EKSTRAKSI VANILI SECARA ENZIMATIK DARI BUAH VANILI (Vanilla planifolia ANDREWS) SEGAR

INDRIANA SATYA MINTARTI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2006

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul: Ekstraksi Vanili

Secara Enzimatik dari Buah Vanili (Vanilla planifolia Andrews) Segar adalah karya saya sendiri dengan bimbingan Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MS. dan Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono serta belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain, telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, November 2006

Indriana Satya Mintarti NIM F251034051

ABSTRAK INDRIANA SATYA MINTARTI. Ekstraksi Vanili Secara Enzimatik dari Buah Vanili (Vanilla Planifolia Andrews) Segar. Dibimbing oleh NURI ANDARWULAN dan MAGGY T. SUHARTONO. Ekstrak vanili alami biasanya diproduksi menggunakan buah vanili kering yang telah mengalami kuring karena buah vanili segar tidak memiliki aroma. Selama proses kuring yang kompleks dan panjang terjadi berbagai aktivitas enzim alami dalam buah yang meliputi degradasi dinding sel serta pembentukan flavor vanilin dari glukovanilin oleh aktifitas enzim β-glukosidase. Berdasarkan hal tersebut maka penelitian ini bertujuan untuk mengembangan metode ekstraksi vanili secara enzimatik langsung dari buah vanili (Vanilla Planifolia Andrews) segar untuk mereduksi biaya dan waktu karena glukovanilin dapat diekstrak dan secara bersamaan ditransformasi menjadi vanilin oleh kombinasi enzim yang berhubungan dengan degradasi dinding sel (selulase dan pektinase) dan hidrolisis glukovanilin (β-glukosidase). Selain itu, kadar vanilin sebagai komponen flavor utama bisa lebih tinggi dibanding ekstrak vanili kering serta persiapan sampel dengan pengeringan beku dilanjutkan penggilingan dapat mengoptimalkan kontak antara enzim dengan substrat.

Metode penelitian terdiri dari 5 tahap yaitu: (1) Karakterisasi kimia buah vanili segar dan kering, (2) Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase, (3) Ekstraksi enzimatik buah vanili segar; (a) Satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol serta (b) Dua atau tiga jenis enzim komersial dengan pelarut etanol, (4) Optimasi ekstraksi enzimatik; (a) Konsentrasi enzim serta (b) Waktu inkubasi enzim dan (5) Pengamatan terhadap kadar air, serat pangan, vanilin, glukosa dan padatan terlarut. Hasil penelitian menunjukkan bahwa vanili segar dan kering memiliki kadar air 83.50% dan 20.48%, vanilin 0.76%bk dan 1.63%bk serta serat pangan 10.17%bk dan 9.84%bk. Ekstrak vanili kering sebagai kontrol mengandung vanilin dan glukosa sebesar 3.28 dan 11.95%bk ekstrak. Suhu optimum bagi aktifitas enzim β-glukosidase adalah 500C yang menghasilkan kadar vanilin dan glukosa 16.18 dan 75.85%bk ekstrak. Untuk perlakuan dengan 1 jenis enzim komersial, kadar vanillin tertinggi dicapai dengan penambahan β-glukosidase+air+etanol yakni 15.97%bk ekstrak dan glukosa tertinggi dicapai dengan penambahan pektinase+air+etanol yakni 90.26%bk. Seluruh perlakuan dengan etanol menghasilkan kadar vanilin lebih tinggi dibanding air. Untuk perlakuan dengan 2 atau 3 jenis enzim komersial, kadar vanilin ekstrak tertinggi dicapai dengan perlakuan pektinase+β-glukosidase yakni 7.56%bk ekstrak dan glukosa 90.26%bk ekstrak. Konsentrasi optimum aktifitas enzim β-glukosidase adalah 10 unit yang menghasilkan kadar vanillin dan glukosa 15.62 dan 73.95%bk ekstrak. Sedangkan waktu inkubasi optimumnya adalah 4 jam dengan kadar vanilin 15.04%bk dan glukosa 73.86%bk ekstrak. Oleh sebab itu, ekstraksi terbaik diperoleh melalui penambahan β-glukosidase 10 unit terhadap 0.5901 g bk buah vanili segar menggunakan shaker water bath terkontrol 150 rpm pada suhu 500C selama 4 jam, yang selanjutnya ditambahkan etanol 47.5%v/v selama 30 menit. Kondisi ekstraksi ini mampu menghasilkan kadar vanilin 4.6 kali lebih tinggi dibanding metode ekstraksi konvensional yang menggunakan buah vanili kering.

