LAPORAN PRAKTIKUM ENUMERASI MIKROORGANISME

1.TUJUAN PRAKTIKUMMengetahui jumlah mikroorganisme yang terkandungdi dalam mikroorganisme pada

setiap pengenceran yang ditentukan denganmetode enumerasi

2.TEORI DASARIstilah pertumbuhan yang biasanya dipergunakan pada bateri dan mikroorganisme jenis

lainnya mengacu pada perubahan yang terjadi pada sel. Berbeda dengan manusia dimana pertumbuhan dsecar fisik terlihat secara visual. Pertumbuhan merupakan pertambahan jumlah. Tersedia banyak teknik didalam laboratoriumj untuk mengukur pertumuhan bakteri tersebut. Alat – alat yang ada tersebut berkisar dari peralatan yang masih sederhana seperti dsebuah kaca objek dengan olesan yang diwarnai. Seain itu terdapat pula metode – metode yang lain dalam pengukuran pertumbuhan bakteri, misalnya dengan metode hitung cawan, pengukuran kekeruhan dari suatu suspense, pengukuran dengan menggunakan membrane atau filter molekuler dan penentuan berat (Volk, 1985).

Suatu bakteri dapat dihitung secara elektronik yaitu dengan cara memasukkan biakan melalui lubang yang sangat kecil pada alat penghitung partikel counter. Alat penghitung yang semacam ini dapat dipakai secara rutin mencegah sel darah, namun tidak pula disesuaikan untuk memecah bakteri (Volk, 1985)

Akan tetapi, bukanlah laju pertumbuhan bakteri yang tepat melainkan ada atau tidaknya pertumbuhan bakteri yang akan menjadi perhatian. Adapun cara yang dilakukan untuk menentukannya, yaitu hanyalah dengan melihat biakan. Suatu medium cair akan berubah menjadi keruh sedangkan medium yang padat paada umumnya akan memperlihatkan pertumbuhan, baik itu pada permukaan dari medium maupun di dalam medium tersebut (Hadioetomo, 1996)

Penetapan jumlah bakteri di dalam suatu populasi bakteri mungkin saja akan mengalami hambatan. Hal ini karena tidak semua sel yang ada di dalam suatu biakan itu mampu untuk hidup secara trus- menerus. Jadi dalam perhitungan ini maka yang dianggap sebagai sel hidup adalah sel yang membentuk koloni di dalam medium biakan atau dapat juga digunakan bakteri yang mampu membentuk suspensi di dalam medium biakan. Sel- sel yang mampu hidup terus adalah yang dihitung dengan berbagai metode untuk menetapkan jumlah selnya. Pada jumlah total sel, maka ikut dihitung semua sel yang tampak atau yang dapat dihitung dengan cara yang lainnya, sehingga dengan demikian sel-sel mati dan cacat akan ikut terhitung (Indra, 2008).

Terdapat beberapa cara untuk menentukan jumlah bakteri yang beradadalam suatu medium yaitu :

- Menghitung jumlah bakteri secara keseluruhan (total cell count). Dilakukan penghitungan terhadap sejumlah bakteri yang ada dalam biakan baik yang masih hidup maupun yang mati

- Jumlah bakteri yang hidup (viable count). Hanya menggambarkan kumlah dari sle yang masih hidup saja.

Dalam penghitungan jumlah mikroba biasanya dilakukan pengenceran yang biasanya dilakukan dega bantuan botol pengenceran (SPC ) atau dengan tabung reaksi. Pada pengenceran dengan botol pengenceran sebaiknya sampel cairan dikocok terlebih dahulu sehingga kelompok el dapat terpisah dan menghindari resiko terjadinya kelompok koloni yang besar dan menutupi lebih dari setengah cawan petri. Pengenceran sel bertujuan untuk

membantu penghitungan jumlah mikroorganisme yang benar. Tetapi apabila angka pengenceran yang digunakan terlalu tinggi maka relative hasil jumlah koloni yang dapat dihitung akan semakin sedikit. (Gobel,2008)

Analisis kualitatif sangat dibutuhkan untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada sampel tertentu . biasanya analisis kualitatif disebut dengan enumerasi mikroorganisme. Metode penghitungan (enumerasi) mikroorganisme dapat dilakukan secara langsung terhadap sampel salah satunya dengan bantuan mikroskop,maupun dengan cara tidak langsung. Metode penghitungan secara langsung diterapkan untuk pengujian salinitasi lingkungan.

Metode penghitungan bakteri :1. Pengehitungan jumlah bakteri hidup (langsung)

Berikut ini adalah metode penghitungan bakteri secara langsung yaitu :a. Plate Count (penghitungan cawan)

Berdasarkan asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme hidup di dalam suspense yang nantinya akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditempat pada media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Langkah selanjutnya lakukan inkubasi terhadap jumlah koloni. Lakukan penghitungan terhadap jumlah koloni yang merupakan jumlah perkiraan mikroorganisme dalam suspense tersebut. Koloni biasanya tidak hanya berasal dari satu jenis mikroorganisme, karena terdapat beberapa jenis mikroorganisme tertentu yang biasanya hidup berkelompok membentuk rantai. Untuk penghitungan jumlah koloni dengan metode enumerasi Total Plate Count digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. biasanya kolonidihitung berdasarkan tingkat pengenceran sampelnya. Penghitungan hanya dapat dihitung pada jumlah koloni antara 30-300 karena keterbatasan mata manusia dalam penghitungan yang mempengaruhi ketelitian hasil perhitungan. Apabila jumlah koloni <3 dinamakan too few to count dan apabila >300 maka dinamakan to numerous to count.

