi tidak semua mempunyai enzim protease

ekstraseluler. Enzim katalase berfungsi untuk memecah hidrogen peroksida

(H2O2) yang terbentuk dari proses respirasi aerob dan bersifat toksik terhadap

bakteri, menjadi dihidrogen oksida (H2O) dan oksigen (O2) yang tidak

toksik.(Raihana N 2011).

Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi

metabolit-metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Kemampuan

bakteri menggunakan senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber

energi yang dapat digunakan untuk identifikasi. Uji-uji biokimia yang

biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau mikroorganisme.

Pengujian biokimia merupakan salah satu hal yang sangat penting dalam dunia

mikrobiologi. Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan

identifikasi bakteri atau mikroorganisme yaitu antara lain adalah uji katalase,

hidrolisis gelatin, uji Oksidatif/Fermentatif, uji Motilitas dan uji Oksidase

(Dwidjoseputro 1994).

2. Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk mengamati aktivitas enzimatik pada bakteri

Aeromonas sp. dan Bacillus sp. melalui uji amilolitik, uji proteolitik dan uji katalase.

B. Alat dan Bahan

Bahan dan alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah biakan cair

bakteri Aeromonas sp. dan Bacillus sp., larutan HCl, Nutrient Agar yang

mengandung pati, lugol’s iodine, skim milk agar (SMA), petri disk, object

glass, Ose, covacs, HCl 10% dan larutan H2O2 3%.

C. Prosedur Kerja

Uji amilolitik. Nutrient Agar yang mengandung pati dituang ke dalam

petri disk, ditunggu hingga keras, kemudian diberi garis pada bagian bawah

agar terbagi menjadi dua bagian dan diberi tanda untuk penggoresan bakteri

Aeromonas sp. dan Bacillus. Masing – masing bakteri digorekan pada tempat

yang telah diberi tanda yang sesuai. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37˚C.

Setelah selesai inkubasi teteskan cawan dengan lugol’s iodine secukupnya

sehingga ke seluruh permukaan media. Hidrolisis sel pati terlihat zona jernih

disekeliling koloni, sedangkan hasil negatif ditunjukkan warna koloni tetap

biru hitam.

Uji proteolitik. Skim Milk Agar dalam petri disk diberi garis agar terbagi

menjadi dua bagian dan diberi tanda untuk penggoresan bakteri Aeromonas sp.

dan Bacillus. Bakteri digorekan sesuai dengan tempat yang telah diberi tanda.

Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37˚C. Setelah selesai inkubasi teteskan

cawan dengan HCl 10% secukupnya sehingga ke seluruh permukaan media.

Aktivitas proteolitik ditunjukkan oleh terbentuknya zona jernih di sekeliling

koloni setelah ditetesi HCl 10%.

Uji katalase. Koloni bakteri diambil satu ose secara aseptis dan

diinokulasikan pada object glass. H2O2 3% ditetskan pada object glass

tersebut. Larutan diamati terbentuknya gelembung untuk hasil positif dan tidak

terbentuk gelembung untuk hasil negatif.

Uji indol. Media pepton dalam dua tabung reaksi disiapkan, kemudian

tabung tersebut diberi lebel bakteri Aeromonas sp. dan Bacillus sp., setelah itu

bakteri diinokulasi kedalam media dengan menggunakan jarum ose sesuai

bakteri yang digunakan. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37˚C. Setelah

selesai inkubasi teteskan reagen covacs pada tabung reaksi sebagai indikator.

Aktivitas indol ditunjukkan oleh terbentuknya warna merah muda pada

permukaan setelah ditetesi covacs.

D. Data dan Hasil Pengamatan

Tabel 1 Hasil Pengamatan Aktivias Enzim bakteri Aeromonas sp. dan Bacillus

sp.