EKSTRAKSI VANILI SECARA ENZIMATIK DARI BUAH VANILI (Vanilla planifolia ANDREWS) SEGAR

INDRIANA SATYA MINTARTI

Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada Program Studi Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2006

Judul Tesis : Ekstraksi Vanili Secara Enzimatik dari Buah Vanili (Vanilla planifolia Andrews) Segar

Nama : Indriana Satya Mintarti NIM : F251034051

Disetujui

Komisi Pembimbing Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MS. Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Ilmu Pangan Prof.Dr.Ir.Betty Sri Laksmi Jenie,MS. Prof.Dr.Ir.Khairil Anwar Notodiputro,MS. Tanggal Ujian: 22 November 2006 Tanggal Lulus:

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT. karena atas izin-Nya

penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul: ‘Ekstraksi Vanili Secara

Enzimatik dari Buah Vanili (Vanilla planifolia Andrews) Segar’ dengan lancar.

Penelitian ini berlangsung sejak Oktober 2005 sampai dengan Juli 2006.

Ungkapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis sampaikan bagi Ibu

Dr. Ir. Nuri Andarwulan, MS dan Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono selaku

pembimbing atas arahan dan dukungan yang begitu besar; Bapak Dr. Ir. Feri

Kusnandar, MSc. selaku penguji atas saran dan masukannya. Disamping itu,

penulis menyampaikan rasa terimakasih kepada Proyek Penelitian Ilmu

Pengetahuan Dasar (Fundamental), Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi,

Departemen Pendidikan Nasional Tahun Anggaran 2006/2007 yang telah

mensponsori penelitian, juga kepada Bapak Taufik dan Mbak Ari sebagai laboran

di SEAFAST Center, IPB, Bapak Sobirin, Bapak Rojak beserta seluruh staf

laboran Dept. Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB, Bogor yang banyak membantu

selama pengumpulan data serta Bapak Ir. Asep Rahmat MTP., Dr. Dede Zaenal

Arif, MSc. beserta staf pengajar di Jurusan Teknologi Pangan, Fakultas Teknik,

Universitas Pasundan, Bandung yang banyak memberikan saran dalam penelitian.

Penghargaan setinggi-tingginya kepada: Ayahanda dan Ibunda tercinta Drs.

Karsono Minhar (Alm.) dan Yayat Suryati, SPd., yang tidak pernah putus

mendukung penulis baik dari segi moril maupun materil untuk menuntaskan studi

hingga jenjang ini; Adindaku Indriati SW. SPd. dan suami Juniar RS., SPd. atas

doa dan motivasinya; Jerry A. sebagai teman bertukar pikiran dalam menghadapi

masa-masa sulit dalam penyelesaian studi ini; A’ Obing, Q-bo, A’ Agus, Agus H.,

Hadie, Harry, Dani, Feri, Lala., Tri, Bu Yusphi, Hons dan teman-teman sekalian

yang tidak mungkin disebut satu-persatu, atas segala bantuan dan motivasinya.

Akhir kata, atas segala kekurangan dari segi isi maupun cara penulisannya,

penulis mohon maaf. Semoga tesis ini bermanfaat bagi siapa saja yang

membacanya. Amien.

Bogor, November 2006

Penulis

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kuningan pada tanggal 22 Desember 1977 dari ayah

Drs. Karsono Minhar (Alm.) dan ibu Yayat Suryati, SPd. Penulis merupakan putri

pertama dari 2 bersaudara.

Penulis berhasil menyelesaikan pendidikan Program D3 Akademi Gizi,

Departemen Kesehatan RI, Bandung pada tahun 1999. Selanjutnya, pada tahun

yang sama penulis mengikuti pendidikan S1 di Jurusan Teknologi Pangan,

Fakultas Teknik, Universitas Pasundan, Bandung dan lulus pada tahun 2002.