Table 1. contoh penghitungan jumlah koloni pada setiap pengenceran

Apabila jumlah koloni yang dihitung terlalu banyak sebaik cara penghitungan yang dilakukan adalah dengan bantuan transek agar menambah keakuratan hasil penghitungan. Cara transek ini yaitu dengan membagi cawan menggunakan bantuan spidol dan bentuknya sesuai dengna kebutuhan.

Gambar 1. Cara penghitungan koloni

Syarat dan cara penghitungan koloni :- Satu koloni dihitung satu koloni- Dua koloni yang bertumpuk dan sulit untuk dilihat terpisah dihitung Satu- Beberapa koloni yang berhubungan dihitung satu koloni- Dua koloni yang berhimpitan tetapi masih dapat dipisahkan dihitung dua

koloni- Koloni yang ukurannya menutipi lebih dari setengah cawan petri maka

tidak dapat dihitung- Koloni yang besarnya kurang dari setengah cawan dihitung 1 koloni

Untuk menghitung total koloni per ml (CFU perml) adalah dengan perkalian antara jumlah koloni dengan factor pengenceran.

Prisip dari metode penghitungan dengan cawan adalah jika sel jasad renik yang diletakkan pada media agar, maka jasad renik tersebut akan cepat berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dapat dihitung secara kasat mata tanpa bantuan alat.

Metode TPC ini merupakan cara yang paling sensitif dikarenakan (Ferdiaz,1992):- Hanya dapat menghitung sel yang masih hidup- Beberapa jenis jasad renik dapat dihitung sekaligus- Dapat digunakan untuk mengisolasi dan identifikasi jasad renik karena koloni

yang terbentuk mungkin berasal dari satu jasad renik yang memiliki penampakan spesifik

Syarat perhitungan jumlah bakteri dengan metode cawan adalah:- Jumlah koloni tiap cawan antara 30 – 300, bila tidak ada pilih yang paling

mendekati- Bila perbandingan jumlah bakteri antara pengenceran yang lebih besar dengan

pengenceran sebelumnya <2, hasilnya dirata-rata, tetapi bila >2 yang dipakai jumah bakteri dari pengenceran sebelumnya

Metode penghitungan cawan memilik beberapa kekurangan diantaranya :- Hasil penghitungan tidak menunjukan jumlah sel yang sebenarnya, karena

beberapa sel yang berdekatan membentuk koloni- Medium dan kondisi yang berbeda akan mengakibatkan perbedaan jumlah

dari bakteri yang dapat terhitung- Mikroba yang ditumbuhkan sebaiknya dapat tumbuh pada medium padat dan

membentuk kolni yang kompak, jelas dan tidak menyebar

- Memerlukan persiapan dan waktu penginkubasian yang begitu lama hingga koloni dapat dihitung

b. Most Probable Number (MPN)Metode ini didasarkan pada statistic (teori kemungkinan). Metode ini biasnaya

digunakan untuk mengetahui kadar koliform pada perairan yang menjadi sumber baku air minum. Cirri utama yaitu bakteri gram negative, batang pendek, tidak membentuk spora, fermentasi laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37oC.

Untuk metode ini biasanya digunakan medium cair dalam wadah berupa tabung reaksi . Sampel ditumbuhkan pada sri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3 tabung disebut seri 3 dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Media pada tabung adalah Lactose Broth yang diberi indicator perubahan pH dan ditambah tabung durham. Pemberian sampel pada setiap seri tabung berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10ml ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stregth) yang memiliki komposisi beef extract (3gr), peptone (5gr), lactose (10gr) dan Bromthymol Blue (0,2%) perliter. Untuk sampel 1ml dan 0,1 ml dimasukkan pada media LBSS (lactose Broth SIngel Stregth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari LBDS yaitu 5gr.

Berdasarkan sifat koliform, maka bakteri ini dapat memfertasikan laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalamtabung durham. Nilai MPN ditentukan dnegna kombinasi jumlah tabung posit (asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi.

2. Penghitungan jumlah bakteri tidak langsungBiasanya dilakukan dengan metode secara mikroskopik yaitu dengan menghitung

jumlah bakteri dalam satuan isi yag sangat kecil. Biasanya jenis alat yang biasa yang digunakan adalah Petroff-Hauser Chamber atau Haemocytometer. Cairan yang terdapat antara coverglass dan alat mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam bujur sangkar.

Ruang hitung terdiri dari 9 kotak dengna luas 1mm2. Sedangkan kotak besar yang ditengah terdiri dari 25 kotak dengan panjang 0,2mm. satu kotak dibagi lagi menjadi 16 kotak. Sehingga pada satu kotak besat terdiri dari 400 kotak kecil dengan ketebalan dari ruang hitung adalah 0,1mm. sel bakteri memenuhi setia ruang hitung sehingga jumlah bakteri persatuan volume dapat dihitung.

Bakteri persatuan volume dapat dihitung

Keuntungan dari penggunaan hemasitometer adalah:- Waktu yang digunakan untuk penghitungan relative lebih singkat- Biaya pengetasan lebih hematKekurangan dari penggunaan hemasitometer adalah :- Ketidakmampuan untuk membedakan antara sel hidup dan mati- Kesulitan dalam penghitungan bakteri dalam ukuran yang kecil dikarenakan proses

penghitungan tidak dapat dibantu dengan minyak imersi, melainkan hanya dapat dibantu dengan tween 80% (bahan anti gumpal ) – (Gobel, 2008)

MEDIA PERTUMBUHAN MIKROORGANISMEMedia pertumbuhan digunakan sebagai tempat perkembang biakan mikroba, isolasi,

menumbuhkan, menguji sifat-sifat fisiologi dan media penghitungan jumlah mikroba. Pembuatan media harus dalam keadaan septic dan harus steril untuk menghindari kontaminasi pada media. Di dalam media pertumbuhan terdapat nutrisiyang menunjang fungi hidup dari mikroba.

