Panjang primer yang umum digunakanberkisar 20-30 basa (Saiki 1989).

Elektroforesis Gel Agarosa untuk AnalisisFragmen

Elektroforesis merupakanpergerakan zat bermuatan listrik akibatadanya pengaruh medan listrik. MolekulDNA termasuk senyawa bermuatan negatif.Sifat ini menjadikan molekul DNA yangditempatkan pada medan listrik akanbermigrasi menuju kutub positif. Kecepatanmigrasi molekul DNA tergantung padakonsentrasi gel yang digunakan, ukuranmolekul yang dianalisis, serta teganganlistrik yang diberikan. Salah satu gel yangdapat digunakan pada elektroforesis adalahgel agarosa. Agarosa digunakan untukmemisahkan, mengidentifikasi, danmemurnikan fragmen-fragmen DNA(Sambrook et al.1989).

Mobilitas fragmen DNA pada gelelektroforesis sangat dipengaruhi olehkomposisi dan kelarutan ion bufferelektroforesis. Jika konsentrasi ion-ionsangat sedikit maka konduktifitas listriksangat kecil dan migrasi DNA menjadilambat. Konsentrasi ion yang berlebih akanmengakibatkan gel mencair dan DNAterdenaturasi. Selain buffer elektroforesis,teknik elektroforesis DNA juga memerlukanloading buffer. Buffer ini berfungsimeningkatkan densitas sampel sehinggafragmen tersebut berada di dasar well dantidak menyebar. Fungsi lainnya adalahmemberi warna pada fragmen DNAsehingga mempermudah pengamatan proseselektroforesis. Buffer ini dapat jugamembantu pergerakan sampel ke anoda.Ukuran fragmen DNA hasil pemotongandengan endonuklease restriksi dapatditentukan dengan memakai penanda DNA(marker). Penanda DNA adalah fragmenDNA yang telah diketahui ukurannya(Sambrook et al.1989).

BAHAN DAN METODE

Alat dan BahanAlat-alat yang digunakan pada

penelitian ini adalah tabung mikro 500 µL,pipet mikro, alumunium foil, parafilm,sarung tangan, cawan petri, Erlenmeyer,gelas piala, sudip, peralatan elektroforesis,gel doc, sentrifus, ose, stirer, laminar airflow cabinet, inkubator bergoyang, autoklaf,penangas air, mesin PCR, penangas airbergoyang, dan lemari es.

Bahan-bahan yang digunakanadalah E. coli galur XL1-Blue, gen stilbenasintase, plasmid pGEM-T Easy, pCAMBIA1303, Agrobacterium tumefacians galurAGL-0, enzim restriksi Nco1 dan Spe1, kitelusi dari Invitrogen, kit ligasi dari promega,kit isolasi plasmid dari Roche, kit elusi dariQiagen, es batu, TBE 0.5x, EtBr, loadingdye, marker 1 Kb plus, media luria bertani(LB) yang terdiri atas tripton, ekstrak kamirdan NaCl, media luria bertani agar (LA)yang terdiri atas tripton, ekstrak kamir, NaCldan agar , KOH 10 N, HCl 5M, bufer ligasi,T4 ligase, glukosa, Ampisilin 100 mg/L,IPTG 0.1 mM, X-Gal 40 mg/L, kanamisin100000 mg/L, rifampisin 25000 mg/L,EDTA, dNTP, primer M13 F, primer M13R, Taq polimerase, MW, Mg2+ dan buffer.

Metode Penelitian

Purifikasi Produk PCR (Stilbena Sintase)Penelitian ini dimulai dari

purifikasi terhadap produk PCR yangdidapatkan. Purifikasi ini menggunakan highpure plasmid isolation kit dari Invitrogen.Fragmen dipotong dari gel menggunakanpisau skalpel, kemudian ditimbang dandilarutkan dengan buffer GS1. Penimbangandilakukan untuk menentukan banyaknyabuffer GS1 yang harus ditambahkan.Perbandingan antara sampel dan buffer GS1adalah 1:3. Selanjutnya, campurandiinkubasi pada suhu 50 oC selama 15 menit,setiap 3 menit larutan dikocok denganmembolak-balikan tabung secara perlahandan setelah larut campuran dikocok setiap 5menit. Larutan kemudian ditransfer kedalam kolom, lalu disentrifugasi dengankecepatan 12000 rpm selama 2 menit padasuhu 25oC.