Pengalaman mengajar dimulai sejak tahun 2001 hingga 2003 sebagai assisten

dosen mata kuliah Fisika Dasar I, Fisika Dasar II, Kimia Fisik dan Kimia Analitik

di Jurusan Teknologi Pangan, Universitas Pasundan, Bandung. Selain itu juga

pernah mengajar mata pelajaran Fisika sebagai tenaga honorer di SMUN I Ciniru,

Kuningan pada tahun 2000. Pada tahun 2003, kembali melanjutkan pendidikan

untuk memperdalam ilmu pangan, khususnya bidang kimia pangan di Institut

Pertanian Bogor dengan penelitian akhir atas dukungan Proyek Penelitian Ilmu

Pengetahuan Dasar (Fundamental), Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi,

Departemen Pendidikan Nasional Tahun Anggaran 2006/2007.

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL …………………………………………………….. ix DAFTAR GAMBAR ………………………………………………...... x DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................... xii PENDAHULUAN …………………………………………………...... 1 Latar Belakang ......……………………………………………..... 1

Perumusan Masalah ......………………………………………..... 3

Kerangka Pemikiran .......………………………………………... 4

Tujuan Penelitian ...........……………………………………….... 8

Hipotesis ......…………....……………………………………...... 8

Manfaat Penelitian ..........……...……………………………….... 9 TINJAUAN PUSTAKA ……………………………………………..... 10

Tinjauan Statistik Komoditas Vanili Di Indonesia ........................ 10

Botani, Struktur dan Senyawa Kimiawi Penyusun Buah Vanili ... 14

Prekursor dan Enzim Pembentuk Vanilin .…………………….... 17

Reaksi Enzimatik Selama Proses Kuring ………………………. 21

Ekstraksi Buah Vanili .................................................................... 22

BAHAN DAN METODE PENELITIAN ............……………………... 34

Tempat dan Waktu Penelitian …………………………………... 34

Bahan dan Alat ………………………………………………….. 34

Prosedur Penelitian …………………………………………….... 36

HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 47

Karakterisasi Kimia Buah Vanili Segar dan Kering ...................... 47

Penentuan Suhu Inkubasi Optimum Enzim β-Glukosidase ........... 50

Ekstraksi Enzimatik Buah Vanili Segar ........................................ 56

Optimasi Ekstraksi Enzimatik ....................................................... 69

KESIMPULAN DAN SARAN ……………………………………….. 74

Kesimpulan ……………………………………………………… 74

Saran …………………………………………………………….. 75

DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………. 76 LAMPIRAN ........................................................................................... 83

DAFTAR TABEL

Halaman 1 Rekapitulasi perlakuan 1 jenis enzim komersial dengan pelarut

air dan atau etanol untuk ekstraksi ................................................ 39

2 Rekapitulasi perlakuan 2 atau 3 jenis enzim komersial dengan pelarut air dan etanol untuk ekstraksi ........................................... 40

3 Data dasar buah vanili segar dan kering hasil pengeringan beku .............................................................................................. 47

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1 Reaksi hidrolisis glukovanilin oleh enzim β-glukosidase………... 6

2 Ekspor dan impor komoditas vanili di Indonesia pada tahun 1999-2003 ....................................................................................... 10

3 Bentuk ekspor dan impor komoditas vanili di Indonesia pada tahun 1999-2003 ............................................................................. 11

4 Luas areal perkebunan vanilli berdasarkan status pengusahaan di Indonesia pada tahun 1999-2003 .............................................. 12

5 Produksi vanili kering berdasarkan status pengusahaan di Indonesia pada tahun 1999-2003 .................................................... 13

6 Harga vanili segar di pasar dalam negeri pada tahun 1997-2001 .. 13

7 Bunga serta buah vanili mentah (a) dan buah vanili matang (b) .... 14

8 Buah vanili kering ……….………………………………............ 16

9 Struktur kimia vanilin ……..……………………………………... 17

10 Komposisi bagian dalam buah vanili dengan potongan melintang pembesaran 20 kali ........................................................................ 19

11 Potongan melintang buah vanili hijau dengan pembesaran 400 kali ...............…………………………………..……………. 20

12 Transformasi glukovanilin dan vanilin …………………………... 22

13 Ekstraksi vanili dengan metode perkolasi ……………………….. 24

14 Struktur selulosa …………………………………………………. 26

15 Skema tahapan dalam selulolisis …..…………….......................... 26

16 Struktur kimia pektin …..………………………………………... 29

17 Wilayah smooth homopolimer termetilasi pektin ………………... 30

18 Wilayah non-gelling hairy pektin ………..……………………… 30

19 Model induced fit Koshland ……………………………………... 32

20 Buah Vanilla planifolia Andrews segar (a) dan kering (b).............. 35

21 Diagram alir tahapan penelitian …………………………………. 36

22 Vanili kering (a) dan segar (b) hasil pengeringan beku .................. 47

23 Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase .............. 50

24 Ekstrak vanili segar yang diperoleh dengan perlakuan ekstraksi pada suhu inkubasi enzim β-glukosidase yang berbeda ................ 53