Uji Bakteri Hasil Pengamatan Gambar

Amilolitik Aeromonas sp. + a

Bacillus sp. ++ b

proteolitik Aeromonas sp. + c

Bacillus sp. ++ d

katalase Aeromonas sp. ++ e

Bacillus sp. + f

Indol Aeromonas sp. - g

Bacillus sp. - h

Keterangan: (-) = Tidak ada

(+) = Ada

(++) = Ada Banyak

a b c d

g

e f

h Gambar 5 Uji Indol Aeromonas sp.

dan Bacillus sp

Gambar 1 Uji Amilolitik

Aeromonas sp. dan Bacillus sp

Gambar 2 Uji

Proteolitik Aeromonas

sp. dan Bacillus sp

Gambar 5 Uji

Katalase Aeromonas

sp.

Gambar 4 Uji Katalase

Bacillus sp.

E. Pembahasan

Aktivitas metabolisme tidak terlepas dari adanya enzim. Berdasarkan

tempat bekerjanya, bakteri memiliki juga jenis enzim yaitu endoenzim dan

eksoenzim. Endoenzim yaitu enzim yang berkerja dalam sel sedangkan

eksoenzim yaitu enzim yang bekerja di luar sel. Pada percobaan ini, akan diuji

aktivitas enzimatis mikroba yaitu uji aktivitas eksoenzim yang terdiri atas uji

amilolitik dan uji proteolitik. Untuk uji endoenzim terdiri atas uji katalase.

Percobaan kali ini membutuhkan keadaan yang cukup steril agar tidak terjadi

kontaminan yang tidak diinginkan. Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan

sebelum memulai maupun mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium

dengan menggunakan teknik aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan pada

tangan, kaca preparat dan meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci

dengan sabun terlebih dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh

mikroorganisme yang tak diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang

akurat.

Percobaan ini dilakukan beberapa uji aktivitas dari enzim amilase,

protease, katalase, dan indol. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media

memproduksi tipe metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba

dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Murray

2009). Uji aktivitas tersebut dilakukan dengan menggunakan medium NA yang

ditambah dengan pati dan Skim Milk Agar yang merupakan substrat yang baik

untuk mengisolasi bakteri penghasil enzim amilase dan protease yang

digunakan dalam uji amilolitik dan uji proteolitik. Sedangkan dalam uji

Katalase tidak memerlukan medium agar hanya dengan penambahan H2O2.

Perbenihan indol digunakan untuk melihat kemampuan bakteri mendegradasi

asam amino triptofan secara enzimatik.

Bakteri Amilolitik merupakan mikroorganisme yang mampu memecah

pati menjadi menjadi senyawa yang lebih sederhana, terutama dalam bentuk

glukosa. Kebanyakan mikroorganisme Amilolitik tumbuh subur pada bahan

pangan yang banyak mengandung pati atau karbohidrat, misalnya pada

berbagai jenis tepung. Kebanyakan jenis mikroorganisme amilolitik adalah

kapang, tetapi beberapa jenis bakteri juga ada, jenis yang mempunyai spesies

bersifat Amilolitik misalnya Clostridium butyricium dan Bacillus

subtilis (Fardiaz, 1992). Uji amilolitik dilakukan dengan membiakkan

bacillus/aeromonas di media NA dengan campuran pati sebanyak (2g/L).

Selama 24 jam diinkubasi dalam inkubator, kemudian ditambahkan dengan

larutan iodin sebagai indikator saat pengamatan. Iodin digunakan karena akan

bereaksi memasuki pati yang memiliki struktur spiral dan menghasilkan warna

biru keunguan. Berdasarkan hasil yang didapatkan bahwa sama seperti literatur

yang meyatakan bahwa bakteri bacillus yang merupakan bakteri amilolitik ini

ditandai dengan adanya zona bening setelah penambahan iodin. Karena pati

yang berada dalam media NA sudah di hidrolisis oleh bacillus sp. yang

menghasilkan enzim amilase. Hal tersebut akan membuat pati menjadi bentuk

polisakarida yang lebih kecil (dextrin) dan maltosa. Sehingga pada saat

penambahan larutan iodin tidak terbentuk warna biru karena iodin sudah tidak

dapat bereaksi lagi dengan pati. Percobaan menunjukkan hasil yang positif

pada keduanya, saat diteteskan Iodin zona bening terbentuk pada permukaan

Aeromonas sp. dan Bacillus sp.. Reaksi mekanisme kerja enzim amilase dapat

dilihat pada gambar 6.

