ELEKTROFORESIS

Ganies Riza Aristya

Teknik Elektroforesis adalah suatu metode pemisahan partikel (biomolekul) bermuatan di dalam media yang diberi arus atau medan listrik.Dengan teknik ini partikel bermuatan akan bergerak menuju elektroda yang memiliki muatan yang berlawananAnoda (elektroda +) menarik anion Katoda (elektroda -) menarik kation

Pemisahan memerlukan fase gerak buffer.Buffer yang biasa digunakan adalah:TBE = Tris borate EDTATAE = Tris acetate EDTATidak hanya menyediakan kondisi pH yang sesuai tetapi juga menyediakan ion untuk membantu konduktivitas

Pada kondisi ini beberapa hal yang perlu menjadi perhatian :

Suatu proses pemisahan molekul lebih baik dihentikan ketika proses tersebut belum mencapai titik kesetimbangannya.ketika medan listrik dimatikan (power supply mati) maka molekul yang telah terpisah akan menyebar lagi sehingga pemisahan tidak stabil. untuk itu pemisahan tidak dilakukan di dalam larutan akan tetapi menggunakan suatu matrixmatrix akan menahan sampel tidak menyebar lagi dan memberikan frictional efect yang berpengaruh terhadap kecepatan migrasi sampel

fase diam / matrix yang biasa digunakan adalah gel.Macam gel yang biasa digunakan dalam elektroforesispoliakrilamidagarosa Perambatannya:Vertikalhorizontal

ad. 1 poliakrilamid (Raymond and Weintraub, 1959)

ukuran pori-pori dapat dibuat bervariasi untuk memberikan efek penyaringan biasa digunakan untuk memisahkan proteinkonsentrasi yang biasa digunakan : 3.5 -20% dapat memisahkan molekul sebesar 5 200 kdlebih fleksibel dan memberikan hasil pemisahan yang lebih tajamlebih sulit disiapkan karena O2 menghambat polimerasinya.

ad. 2 agarosa

diperoleh dari ekstraksi rumput lautbersifat mudah patah dan mudah hancur mempunyai pori yang besar (lbh besar dr akriplamid)digunakan untuk memisahkan molekul yang besar 200-50000 bppenyiapan lebih mudah dibanding dgn polikrilamid, tetapi resolusinya lebih rendah hasil pemisahan kurang tajam konsentrasi yang digunakan berkisar 0.5 2%

Faktor yg mempengaruhi kecepatan migrasi elektroforesis :

Kekuatan medan listrik ( berbanding lurus dengan kecepatan migrasi)

Muatan ionik dari molekul yang dipisahkan (berbanding lurus dengan kecepatan migrasi)

koefisien gesekan/hambatan dari matrik penyangga (berbanding terbalik dengan tftkecepatan migrasi)

ukuran molekul yang dipisahkan

bentuk molekul yang dipisahkan

(Stryer, 2005)

Konsentrasi gel harus disesuaikan dengan ukuran sampel yang akan dipisahkan.

The velocity of migration (v) of a protein (or any molecule) in an electric field depends on :the electric field strength (E), the net charge on the protein (z),the frictional coefficient (f).

The frictional coefficient f depends on :both the mass and shape of the migrating molecule and the viscosity ( h ) of the medium.For a sphere of radius r,

SDS-PAGEPemisahan protein berdasarkan massa dan muatan keseluruhan protein tsbt

untuk penentuan BM protein protein harus mempunyai muatan yang sama digunakan SDS = sodium dodecyl sulfate / laurel sulfate

SDS terikat pada protein dgn ikatan hidrofobik sesuai dgn ukuran (besar kecilnya) molekul protein tersebut

SDS akan memberi muatan negative pada semua kondisi pH kecuali pada kondisi yg sangat asam

karena itu rasio antara berat molekul dgn muatan menjadi konstan protein migrasi sesuai dengan massanya menuju anoda Dapat dibedakan massa dari protein tersebut

Protein dalam kondisi terdenaturasi

Ketika kita memisahkan sampel dengan gel elektroforesis tidak tahu kapan berhenti perlu penanda untuk mengetahui kapan harus menghentikan elektroforesisnya.

Pewarna molekul kecil, dapat menyerap sinar tampak, mempunyai muatan yang sama dengan sampel yang dipisahkan. migrasi lebih cepat dari sampel bromphenol blueVisualisasi hasil pemisahan elektroforesisUntuk DNA dan RNA ethidium bromide silver stainingUntuk protein Coomassie Brilliant Blue