25 Kadar vanilin dan glukosa ekstrak buah vanili kering (kontrol)

dan vanili segar dengan penambahan satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol ................................................. 57

26 Ekstrak buah vanili segar dengan penambahan satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol, dari kiri ke kanan: air, air+etanol, selulase+air selulase+air+etanol, pektinase+air, pektinase+air+etanol, β-glukosidase+air, β-glukosidase+air+etanol ............................................................... 64

27 Kadar vanilin dan glukosa ekstrak buah vanili kering (kontrol) dan vanili segar dengan penambahan 2 atau 3 jenis enzim komersial dengan pelarut air+etanol .............................................. 65

28 Padatan terlarut ekstrak vanili segar, dari kiri ke kanan: selulase+ pektinase, selulase+β-glukosidase, pektinase +β-glukosidase, selulase+pektinase+β-glukosidase, β-glukosidase. 66

29 Ekstrak vanili segar dengan penambahan 2 atau 3 jenis enzim komersial dengan pelarut air+etanol, dari kiri ke kanan: selulase+pektinase, selulase+β-glukosidase, pektinase+β-glukosidase, selulase+pektinase+β-glukosidase ....... 68

30 Penentuan konsentrasi optimum enzim β-glukosidase ................. 69

30 Ekstrak vanili segar dengan konsentrasi enzim β-glukosidase yang berbeda .................................................................................. 71

32 Penentuan waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase ........... 71

33 Ekstrak vanili segar dengan waktu inkubasi enzim β-glukosidase yang berbeda .................................................................................. 73

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1 Data dasar buah vanili segar dan kering ........................................ 83

2 Kurva standar vanilin dan glukosa ………………………………. 83

3 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dalam penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase ………………………… 85

4 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dalam penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase …………………………. 86

5 Kadar vanilin ekstrak buah vanili kering dan segar dengan penambahan 1 jenis enzim komersial ……………………………. 88

6 Kadar glukosa ekstrak vanili kering dan segar dengan penambahan 1 jenis enzim komersial ……………………………. 90 7 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dengan penambahan 2 atau 3 jenis enzim komersial …………………….. 93

8 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dengan penambahan 2 atau 3 jenis enzim komersial ……………………………………... 94

9 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dalam penentuan konsentrasi optimum enzim β-glukosidase .……………………… 96

10 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dalam penentuan konsentrasi optimum enzim β-glukosidase ……………………… 98

11 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dalam penentuan waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase .………………………… 99

12 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dalam penentuan waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase …………………………. 101

1

PENDAHULUAN

LATAR BELAKANG

Vanili adalah tanaman tropis bernilai ekonomi tinggi karena merupakan

rempah termahal kedua yang diperdagangkan di dunia internasional. Harga vanili

segar rata-rata di pasar dalam negeri dari tahun 1999 sampai 2003 naik turun,

dimana pada tahun 2003 harga vanili segar melonjak tajam mencapai

Rp.301.330/kg. Sedangkan harga vanili kering pada tahun 2002 cukup tinggi

berkisar Rp.2.000.000 hingga Rp.3.000.000/kg (Deptan 2004). Informasi harga

terakhir (tahun 2006) yang diperoleh dari para petani di Kuningan dan Sumedang

adalah Rp.65.000/kg untuk vanili segar dan Rp.700.000/kg untuk vanili kering.

Berdasarkan data Biro Pusat Statistik (BPS) yang diolah Deptan (2004),

sejak tahun 2001 sampai 2003, areal terluas yang digunakan untuk tanaman vanili

terdapat di provinsi Sulawesi Utara, Sulawesi Selatan dan Nusa Tenggara Timur,

dimana mayoritas berstatus Perkebunan Rakyat (PR). Produksi vanili kering yang

mayoritas merupakan PR tersebut mengalami peningkatan, dari 1.791 ton pada

tahun 1999 menjadi 1.680 ton tahun 2000, 2.196 ton tahun 2001 dan 2.730 ton

tahun 2002.