Beberapa mikroba memiki cirri dan karakter hidup yang berbeda pada proses pertumbuhannya. Sebagai contoh, terdapat seumlah jenis mikroba yang dapat hiduppada medium yang mengandung sulfur, dan sebaliknya. Oleh karena perbedaan cirri dan karakteristiklah mengakibatkan adanya beberapa jenis medium

Berikut ini merupakan klasifikasi medium pertumbuhan mikroba yang terdapat pada tebel dibawah ini :

Klasifikasi Nama / sebutan ContohSumber nutrient Alamiah

Buatan / artifisialPadat – irreversible

Susu, kalduCampuran zat kimiaSerum darah terkoagulasi

Keadaan fisik Padat – reversibleSetengah padatCair

Agar nutrientAgar lunakKaldu nutrient

Komponen kimiawi penyusun

Kimiawi – sintetic (komposisi diketahui)Kompleks (komposisi tidak diketahui)

Agar nutrient

Ammonium sulfat, media garam, glukosa

Nutrisi mikroba Enrichment mediaDiffrensial mediaSelected media

Kaldu infuse jantungAgar eosin-biru methilenAgar deoksikolat

Test media Media uji vit b-12

Keterangan :

Irreversible adalah sifat mediaum yang tidak dapat kembali kebentuk semula. Seperti darah yang terkoagulasi (menggumpal) tidak dapt kembali menjadi darah cairReversible adalah medium yang dapat kembali ke dalam fase semula setelah terjadi perubahan, seperti agar yang dapat memadat apabila didinginkan dan dapat mencair apabila dipanaskanEnrichment media adalah medium yang dapat menunjang pertumbuhan mikroba yang rewel, yaitu mikroba yang memiliki persyaratan yang rumit. Jenis mikroba ini tidak dapat ditumbukan pada medium biasa karena membutuhkan beberapa ntrisi pengaya yang nantinya dapat menyokong kehidupan mikroba tersebutDifferential media medium yang digunakan untuk membendakan bentuk dan karakter koloni mikroba yang tumbuh. Beberapa mikroba dapat tumbuh pada medium tertentu tetapi untuk jenis media tersebut jenis mikroba lain tidak dapat hidup pada medium tersebut. Selain itu, mikroba juga memiliki penampilan pertumbuhan yang khas sehingga dapat dengan mudah untuk dikenali dan biasanya digunakan sebagai identifikasi dan isolasi mikroba.Selected media medium pertumbuhan yang terpilih dan khusus, maksudnya dengan medium ini dapat menghambat pertumbuhan jenis mikroba yag tidak diinginkan dan hanya jenis mikroba tertentu yang dapat hidup. Medium ini menyesuaikan antara kondisi lingkungan dengan media hidup pertumbuhan mikroba. Medium ini digunakan untuk proses identifikasi mikroba.Test media medium yang digunakan untuk mengukur secara kuantitatif suatu fitamin maupun antibiotic.

Berikut merupakan beberapa jenismedia yang dapat digunakan dalam percobaan mikroobiologi :1. Lactose Broth

Digunakan sebagai media untuk mendeteksi kehadiran dari bakteri koliform yang terdapat pada air, makanan, produk susu, enrichment media bagi salmonella dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang difermentasi untuk organism koliform. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrient esensial untuk metabolism bakteri. Dibuat dengan komposis 0,3% ekstrak beef, 0,5 % pepton dan 0,5% laktosa

2. EMBA (Eosin Methylene Blue Agar)Terdapat kandungan laktosa di dlaamnya sehingga media ini dapat memilah sehingga hanya bakteri yang dapatmemfertasi mikroba saja yang dapat hidup di dalamnya seperti S.aureus, P.aerugenosa dan Salmonella. Mikroba yangmemfertasi laktosa menghasilkan koloni dnegna inti berwarna gelap dengan kilatan logam. Sedangkan untuk mikroba lainnya yang dapat tumbuh koloninya tidak berwarna. Dengan bantuan eosin dan methilbiru akan mempertajam perbedaan antara keduannya. Kelemahan dari penggunaan media ini adalah jika digunakan pada tahap awal kuman lain terutama P.aerugenosa dan Salmonella akan dapt tumbuh dan menimbulkan keraguan. Tetapi kita tetap dapat mengetahui bahwa kontaminat tersebut merupakan E.coli. Agar EMB (levine) merupakan media padat yang dapat digunakan untuk menentukan jenis bakteri coli dengan memberikan hasil positif dalam tabung. EMB yang menggunakan eosin dan metilin bklue sebagai indikator memberikan

perbedaan yang nyata antara koloni yang meragikan laktosa dan yang tidak. Medium tersebut mengandung sukrosa karena kemempuan bakteri koli yang lebih cepat meragikan sukrosa daripada laktosa. Untuk mengetahui jumlah bakteri coli umumnya digunakan tabel Hopkins yang lebih dikenal dengan nama MPN (most probable number) atau tabel JPT (jumlah perkiraan terdekat), tabel tersebut dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah bakteri coli dalam 100 ml dan 0,1 ml contoh air.