Gambar 6 Reaksi uji Amilolitik (Rehm dan Reed 1987).

Uji proteolitik digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme

untuk menghasilkan enzim protease. Protease atau enzim proteolitik adalah

enzim yang memiliki daya katalitik yang spesifik dan efisien terhadap ikatan

peptida dari suatu molekul polipeptida atau protein. Protease dapat diisolasi

dari tumbuhan (papain dan bromelin), hewan (tripsin, kimotripsin, pepsin, dan

renin), mikroorganisme seperti bakteri, kapang, virus, dan cacing parasitik

seperti cestoda, trematoda, dan nematoda. (Todorovo 2000). Percobaan ini

menggunakan protein kasein susu pada media skim milk agar proses ini disebut

juga dengan peptonisasi atau proteolisis. Kasein merupakan protein utama

susu, suatu makromolekul yang tersusun atas subunit asam amino yang

dihubungkan dengan ikatan peptida. Kasein berfungsi sebagai substrat bagi

enzim protease (Susanti VH E 2002). Bakteri proteolitik adalah bakteri yang

memproduksi enzim protease ekstraseluler, yaitu enzim pemecah protein yang

diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan keluar dari sel. Semua bakteri

mempunyai enzim protease di dalam sel, tetapi tidak semua mempunyai enzim

protease ekstraseluler. Aktivitas mikroba dalam mendegradasi protein

ditunjukkan dengan adanya zona halo (lingkaran jernih) di sekitar koloni (Putri

dkk 2012). Percobaan menunjukkan hasil yang positif pada keduanya, saat

diteteskan HCl 10% zona bening terbentuk pada Aeromonas sp. dan Bacillus

sp. Reaksi mekanisme kerja enzim protease dapat dilihat pada gambar 7.

Gambar 7 Reaksi uji Proteolitik (Durham 1987).

Uji Katalase dilakukan untuk melihat terdapat atau tidaknya enzim

katalase. Enzim katalase berfungsi untuk memecah hidrogen peroksida (H2O2)

yang terbentuk dari proses respirasi aerob dan bersifat toksik terhadap bakteri,

menjadi dihidrogen oksida (H2O) dan oksigen (O2) yang tidak toksik.(Raihana

N 2011). Ini sebabnya untuk menguji enzim katalase ini bakteri ditambahkan

larutan H2O2, dan dinyatakan positif ketika terbentuk gelembung. Gelembung-

gelembung gas tersebut berasal dari hidrogen peroksida (H2O2) yang terurai

menjadi air dan O2 oleh aktivitas enzim katalase yang dimiliki oleh semua

isolatbakteri toleran uranium (Jayanti MW dkk 2013). Reaksinya yaitu:

H2O2→ H2O + O2

Percobaan menunjukkan hasil yang positif pada keduanya, saat diteteskan

H2O2 gelembung terbentuk pada Aeromonas sp. dan Bacillus sp.

Tryptophan merupakan asam amino esensial yang dapat mengalami

oksidasi dengan cara kegiatan enzimatik beberapa bakteri. Konversi triptofan

menjadi produk metabolik di mediasi oleh enzim Tryptophanase. Media ini

biasanya digunakan dalam indetifikasi yang cepat. Perbenihan indol digunakan

untuk melihat kemampuan bakteri mendegradasi asam amino triptofan secara

enzimatik. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan

(cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini

tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber karbon, yang dapat

diketahui dengan menambahkan larutan kovaks. Asam amino triptofan

merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga

asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat

penguraian protein (Volk dan Wheeler, 1993). Pada uji ini menggunakan

larutan kovacs yang berguna sebagai indikatior pemberi warna karena

mengandung P-dimetil amino benzaldehida yang akan bereaksi dengan indol

mengasilkan warna merah muda pada permukaan larutan yang berisi bakteri.

media yang digunakan ialah trypton karena spesifik untuk uji indol.