Sementara itu, ekspor vanili kering dari tahun 1999 sampai tahun 2002 terus

meningkat dan berdasarkan data sementara pada tahun 2003 melonjak tajam

hingga mencapai 6.363 ton dengan nilai 19.275.000 US$. Meski demikian, nilai

ekspor vanili turun naik sesuai dengan harga yang berlaku dipasaran, dipengaruhi

oleh ketersediaan barang, besarnya permintaan serta mutu barang. Pada tahun

2003, tiga negara tujuan ekspor terbesar dalam bentuk kering utuh (whole bean)

adalah Cina, Amerika Serikat dan Jerman. Sedangkan untuk ekspor olahan vanili

kering (other vanilla) adalah Amerika Serikat, Korea dan Singapura.

Berdasarkan data dari Trade Centre of the United Nation Conference in

Trade and Development/World Trade Organization (UNCTAD/WTO) (2002),

diacu dalam Furth dan Cox (2004), Indonesia termasuk negara terbesar disamping

Madagaskar dan Uganda yang memproduksi dan mengekspor vanili sehingga

memenuhi kebutuhan pasar dunia. Walaupun demikian, Indonesia masih

mengimpor vanili dalam bentuk kering utuh dan olahan vanili kering berupa

ekstrak vanili, oleoresin, bubuk dan lain- lain, yang digunakan untuk memenuhi

2

kebutuhan dalam negeri dan sebagian lainnya diekspor kembali. Hingga saat ini,

Indonesia belum mampu memproduksi bentuk olahan vanili kering secara

maksimal sehingga permintaan dalam negeri terhadap produk-produk tersebut

masih tergantung pada negara pengimpor seperti Korea, Amerika Serikat dan

Papua New Giunea. Hal ini kemungkinan besar disebabkan vanili kering di

Indonesia masih memiliki kualitas rendah dibanding potensi sebenarnya akibat

pemanenan buah belum cukup tua serta proses kuring yang kurang sempurna.

Diketahui bahwa vanili kering Indonesia memiliki flavor woody dan burn

sehingga kualitas ekstrak vanili alami pun menjadi rendah (Zahorik, 2006).

Ekstrak vanili merupakan salah satu bentuk vanili olahan yang lebih mudah

dan luas penggunaannya. Ekstrak vanili digunakan di seluruh dunia sebagai

flavouring agent dessert, like baked goods, es krim, minuman dan custard. Selain

itu ekstrak vanili digunakan oleh industri selain pangan seperti parfum, obat-

obatan dan kosmetik (de Guzman dan Siemonsma 1999).

Permintaan yang tinggi akan ekstrak vanili menyebabkan diproduksinya

vanilin sintetik yang berasal dari eugenol (minyak cengkeh), lignin (limbah bubur

kertas) dan guaiakol (petrokimia). Meskipun ekstrak vanili alami masih digunakan

oleh industri pangan, namun jumlahnya kurang dari 1% produksi vanilin. Sisanya

sebesar 99% diperoleh melalui jalur sintetik. Hal ini disebabkan harga ekstrak

vanili alami lebih mahal (sekitar 2.75 US$/oz single fold), akibat metode

penyerbukan yang digunakan adalah penyerbukan menggunakan tangan, waktu

antara penyerbukan dan pemanenan yang panjang, serta proses kuring dan metode

ekstraksi yang lama juga kompleks (http://www.uyseg.org/greener_industry/

pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm 2005). Akan tetapi, akhir-akhir ini terjadi

kecenderungan dimana konsumen lebih menyukai ekstrak vanili alami dengan

alasan flavor yang lebih kaya dan sempurna karena adanya p-hidroksi benzaldehid

dan p-hidroksi benzil metil eter serta 130 komponen lainnya, disamping vanilin

sebagai komponen utama (98%)

(http://www.ang.kfunigraz.ac.at/~katzer/engl/Vani_pla.html 2005). Senyawa-

senyawa inilah yang mendukung terbentuknya flavor alami lembut, yang tidak

dimiliki vanilin sintetik dengan flavornya yang heavy, grassy odor dan bitter

aftertaste (Reineciuss 1994).