Tahap selanjutnya adalah sebanyak500 µL buffer GS1 ditambahkan ke dalamkolom dan diinkubasi selama 1 menit,kemudian disentrifugasi dengan kecepatan12000 rpm selama 2 menit. Sampel yangberada di dalam kolom kemudian ditambahdengan 700 µL W9 dan diinkubasi selama 5menit, sampel selanjutnya disentrifugasikembali dengan kecepatan 12000 rpmselama 2 menit untuk menghilangkan sisaetanol. Setelah itu, 30 µL buffer TE yangsudah dipanaskan (65-70oC) dimasukkan kedalam sampel, kemudian diinkubasi selama1 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan12000 rpm selama 3 menit. Hasil purifikasikemudian diuji dengan elektroforesis gelagarosa 1% sebanyak 2 µL.

Kloning Gen Stilbena Sintase (STS) kedalam Plasmid pGEM-T Easy

Kloning gen diawali dengan ligasigen STS dengan pGEM-T Easy. Ligasidilakukan dengan menggunakan kit dariPromega. Sebanyak 5 µL buffer ligasedicampurkan dengan 0.5 µL plasmid pGEM-T Easy , 1 µL T4 Ligase dan 3.5 µL genstilbena sintase. Kemudian campurandiinkubasi pada suhu 25 oC selama 1 jamatau pada suhu 4 oC selama satu malam.Hasil ligasi selanjutnya ditransformasikan keE.coli XL1-Blue

Transformasi gen hasil ligasi kebakteri E.coli XL1-Blue menggunakanmetode heat shock. Sebanyak 10 µL hasilligasi dimasukkan ke dalam 200 µL selkompeten dan dikocok perlahan sampaicampuran merata. Selanjutnya, campurandiinkubasi di dalam es selama 30 menit,kemudian diinkubasi pada suhu 42 oCselama 50 detik. Tabung yang telahdiinkubasi pada suhu 42 oC kemudiandiinkubasi di dalam es selama 10 menit.Larutan kemudian ditambah dengan 800 µLLB glukosa dan dikocok menggunakaninkubator bergoyang dengan kecepatan 150rpm pada suhu 37 oC selama 90 menit.Selanjutnya, larutan diambil dan disebar kemedia luria bertani agar (LA) ditambahampisilin 100 ppm, isopropil tiogalaktosida(IPTG) 0.1 mM dan X-Gal 40 mg/L.Selanjutnya dilakukan seleksi putih biruuntuk membedakan sel yang mengandungplasmid rekombinan dengan sel yang tidakmengandung plasmid rekombinan.

Konfirmasi Koloni Transforman yangMembawa Fragmen Sisipan

Konfirmasi koloni transformandilakukan dengan teknik PCR koloni. PCRkoloni dilakukan menggunakan mesin PCR(Biometra T-Personal). Proses ini diawalioleh pemecahan sel dengan pemanasan 96oC selama 5 menit, kemudian suhu turunmenjadi 50 oC dan berlangsung selama 90detik, suhu naik kembali menjadi 96 oCselama 90 detik, lalu 90 detik selanjutnyapada suhu 45 oC, 1 menit pada suhu 96 oCdan 40 oC selama 1 menit. Setelahpemanasan pada proses lisis, campuran PCR(buffer, MW, dNTPs, primer universal M13F, M13 R dan Taq polimerase) ditambahkanpada setiap sampel. Proses PCR dilanjutkankembali dengan suhu 94 oC selama 30 detik,55 oC selama 1 menit, dan 2 menit pada 72oC selama 30 siklus dan selanjutnya 72 oCselama 5 menit. Hasil PCR kolonidiverifikasi pada gel agarosa. Koloni terpilih

kemudian dikultur dalam medium LB cairyang mengandung ampisilin dan diinkubasipada inkubator bergoyang suhu 37 oCdengan kecepatan 150 rpm. Selanjutnyadilakukan isolasi plasmid menggunakanHigh Pure Plasmid Isolation Kit (Roche)dari kultur bakteri yang tumbuh. Hasilisolasi plasmid selanjutnya diverifikasikembali pada gel agarosa dan dilakukansekuensing.