3. Nutrient agarMerupakan medium umum untuk uji air dan produk dairy. Digunakan untuk medium pertumbuhan untuk jenis mikroorganisme yang tidak selektif dengan artian bahwa jenis mikroorganisme yang terdapat di dalamnya adalah heterogen. Media ini terbuat dari ekstrak beef, pepton dan agar. Biasanya medium ini digunakan dalam beberapa prosedur bakteriologi seperti uji biasa air, limbah, produk pangan, embawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel uji bakteri dan untuk mengisolasi organism dalam kultur murni.Komposisi nutrient agar adalah ekstrak beef 10g, pepton 10g, NaCl 5g, air desitisilat 1000ml dan 15gr agar/L. agar dilarutkan dengan komposisi lain dan distrilisasi denga autoklaf pada 121oC selama lebih kurang 15menit. Siapkan wadah sesuai dengan kebutuhan.

4. Nutrient brothMerupakan media untuk mikroorganisme yang berberntuk cair. Nutrient brith dibuat dnegan komposisi dan cara sebagai berikut :- Larutkan 5 gr pepton dalam 850 ml air distilasi/akuades- Larutkan 3gr ekstrak daging dalam larutan yang dibuat pada langkah pertama- Atur hingga pH sampai 7- Tambahkan air dan destilasi sebanyak 1000ml- Sterilisasi dengan autoklaf-

5. MRSA (deMan Rogosa Sharpe Agar)pertama kali ditemukan oleh De Mann, Rogosa dan Shape untuk memperkaya, menumbuhkan dan mengisolasi Janis Laktobasillus dari seluruh jenis bahan. MRS agar mengndung polysorbat, asetat, magnesium dan mangan yang diketahui untuk beraksi/bertindak sebagai factor pertumbuhan lactobasilus .

6. Trypticase Soy Broth (TSB)TSB adalah media brothyang diperkaya untuk tujuan umum, isolasi dan petumbuhan bermacam mikroorganisme. Media ini banyak digunbakan untuk isolasi bakteri dari specimen laboratorium dank an mendukun pertumbuhan mayoritas bakteri pathogen. TSB mengandung kasein dan pepton kedelai yang menyediakan asam amino dan subtansi nitrogen lainnya yang membuatnya menjadi media bernutrisi untuk bermacam mikro organismen. Dekstrosa adalah sumber energy dan natrium klorida untuk mempertahankan kesetimbangan osmotic. Dikalium fofat ditambahkan sebagai buffer untuk memepertahankan pH.

7. Plate Count Agar (PCA)PCA digunakan sebagai medium untuk microba aerobic dengan inokulasi di atas permukaan. PCA dibuat dengan melarutkan semua bahan (casein enzyme hydolisate yeast extract, dextrose, agar) hingga membentuk suspense 22,5 g/L kemudian

disterilisasi pada autoklaf (15 menit pada suhu 1210C). Media PCA ini baik untuk pertumbuhan total microba (semua jenis microba) karena didalamnya mengandung komposisi casein enzymic hydrolisate yang menyediakan asam amino dan substansi niotrogen komplek lainnya serta ekstrak yang mensuplai vitamin b kompleks

8. APDAMedia APDA berfungsi untuk menumbuhkan dan menghitng jumlah khamir dan yeast yang terdapat dalam suat sampel. Khamir dan yeast akan tumbuh dengan optimal pada media yang sesuai. Adanyaasam tertarat pada pH rendah maka pertumbuhan bakteri terhambat. APDA dibuat dengan merebus kentang selama 1 jam / 45 menit, agar dilelehkan dalam 500ml air. Campurkan ekstrak kentang dalam agar lalu ditambahkan glukosa dan diaduk rata. Pada APDA jadi ini juga ditambah asam tartarat.

9. Potato Dextrose Agar (PDA)PDA digunakan untuk menumbuhkan atau mengidentifikasi yeast dan kapang dalam suatu sampel atau produk makanan. PDA mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup yaitu terdiri dari 20% ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Cara membuat PDA adalah mensuspensikan 39 g media dalam 1 liter air yang telah sidestilasi, campur dan panaskan serta aduk. Didihkan selama 1 menit untuk melarutkan secara sempurna. Sterilsasi pada suhu 1210C selama 15 menit. Diinginkan hingga suhu 40-450C dan tuang dalam cawan petri denga pH akhir 5,6+0,2

10. VRBA (Violet Red Bile Agar)VRBA dapat digunakan untuk perhitungan kelompok bakteri Enterobactericeae. Agar VRBA mengandung violet Kristal yang bersifat basa, sedangkan sel mikroba bersifat asam. Bila kondisi terlalu basa maka sel akan mati. Dengan VRBA dapr dihitung jumlah bakteri E.coli. Bahan – bahan yang dibutuhkan untuk membuat VRBA dapat dihitung jumlah bakteri E.coli. Bahan – bahan yang dibutuhkan untuk membuat VRBA adalah yeast ekstrak, pepton,NaC1, empedu, glukosa, neutral red, Kristal violet, agar). Bahan – bahan tersebut kemudian dicampur dengan 1 liter air yang telah didestilasi. Panaskan hingga mendidih sampai larut sempurna. Dinginkan hingga 50-600C. Pindahkan dalam tabung sesuai kebutuhan, pH akhir adalah 7,4. Campuran garam bile dan Kristal violet menghambat bakteri gram positif. Yeast ekstrak menyediakan vitamin B-kompleks yang mendukung pertumbuhan bakteri. Laktosa merupakan sumber karbohidrat, Neutral red sebagai indicator pH, Agar merupakan agen pemadat.