3

Pada level industri, ekstrak vanili alami diproses dengan metode

konvensional (maserasi atau perkolasi) selama sekitar 1 bulan menggunakan buah

yang telah melalui proses kuring karena buah vanili segar tidak memiliki aroma.

Proses kuring dimulai 1 minggu setelah panen yang terdiri dari killing, sweating

(fermenting), drying dan conditioning. Seluruh proses ini memakan waktu kurang

lebih 5 bulan hingga dihasilkan vanili kering (cured vanilla) (Deptan 2004).

Proses fermentasi yang panjang merubah beberapa glukosida menjadi glukosa,

vanilin dan kompleks flavor lainnya. Glukosida dengan jumlah tertinggi adalah

glukovanilin yang menghasilkan vanilin oleh aktifitas enzim β-glukosidase.

Berdasarkan hal-hal yang disebutkan di atas, penelitian ini dilakukan sebagai

upaya pengembangan metode ekstraksi secara enzimatik langsung dari buah vanili

segar, untuk mereduksi biaya karena harga vanili segar dan biaya produksi lebih

murah serta untuk mereduksi waktu karena glukovanilin dapat langsung diekstrak

dari buah vanili segar dan secara bersamaan ditransformasi menjadi vanilin oleh

kombinasi enzim yang berhubungan dengan degradasi dinding sel (selulase dan

pektinase komersial) dan hidrolisis glukovanilin (β-glukosidase komersial). Selain

itu, kadar vanilin yang dihasilkan pun bisa lebih tinggi dibanding ekstrak vanili

kering akibat digunakannya β-glukosidase komersial serta metode persiapan

sampel buah vanili segar dengan cara pengeringan beku dilanjutkan dengan

penggilingan menyebabkan interaksi enzim dengan substrat lebih optimum.

PERUMUSAN MASALAH

Ekstrak vanili alami yang selama ini diproduksi pada umumnya

menggunakan buah vanili kering yang telah mengalami proses kuring dengan

metode ekstraksi vanili secara maserasi atau perkolasi selama kurang lebih 1

bulan. Proses kuring sendiri membutuhkan waktu sekitar 5 bulan, yang terdiri dari

killing, sweating (fermenting), drying dan conditioning. Selama kuring terjadi

berbagai aktifitas enzim alami dalam buah vanili yang meliputi degradasi dinding

sel serta pembentukan flavor vanilin dari glukovanilin oleh aktifitas enzim β-

glukosidase. Proses kuring dan ekstraksi vanili yang kompleks dan panjang

menyebabkan harga ekstrak vanili alami begitu mahal. Sebagai alternatif

pemecahan masalah ini, maka dilakukan pengembangan metode ekstraksi secara

4

enzimatik (menggunakan enzim-enzim hidrolitik komersial) terhadap buah vanili

segar yang telah mengalami persiapan sampel dengan cara pengeringan beku

dilanjutkan dengan penggilingan.

Masalah yang diteliti adalah pengaruh penggunaan enzim selulase, pektinase

dan β-glukosidase komersial serta pelarut yakni air dan atau etanol, serta efek

sinergisme ketiga enzim komersial tersebut terhadap kadar vanilin dan glukosa

yang dihasilkan dalam ekstrak vanili dari buah vanili segar. Disamping itu,

penentuan konsentrasi, waktu dan suhu inkubasi enzim yang diperlukan hingga

kadar vanilin bebas dalam ekstrak mencapai batas optimum, merupakan tahapan-

tahapan kritis yang harus diketahui dalam pengembangan metode ekstraksi

enzimatik.

KERANGKA PEMIKIRAN

Pada level industri, ekstrak vanili alami umumnya diproses menggunakan

buah vanili kering yang telah melalui proses kuring karena buah vanili segar tidak