Sekuensing Fragmen TerklonPengurutan basa (sekuensing)

fragmen gen terklon dilakukan di LembagaMolekuler Eijkman Jakarta menggunakanprimer universal M13 F dan M13 R. Hasilsekuen fragen selanjutnya dianalisis denganprogram bioinformatika.

Isolasi DNA PlasmidProsedur yang digunakan

mengikuti prosedur High Pure PlasmidIsolation Kit dari Roche. Isolasi DNAplasmid dilakukan terhadap koloni yangberdasarkan hasil PCR koloni diketahuimengandung plasmid terinsersi fragmenyang diinginkan. Koloni tersebut dikulturkandalam media luria bertani (LB) yangmengandung ampisilin kemudian diinkubasiselama 16 jam pada suhu 37 oC denganpengocokan 150 rpm . DNA plasmid yangdiperoleh dielektroforesis dengan gelagarosa 1% untuk melihat kemurniannya.

Sebanyak 3-4 mL kultur selEscherichia coli diransfer ke dalam tabungmikro dan disentrifugasi dengan kecepatan8000 rpm pada suhu 25 oC selama 2 menit.Pellet yang dihasilkan kemudiandiresuspensikan dengan suspension buffer250 µL dan ditambahkan lysis bufferselanjutnya diaduk 6-8 kali. Campurankemudian diinkubasi selama 5 menit padasuhu ruang dan ditambah dengan 350 µLbinding buffer dan diaduk 3-4 kali,campuran diinkubasi kembali didalam esselam 5 menit. Selanjutnya, campurandisentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpmselama 10 menit pada suhu 25 oC,supernatan kemudian ditransfer ke kolomdan disentrifugasi kembali dengan kecepatan13000 rpm selama 1 menit pada suhu 25 oC.Cairan di bawah kolom dibuang danditambah dengan 500 µL wash buffer 1.Selanjutnya, larutan disentrifugasi dengankecepatan 13000 rpm selama 1 menit padasuhu 25 oC, cairan di bawah kolom dibuangdan ditambah dengan wash buffer 2. Larutankemudian disentrifugasi dengan kecepatan

13000 rpm selama 1 menit pada suhu 25 oC,cairan di bawah kolom dibuang selanjutnyadisentrifugasi kembali. Sebanyak 30 µLelution buffer selanjutnya ditambahkan kedalam kolom dan disentrifugasi dengankecepatan 13000 rpm selama 1 menit padasuhu 25 oC, hasil purifikasi kemudian diujidengan elektroforesis gel agarosa 1%.

Pemotongan pGEM-T Easy danPemurnian Gen Stilbena Sintase

Plasmid pGEM-T Easy yangmengandung gen stilbena sintase dipotongmenggunakan enzim restriksi Spe1 danNco1. Sebanyak 49 µL DNA plasmidrekombinan dicampur dengan 7 µL dH2O, 7µL buffer 2 SpeI, 7 µL enzim SpeI dan 7 µLenzim NcoI . Campuran diinkubasi selama 1jam pada suhu 37 oC dan kemudiandielektroforesis menggunakan gel agarosa0.6%. Setelah elektroforesis selesai, geldiletakkan pada gel doc. Selanjutnyafragmen yang berukuran 1500 bp dipotongmenggunakan skalpel untuk dipurifikasi.