11. PGYAMedia ini berfungsi untuk isolasi, enumerasi, dan menumbuhkan sel khamir. Dengan adanya dekstrosa yang terkandung media ini, PGYA dapa diunakan untuk mengidentifikasi mikroba terutama sel khamir. Untuk membuatnya, emua bahan dicampur dengan ditambagh CaCO3 terlebih dahulu sebanyak 0,5g lalu dilarutkan dengan akuades. Kemudian dimasukan dalam Erlenmeyer dan disumbat dengan kapas lalu disterilasasi pada suhu 1210C selama 15 menit.

AIR TANAHAir tanah biasanya berasal dari penyerapan dari air permukaan, air hujan dan run

off. keberadaan air tanah dapat dilihat berdasarkan parameter dibawah ini :

1. Kuantitas . dikhawatirkan akan cendrung mengalami penurunan akibat pengambilan secara kontinuitas. Kadangkala kkekosongan air tanah akan digantikan dengna air laut yang disebut dengan intrusi air laut sehingga mempengaruhi kualitas air tanah

2. Kualitas. Terdiri dari air tanah dangkal dan air tanah dalam. Air tanah dangkal cendrung memiliki kualitas yang lebih jelek dibandingkan air tanah dalm karena masih memungkinkan adanya kontak sehingga terjadi kontaminasi air tanahCendrung memiliki kualitas air yang baik.- Pada saat infiltrasi terjadi penyaringan secara alamiah sehingga kandungan

bekteriologi dan logam berat relative sangat kecil- Kadar mineral yang tinggi diakibatkan adanya kontak antara air dengan batuang

yang mengandung Mg dan Ca yang mudah larut- Kesadahan tinggi

Tidak mengakibatkan waterborne disease.

Pencemaran biasanya diakibatkan oleh :- Penebangan hutan- Penambangan-

3. Kontinuitas. Perlu dikhawatirkan karena perubahan tata guna lahan yang marak terjadi beberapa tahun belakangan ini dengan merubah daerah resapan menjadi lahan yang tertutup oleh beton dan aspal akan mempengaruhi tingkat dan jumlah infiltrasi.

KANDUNGAN NITROGENNitrogen terdapat disetiap lapisan pada lingkungan. Atmosfer terdiri dari 78%

volume unsure nitrogen (N2) dan merupakan reservoir yang tidak akan habis untuk unsure penting ini. Unsur nitrogen dapat dilihat dalam bentuk ikatan kimia atau fiksasi oleh proses biokimia dengan perantara mikroorganisme. Nitrogen biologis dapat dirubah dalam bentuk anorganik melalui pembusukkan atau penguraian biomassa.

Perairan mengandung nitrogen dalam bentuk yang berbeda-beda baik organic maupun anorganik. Hasil analisis terhadap air membedakan 4 jenis nitrogen, salah satu jenisnya merupakan senyawa organic dan tiga jenis lainnya merupakan senyawa anorganik (ammonium, nitrit dan nitrat). Total dari seluruh senyawa ini disebut total nitrogen (TN)- Total nitrogen

Total nitrogen sangat mungkin ditentukan dengan menggunakan metode analisis khusus, yang sama dengan metode untuk menentukan TOC yaitu dengan pemanansan pada temperature tinggi. Dengan prosedur ini seluruh senyawa nitrogen ditransfer ke dalam bentuk NO dan dideteksi dengan spektroskopi inframerah atau dengan prosedur yang lain- Nitrogen organic

Metode standar untuk menetukan nitrogen organic adalah dengan prosedur Kjehdahl, namun prosedur ini sangat rumit dan membutuhkan waktu yaitu sekitar 6 jam. Prosedur ini terdiri atas beberapa langkah. Pada prosedur ini seluruh senyawa organic dirumah

dalam bentuk ammonium dengan menggunakan campuran asam sulfur, merkuri sulfat dan potassium sulfat. Selanjutnya ammonium dan bentukan yang baru didestilasi dengan penambahna NaOH ke dalam larutan asam borat. Kdar ammonium diketahui dengan cara titrasi menggunakan asam sulfur 0,02 N- AmmoniumAmmonium dan ammonia bebas berada dalam air yang bergantung pada pH. Metode pengukuran standar pada keduanya sama yaitu dengan pembentukkan warna indofenol biru. Deteksi dilakukan dengan metode spektrofotometri.- NitritKadar nitrit ditentukan denga pembentukan warna melalui penambahan reagen tertentu. Metode standar dilakukan dengan cara penambahan reagen tertentu. Meted standar dilakukan dengan menggunakan asam sulfanilat dan naftilamin hidrokhlorida dan akan terbentuk warna pink. Konsentrasi warna ditentukan dengna metode spektrofotometri. - NitratNitrat membentuk warna kuning dengan penambahan fenol pada asam sulfur pekat. Konsentrasi larutan kuning ditentukan dengan metode spektrofotometri.