memiliki aroma. Proses kuring dapat dilakukan dengan beberapa cara, tapi pada

prinsipnya metode kuring yang dilakukan di Indonesia tidak jauh berbeda dengan

metode kuring klasik yang dilakukan di negara-negara lainnya seperti Madagaskar

dan Meksiko. Tahap pertama adalah killing dengan mencelupkan vanili segar ke

dalam air panas 650C selama 2-3 menit. Setelah itu dilakukan pemeraman

(sweating atau fermenting) selama 48 jam agar terjadi reaksi enzimatik dalam

buah untuk pembentukan aroma, dimana pada tahap ini β-glukosidase mengubah

glukovanilin menjadi vanilin dan glukosa. Tempat fermentasi terbuat dari peti

kayu yang dilapisi serbuk gergaji atau styrofoam untuk mempertahankan suhu 38-

400C. Tahap selanjutnya adalah pengeringan (drying) dengan sinar matahari

selama 10-20 hari dari jam 8.00-10.00, lalu dibungkus kain hitam dan dijemur

kembali jam 14.00-15.00 dan dibungkus lagi pada malam harinya. Setelah itu

dilakukan pengeringan lambat dengan suhu 28-290C dan kelembaban 80% selama

30-35 hari. Tahap terakhir adalah pemantapan aroma (conditioning) dengan

menyimpan vanili di dalam kotak kering selama 2-3 bulan (Deptan 2004).

Buah vanili segar tidak memiliki aroma karena vanilin yang merupakan

komponen flavor utama masih terikat sebagai glukosida dan harus dibebaskan

5

melalui reaksi enzimatik. Goris (1947), diacu dalam Purseglove et al. (1981),

menemukan bahwa vanili segar mengandung paling sedikit 4 glukosida yang

menghasilkan vanilin dan komponen flavor lainnya. Glukosida dengan jumlah

tertinggi adalah glukovanilin. Selanjutnya glukovanililalkohol ditemukan dalam

jumlah yang lebih sedikit, diikuti oleh glukosida dari asam protokatekuat (asam

3,4-dihidroksi benzoat).

Adanya enzim hidrolitik yang dapat memecah glukovanilin menjadi vanilin

pertama kali dicatat oleh Lecompt tahun 1913 yang didukung oleh Arana tahun

1943 yang menyatakan itu sebagai β-glukosidase. Beberapa hasil penelitian

menunjukkan bahwa prekursor flavor terutama terakumulasi dalam jaringan

plasenta di sekeliling biji, dimana biji dan dinding buah bagian luar tidak

mengandung glukovanilin (Havkin-Frenkel et al. 2004; Kuras et al. 1999, diacu

dalam Odoux et al. 2003; Odoux et al. 2003). Aktifitas enzim β-glukosidase

sendiri beberapa kali lebih tinggi dalam dinding buah bagian luar dari pada dalam

jaringan plasenta dan glandular sel rambut (Havkin-Frenkel et al. 2004). Bahkan

Arana (1943) diacu dalam Odoux et al. (2003), menyatakan bahwa β-glukosidase

terdapat dalam dinding buah bagian luar, sedangkan jaringan plasenta sama sekali

tidak mengandung aktifitas β-glukosidase. Artinya bahwa enzim dan substrat

terdapat dalam lokasi yang berbeda dalam buah, sehingga proses kuring berfungsi

memicu terjadinya difusi glukovanilin dari bagian pusat ke permukaan buah. Di

sisi lain, menurut Odoux et al. (2003), β-glukosidase terutama berlokasi dalam

lamina plasenta dan dengan jumlah yang lebih sedikit terdapat dalam papila.

Enzim dan substrat terdapat dalam jaringan yang sama, meskipun mungkin

terdapat dalam 2 bagian berbeda di dalam sel (sitoplasma dan atau periplasma

untuk β-glukosidase dan vakuola untuk glukovanilin). Hal inilah yang

menyebabkan mengapa kuring perlu dilakukan. Hidrolisis glukovanilin yang

terjadi pada tahap pematangan lambat ketika buah menjadi hitam dan pada tahap

awal kuring, dapat disebabkan adanya perubahan tonoplas sehingga membran

sitoplasma dan dinding sel bersatu. Pada Gambar 1 ditunjukkan reaksi hidrolisis

yang terjadi pada glukovanilin oleh β-glukosidase

(http://www.uyseg.org/greener_industry/ pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm 2005).

6

hidrolisis

H

CHO

cincin H O-CH3 vanilin glukosa

Gambar 1 Reaksi hidrolisis glukovanilin oleh enzim β-glukosidase

Metode ekstraksi menggunakan buah vanili kering telah banyak

dikembangkan. Dua metode yang paling banyak digunakan adalah metode

maserasi dan perkolasi. Cowley (1973), menggunakan metode perkolasi

menggunakan buah vanili kering yang diawali dengan pemotongan buah vanili

dan pencampuran gula untuk meningkatkan viskositas, membantu memperkuat

dan menahan senyawa aromatik, meningkatkan warna serta memperpanjang umur

simpan. Selanjutnya dilakukan perkolasi (sirkulasi) menggunakan campuran

etanol dan air selama 3 sampai 4 minggu. Kemudian dilakukan aging, sentrifugasi

dan filtrasi hingga diperoleh ekstrak vanili. Metode yang lebih modern adalah

maserasi yakni dengan menempatkan buah vanili kering dalam maserator yang

dilengkapi pengaduk selama 1 sampai 3 bulan dengan penambahan etanol 60%

(Purseglove et al. 1981).