Kloning Gen Stilbena Sintase denganVektor Ekspresi pCAMBIA 1303

Sebelum diligasi dengan genstilbena sintase, plasmid pCAMBIA 1303dipotong terlebih dahulu dengan enzimrestriksi Spe1 dan Nco1. Pemotongan inidilakukan pada suhu 37 oC selama 1 jam.Ligasi dilakukan menggunakan T4 ligasedan buffer ligase dari Promega. Sebanyak 5µL gen stilbena sintase yang telahdipurifikasi dicampur dengan buffer ligasesebanyak 10 µL, 3 µL plasmid pCAMBIA1303 dan 2 µL T4 ligase di dalam tabungmikro 500 µL . Selanjutnya, tabung ditutupdengan parafilm, diaduk menggunakan alatspin kira-kira 1 menit, kemudian diinkubasipada suhu 4 oC selama 16 jam. Transformasi gen stilbena sintaseke dalam bakteri E.coli XL1-Bluemenggunakan metode heat shock. Sebanyak10 µL hasil ligasi dimasukkan ke dalam 200µL sel kompeten dan dikocok perlahansampai campuran merata. Selanjutnya,campuran diinkubasi di dalam es selama 30menit, kemudian diinkubasi pada suhu 42 oCselama 50 detik. Campuran kemudiandiinkubasi di dalam es selama 10 menit,ditambah dengan 800 µL LB glukosa dandikocok menggunakan inkubator bergoyangdengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 oCselama 90 menit. Selanjutnya, campurandisebar ke media LA dengan penambahan

kanamisin 25 mg/L kemudian diinkubasiselama 1 malam.

Seleksi DNA Rekombinan Setelah diinkubasi semalam, koloniyang terbentuk diambil dengan tusuk gigidan diberi nomor kemudian dimasukkan kedalam media LA untuk dibuat duplikatnyadan juga koloni tersebut dikulturkan dalammedia LB yang mengandung kanamisin 25mg/L. Selanjutnya dikocok pada kecepatan150 rpm selama 1 malam. Hasil kulturselanjutnya diisolasi menggunakan kit dariQiagen dan ditransformasikan ke dalamAgrobacterium setelah dilakukan analisisrestriksi menggunakan enzim Spe1 danNco1.

Transformasi pCAMBIA 1303-StilbenaSintase ke dalam Agrobacteriumtumefaciens

Transformasi pCAMBIA 1303-stilbena sintase ke dalam Agrobacteriumtumefaciens menggunakan metode heatshock. Sebanyak 10 µL DNA plasmidditambahkan ke dalam 500 µL sel kompetenAgrobacterium strain AGL-0. Kemudiandiinkubasi didalam es selama 15 menit.Selanjutnya, campuran diinkubasi selama 5menit di nitrogen cair lalu 5 menit pada suhu37 oC. Campuran kemudian ditambahdengan 1 mL YEP dan diinkubasi selama 3jam pada suhu 28 oC. Selanjutnya, campurandisentrifugasi 3 menit dengan kecepatan6000 rpm pada suhu 25 oC. Supernatandibuang dan 200 µL dicampur dengan pellet.Campuran kemudian disebar ke media LAyang mengandung rifampisin 50 mg/L dankanamisin 25 mg/L lalu diinkubasi padasuhu 28 oC selama 2 malam dalam keadaangelap sambil dikocok dengan kecepatan 150rpm.

Seleksi DNA RekombinanSetelah DNA rekombinan

pCAMBIA 1303-stilbena sintaseditransformasikan ke Agrobacteriumtumefaciens diinkubasi 2 malam, koloniyang terbentuk diambil dengan tusuk gigi.Kemudian koloni tersebut diberi nomor.Selanjutnya, koloni dimasukkan ke dalammedia LA untuk dibuat duplikatnya dan jugakoloni tersebut dikulturkan dalam media LByang mengandung kanamisin 25 mg/L danrifampisin 50 mg/L. Selanjutnya kolonidalam media LB diinkubasi pada suhu 28 oCsambil dikocok pada kecepatan 150 rpmselama 2 malam kemudian dilakukan isolasiplasmid.