4. ALAT DAN BAHAN4.1 Peralatan- Pembakar spiritus- Spreader / dirigalsky / batang L- 5 buah pipet volum- 6 buah cawan petri dilengkapi dengan medium agar- 2 buah tabung reaksi yang telah berisi 9ml aquades- Botol pendingin- inkubator4.2 Bahan- Sampel air (air tanah 1)- Alcohol 70%- Aquades

5. PROSEDUR PRAKTIKUM- Pengenceran dari mikroba dibuat dengan pengenceran 10-1 dan10-2 menggunakan

aquades steril atau sesuai dengan kebutuhan.- Inokulasi (pindahkan) sampel yang telah diencerkan dengan menggunakan metode

tuang (pour plate) masin-masing pada 3 cawan petri untuk setiap pengenceran (jumlah suspense yang inokulasikan bergantung pada kepekatan suspense yang ada).

- Inkubasikan cawan petri yang telah diinokulasikan pada temperature 30°C, selama 24 – 48 jam.

- Amati dan hitung jumlah koloni yang tumbuh dari setiap pengenceran. Pilih cawan petri ayng memenuhi persyaratan untuk penghitungan TPC. Tentukan jumlah mikroba per-ml sampel.

Bagan hasil pengamatan TPC kelompok 1Tingkat Pengenceran Jumlah Koloni Mikroba

Tiap Seri/Cawan (CPU/Plate)

Rata-rata Jumlah Koloni Tiap Pengenceran (CPU/Plate)

Tanpa pengenceran 1. 312. >300

31

10-1 1. 103 134,5

2. 16610-2 1. >300

2. 132132

Perhitungan jumlah mikroba

CFU/ml = CFU perplate x faktor pengenceran

volumeinokulasi(mL )

Dimana :

Factor pengenceran = 1

tingkat pengenceran

Pada pengenceran 10-1

Petri 1

CFU/ml = CFU perplate x faktor pengenceran

volumeinokulasi(mL )

= 103 x 1

0,1 x 10−1= 10300 CFU/ml

Petri 2

CFU/ml = CFU perplate x faktor pengenceran

volumeinokulasi(mL )

= 166 x 1

0,1 x 10−1= 16600 CFU/ml

Rata-rata jumlah bakteri pada pengenceran 10-1 adalah 1345 CFU/ml

Pada pengenceran 10-2

Petri 1 jumlah koloni lebih dari 300

Petri 2

CFU/ml = CFU perplate x faktor pengenceran

volumeinokulasi(mL )

= 132 x1

0,1 x 10−2= 132000 CFU/ml

Bagan hasil pengamatan TPC kelompok 1Tingkat Pengenceran Jumlah Koloni Mikroba

Tiap Seri/Cawan (CPU/Plate)

Rata-rata Jumlah Koloni Tiap Pengenceran (CPU/Plate)

Tanpa pengenceran 3. 244. >300

24

10-1 3. 104. 10

10

10-2 3. 55 31

4. 7

Perhitungan jumlah mikroba

CFU/ml = CFU perplate x faktor pengenceran

volumeinokulasi(mL )

Dimana :

Factor pengenceran = 1

tingkat pengenceran

Pada pengenceran 10-1

Petri 1

CFU/ml = CFU perplate x faktor pengenceran

volumeinokulasi(mL )

= 10 x 1

0,1 x 10−1= 1000 CFU/ml

Petri 2

CFU/ml = CFU perplate x faktor pengenceran

volumeinokulasi(mL )

= 10 x 1

0,1 x 10−1= 1000 CFU/ml

Rata-rata jumlah bakteri pada pengenceran 10-1 adalah 1000 CFU/ml

Pada pengenceran 10-2

Petri 1

CFU/ml = CFU perplate x faktor pengenceran

volumeinokulasi(mL )

= 7 x 1

0,1 x 10−2= 7000 CFU/ml

Petri 2

CFU/ml = CFU perplate x faktor pengenceran

volumeinokulasi(mL )

= 55 x 1

0,1 x 10−2= 55000 CFU/ml

Rata-rata jumlah bakteri pada pengenceran 10-2 adalah 31000 CFU/ml

6. ANALISA6.1 Analisa Praktikum

Praktikum diakukan selama 2 hari berturut-turut. Pada hari pertama dilakukan persiapan peralatan yang terdiri dari 6buah cawan petri yang telah dilengkapi dengan

medium padat, 2buah tabung reaksi yang telah berisi 9ml aquades, 5 buah pipet volum yang dilengkapi yang ditutupi dengan kertas agar tetap menjaga kesterilannya, botol pendingin, spreader, pembakar spritus serta incubator yang digunakan sebagai media inkubasi selama 1-2 kali 24 jam. Sedangkan bahan terdiri dari sampel air yang diuji berupa air tanah 1, alcohol 70% yang disemprotkan pada praktikan agar menjaga kondisi pada saat pengerjaan agar tetap berlangsung dalam keadaan steril.

Langkah selanjutnya berupa pengambila sampel air tanah yang ada pada botol dipindahkan dengan bantuan pipet volume sebanyak 1ml kedalam tabung reaksi. Usahakan pada saat pembukaan, pemindahan sampel serta penutupan tabung reaksi agar tetap berada didekat api agar menghindari masuknya partikulat yang membawa bakteri masuk melalui medium udara. Lakukan pengocokan agar antara sampel dan aaquades didalam tabung reaksi dapat homogen. Pemindahan sampel pada tabung reaksi pertama disebut pengenceran 10-1.

Tahap berikutnya sampel pada tabung reaksi 1 diambil sebanyak 1ml dipindahkan kembali ke dalam tabung reaksi 2 sehingga terjadi pengeceran 10 -2. Usahakan pemindahan terjadi pada kondisi yang steril terhindar dari masukknya bakteri dari luar. Aduk hingga merata.