Berdasarkan hasil yang didapatkan, bakteri Aeromonas sp. dan Bacillus sp.

menghasilkan uji negatif karena tidak menghasilkan warna merah muda pada

permukaan.

F. Simpulan

Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa pada uji

amilolitik dan uji proteolitik bakteri Aeromonas sp. dan Bacillus sp. hasinya

positif ditandai dengan adanya zona bening di sekitar bakteri. Uji katalase

bakteri Bacillus dan Aeromonas menghasilkan uji positif ditandai dengan

adanya gelembung. Sedangkan pada uji indol, Aeromonas sp. dan Bacillus sp.

menghasilkan hasil yang negatif karena tidak menghasilkan warna merah muda

pada permukaan larutan.

G. Daftar Pustaka

Afrianto L. 2004. Menghitung Mikroba Pada Bahan Makanan, Cakrawala

(Suplemen pikiran rakyat untuk iptek). Bandung Farmasi : FMIPA ITB

Durham, D.R., D.B. Stewart, and E.J. Stellwag. 1987. Novel alkaline and heat

stable serine proteases from alkalaphilic Bacillus sp. strain GX6638. J.

Bacterial. 169(6):2762- 2768

Dwidjoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi Jakarta: Djambaran.

Hadioetomo. 1993. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Salemba Medika

Fardiaz S. 1992. Mikrobiologi pangan I. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama

Fersht A.1977. Ikhtisar Biokimia Dasar A. Jakarta : Balai Penerbit FKUI.

Friedmann dan Herbert. 1981. Biokimia. Jakarta: Gramedia

Jayanti MW, Octavia B, Yazid M. 2013. Karakterisasi Bakteri Toleran

Uranium dalam Limbah Uranium Fase Organik Tbp-Kerosin. Prosiding

Seminar Nasional Teknologi Pengelolaan Limbah IX Pusat Teknologi

Limbah Radioaktif-BATAN. ISSN 1410-6086

Murray Robert K, Daryl K. Granner dan Victor W. Radwell. 2009. Biokimia

Harper Edisi 27. Dr. Brahm U. Pendit, penerjemah. Jakarta : EGC.

Terjemahan dari : Harper’s Illustrated Biochemistry 27th Ed.

Panil Zulbadar. 2004. Memahami Teori dan Praktek Biokimia Dasar Medis.

Jakarta: Buku Kedokteran EGC.

Pujiyanti Sri. 2007. Menjelajah Dunia Biologi 3. Jakarta : Platinum.

Putri, Ratna Ika, Mila Fauziyah dan Agus Setiawan. 2009. Penerapan Kontroler

Neural Fuzzy Untuk Pengendalian Kecepatan Motor Induksi 3 Fasa pada

Mesin Sentrifugal. INKOM. Vol 3 : 1-2

Raihana N. 2011. Profil Kultur dan Uji Sensitivitas Bakteri Aerob dari Infeksi

Luka Operasi Laparatomi di Bangsal Bedah Rsup Dr. M. Djamil Padang.

Padang : Universitas Andalas

Rehm H J dan G Reed. 19987. Biotechnology. Vol 8: Enzyme Technology.

VCH Verlags gessell schaff, mbH, Weinhaim.

Susanti VH E. 2002. Isolasi dan Karakterisasi Protease dari Bacillus subtilis

1012M15. Biodiversitas. Vol 4 (1) : 12-17. ISSN: 1412-033X

Todorovo. 2000. Karakterisasi Protease dari Ekskretori/sekretori Stadium l3

ascaridia galli

Volk and Wheleer. 1993. Analisis Praktikum Mikrobiologi Umum untuk

Perguruan Tinggi. Yogyakarta: UGM Press

Waluyo Iud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM-Press.

Wedhastri S. 2002. “ Isolasi dan Seleksi Azotobacter spp. Penghasil Faktor

Tumbuh Dan Penambat Nitrogen Dari Tanah Masam”, Jurnal Ilmu

Tanah dan Lingkungan Vol 3, No. 1.