Pindahkan sampel pada setiap pengenceran dan sampel yang belum diencerkan masing-masing ke dalam cawan petri sebayak 2 buah. Pindahkan sampel air tanah sebelum diencerkan sebanyak 1ml ke dalam cawan petri. Cawan petri yagn tertutup usahakan untuk tetap berada di dekat api untuk menghindari masukknya bakteri melalui udara. Setelah dipindahkan, panaskan spreader dan lakukan perataan sampel pada permukaan agar . usahakan proses ini jangan sampai merusak media agarnya, karena akan mempengaruhi hasil penghitungan koloni mikroba. Kerusakan pada media biasanya diakibatkan oleh cara spreader yang tidak benar (menyentuh kuat permukaan media agar) serta kualitas dari agar yang jelek (sangat tipis). Lakukan cara yang sama terhadap sampel 10-1 dan 10-2 sebanyak 2kali pada setiap pengenceran.

Selanjutnya cawan petri yang telah terisi oleh sampel dengan berbagai pengenceran dimasukkan ke dalam incubator untuk di inkubasi selama 24-48 jam. Setelah di inkubasi selama waktu yang ditentukan, lakukan penghitungan jumlah bakteri dengan menggunakan bantuan spidol sebagai penanda penghitungan.

6.2 Analisa Hasilberdasarkan praktikum didapatkan hasil praktikum kelompok 1 sebagai berikut :

Tingkat Pengenceran Jumlah Koloni Mikroba Tiap Seri/Cawan (CPU/Plate)

Rata-rata Jumlah Koloni Tiap Pengenceran (CPU/Plate)

Tanpa pengenceran 5. 316. >300

31

10-1 5. 1036. 166

134,5

10-2 5. >3006. 132

132

Dari hasi praktikum pada table diatas tidak memperlihatkan kecendrungan pengurangan atau penambahan bakteri berdasarkan setiap pengenceran. Hasil yang didapatkan juga acak. Berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan oleh Gobel seharusnya pada setiap angka pengenceran yang semakin tinggi akan memperkecil jumlah bakteri yang akan terhitun. Sesuai dengan tujuan dari pengenceran yaitu untuk memperkecil jumlah mikroba yang dapat dihitung sehingga termasuk dalam range 30-

300. Rentang ini ditentukan berdasarkan hasil penelitian mengenai batasan kemampuan manusia untuk melakkan penghitungan lebih dari 300. Jumlah mikroba yang sangat banyak, berkoloni/kelompok dan sangat kecil mempengaruhi hasil pembacaan.

Sedangkan dari data hasil praktikum didapatkan bahwa semakin tinggi pengenceran maka jumlah bakteri yang terhitung semakin banyak. Berbeda dengan teori yang seharusnya. Pada penghitungan bakteri tanpa pengenceran didapatkan jumlah rata-rata bakteri adalah 31 koloni. Dengan penghitungan sebanyak 31 pada petri pertama dan >300 pada petri kedua (too numerous to count). Hasil rata-rata tanpa pengenceran ini jauh lebih kecil jika dibandingkan dengan pengenceran 10-1 yang berjumlah 134,5 koloni dan pengenceran 10-2 sebanyak 132 koloni. Kesalah ini dapat terjadi karena pada sampel tanpa pengenceran didapatkan adanya koloni bakteri yang sangat besar hampir menutipi setengah dari luas permukaan cawan petri.

Sedangkan berdasarkan praktikum didapatkan hasil praktikum kelompok 2 sebagai berikut :

Tingkat Pengenceran Jumlah Koloni Mikroba Tiap Seri/Cawan (CPU/Plate)

Rata-rata Jumlah Koloni Tiap Pengenceran (CPU/Plate)

Tanpa pengenceran 247. >300

24

10-1 7. 108. 10

10

10-2 7. 558. 7

31

Berdasarkan table hasil praktikum kelompok 2 ini dengan menggunakan contoh sampel yang sama terlihat adanya kecendrungan penurunan jumlah mikroba ketika dilakukan pegenceran sebanyak 10-1. Hal ini sudah sesuai dengan tori Gobel yang mengatakan semakin besar angka pengenceran maka akan semakin kecil jumlah mikroorganisme yang dapat dihitung. Sedangkan ketika dilakukan pengenceran sebanyak 10-2 jumlah koloni bakteri malah mengalami penambahan dari rata-rata 10 koloni menjadi 31 koloni pada pegenceran 10-2.

Terdapat perbedaan antara kedua hasil praktikumdengan menggunakan sampel yang sama. Perbedaan ini dapat dikarenakan sampel yang diambil kedua kelompok tidak representative sehingga tidak memcerminkan keadaan dari samper secara keseluruhan.

Sebaiknya untuk jenis sampel seperti ini dilakukan pengenceran dengan angka yang lebih besar lagi sehingga jumlah mikroba yang terhitung dapat memenuhi persyaratan penghitungan 30-300 koloni. Cara penghitungan yang dilkukan sudah sesuai dengan metode penghitungan yang seharusnya yaitu :- Satu koloni dihitung satu koloni- Dua koloni yang bertumpuk dan sulit untuk dilihat terpisah dihitung Satu- Beberapa koloni yang berhubungan dihitung satu koloni- Dua koloni yang berhimpitan tetapi masih dapat dipisahkan dihitung dua koloni- Koloni yang ukurannya menutipi lebih dari setengah cawan petri maka tidak dapat

dihitung- Koloni yang besarnya kurang dari setengah cawan dihitung 1 koloni

Dari percobaan kita mengetahui jenis dari media yang digunakan yaitu agar nutrient. Medium ini merupakan tipe medium yang cocok untuk pengujian pada sampel air. Medium ini merupakan jenis medium yang tidak selektif sehingga jenis mikroba yang hidup didalamnya sulit untuk ditentukan.

Dari hasil praktikum ini kita dapat mengetahui mikroba yang ada perairan. Hasil ini dapat menentukan jumlah kebutuhan oksigen yang ada pada perairan. Dengan data tersebut dapat membantu seorang engineer untuk menetukan jenis pengolahan air yang tepat. Kebutuhan oksigen digunakan oleh bakteri aerob untuk respirasi. Semakin banyak jumlah bakteri aerob pada perairan maka akan berpengaruh terhadap jumlah pasokan oksigen di perairan yang berkurang. Selain itu juga mempengaruhi kelangsungan hidup hewan perairan lainya. Semakin rendah nilai oksigen terlarut maka semakin tinggi nilai BOD yang digunakan oleh mikroba sebagai substratnya.

Bakteri biasanya dimanfaatkan pada unit pengolahan air untuk secondary treatment dengan pengolahan secara biologis. Seperti pada pengolahan dengan menggunakan lumpur aktif. Suplai oksigen bakteri didapatkan pada unit aerasi sehingga bakteri dapat tumbuh dalam biakannya pada unit proses pengolahan tersebut. Fungsi bakteri pada unit pengolahan secar biologi ini adalah untuk megnhilangkan atau mengubah zat-zat organic yang berbahaya. Contohnya pada proses nitrifikasi yang merubah senyawa organic dalam bentuk ammonium, nitrit dan nitrat menjadi protein secar oksidasi.

Tujuan dari unit pengolahan secar biologi adalah :- Mengubah zat organic yang berbahaya - Menghilangkan atau membersihkan Carbonaceous Biochemical Oxygen

Demand (CBOD, nitrifikasi, denitrifikasi, stabilisasi dan menghilangkan fosfor. - Menggunakan kembali senyawa organic yang masih dibutuhkanDalam proses pengolahan secara biologis senyaa organic diubah oleh bakteri

menjadi bentuk lumpur. Yang nantinya memiliki masa jenis yang berat sehingga dapat mengendap.

Jumlah bakteri terutama yang bersifat pathogen nantinya akan dihilangkan pada unit disinfektan. Walaupun secara spesifik pengujian dengan Total Plate Count (TPC) ini tidak secara langsung mengindtifikasikan jenis dari mikroba, tetapi sedikit menggambarkan jenisnya berdasarkan pemilihan media yang digunakan. Beberapa jenis mikroba tidak dapat hidup pada media dengan kandungan kimiawi tertentu. Dari kesimpulan tersebut kita dapat memilih jenis disinfektan dan dosis yang paling efektif untuk membunuh bakteri pathogen.

Berdasarkan hasil percobaan, adanya kandungan mikroorganisme pada air tanah dapat berasal dari bakteri nitrifikasi yang mengubah nitrogen organic menjadi nitrogen anorganik melalui proses nitrifikasi.

6.3 Analisa KesalahanBerikut ini adalah beberapa penyebabkan ketidakakuratan hasil praktikum, yaitu :

- Kesalah dalam melakukan spreader yang terlalu keras menyentuh permukaan medium agar mengakibatkan medium agar menjadi rusak

- Spreader yang tidak merata pada permukaan medium sehingga menimbulkan banyaknya pengelompokkan koloni dalam ukuran yang besar

- Pada saat spreader cawan petri dibuka terlalu besar, sehingga mengakibatkan masukknya bakteri lain yang tidak diinginkan melalui medium udara

- Pengambilan jumlah sampel yang kurang tepat- Proses pengocokkan yang tidak hingga homogen. Sehingga memungkinkan

adanya pengelompokkan sel mikroba

- Ketidakakuratan dalam pembacaan dikarenakan jumlah mikroba yang terlalu banyak, ukuran yang sangat kecil dan berkelompok.

7. KESIMPULANkesimpulan yang didapatkan dari hasil praktikum yaitu :

- Metode enumerasi merupakan cara untuk menentukan jumlah mikroba yang ada pada sampel perairan sehingga dapat memperkirakan jenis unit pengolahan air yang sesuai

- Mengetahui hubungan antara jumlah bakteri dengan kandungan oksigen pada perairan. Semakin banyak bakteri aerobpada perairan maka kandungan oksigen dalam perairan semakin kecil. Oksigen terlarut (DO) tinggi maka BOD akan rendah, begi sebaliknya.

- Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Gobel tahun 2008, semakin tinggi angka pengenceran maka akan semakin sedikit jumlah bakteriyang dapat dihitung.

- Medium digunakan bakteri sebagai sumber nutrient sehingga dapat membantu proses pengidentifikasian jenis bakteri. Jenis medium berdasarkan kandungan nutrisinya terdiri dari enrichment media, diffrensial media, selectif media dan test media.

- Jenis bakteri dapat didentifikasi melalu jenis medium perkembangannya.

8. REFERENSIWilley M.joanne , Sherwood M.linda, Woolverton J. Christoper. Microbiology seventh edition. 2008 : United State

Modul Praktikum Mikrobiologi Lingkungan. Laboratorium teknik penyehatan dan lingkungan program study teknik lingkungan. Universitas Indonesia

www.blogspot.com

www.aquaticeco.com

Food and Drug Administration Bacteriological Analitycal Manual. 8th edition 1998. Chapter 18. AOAC International.

SNI 2332.7-2009

9. LAMPIRAN