Disisi lain, penggunaan buah vanili segar sebagai bahan baku pembuatan

ekstrak sebenarnya telah dilakukan oleh industri- industri besar, meski waktu yang

diperlukan untuk ekstraksi tersebut relatif lebih lama dibanding ekstrak buah

vanili kering. Tahapannya terdiri dari seleksi buah, pencucian, pengepresan,

ekstraksi, pemurnian, pencampuran (alkohol dan air) serta pengemasan ekstrak

(http://www.hyperdictionary.com 2004). Disamping itu terdapat 2 metode

pembuatan ekstrak vanili komersial yang direkomendasikan oleh industri

(http://www.uyseg.org/greener_industry/pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm 2005)

yakni maserasi dan perkolasi. Pada ekstraksi maserasi, vanili segar dipotong 1-2

cm dan direndam dalam alkohol 50% selama 1 tahun. Selanjutnya proses aging

dilakukan sampai 6 bulan sebelum ekstrak siap digunakan. Sedangkan pada

7

metode perkolasi, vanili segar yang telah dipotong diletakkan diatas alas

berlubang, kemudian direndam dengan alkohol 60%, dimana larutan alkohol

tersebut disirkulasi dan suhu dipertahankan 38-490C. Proses ekstraksi ini

berlangsung selama 2 minggu, lalu dilakukan aging selama 3-6 bulan.

Perkembangan selanjutnya dalam ekstraksi vanili segar adalah dengan

menambahkan enzim komersial. Sreenath et al. (1994), menunjukkan bahwa

penambahan enzim selulase, pektinase atau kombinasi keduanya menghasilkan

nilai perolehan kembali (recovery) 81-86%. Nilai perolehan kembali ini lebih

tinggi dibanding sampel yang tidak mengalami perlakuan enzim yakni sebesar

72%. Penemuan mengenai ekstraksi vanili segar menggunakan enzim kemudian

dipatenkan oleh Brunerie (1998) (U.S. patent 5705205). Hasil penelitiannya

menunjukkan bahwa penggunaan enzim pektinase dan hemiselulase dalam

ekstraksi vanili segar diikuti penambahan etanol 50%v/v mampu menghasilkan

kadar vanilin lebih tinggi dibanding ekstraksi tanpa penambahan enzim.

Selanjutnya Ruiz-Teran et al. (2001), melaporkan bahwa ekstraksi vanili segar

dalam 2 tahap reaksi enzimatik menggunakan Viscozyme lalu Celluclast yang

mengandung aktifitas pektinase dan selulase, diikuti penambahan etanol 47,5%v/v

menghasilkan kadar vanilin ekstrak 3.13 kali lebih tinggi dibanding ekstrak vanili

kering metode Soxhlet. Selain itu, Waliszewski et al. (2003), merekomendasikan

penelitiannya yang menggunakan enzim komersial Crystalzyme PML-MX (Valley

Reserarch Inc), Novozym 342 (Novo Nordisk) dan Zymafilt L-300 (Enmex) dengan

aktifitas selulosik tinggi di dalam etanol konsentrasi 5-12%, diikuti dengan

ekstraksi vanilin dengan etanol 60%v/v. Hasilnya menunjukkan bahwa

konsentrasi vanilin ekstrak buah vanili segar dengan Novozym, Crystalzyme dan

Zymafilt adalah lebih tinggi dibanding ekstraksi tanpa penambahan enzim.

Berdasarkan uraian diatas, diketahui bahwa penggunaan metode ekstraksi

vanili secara enzimatik dari buah vanili segar memiliki prospek yang cukup baik

terutama karena perolehan kembali vanilin yang dihasilkan jauh lebih tinggi

dalam waktu relatif singkat. Dengan kata lain, penelitian ini bertujuan untuk

mengembangkan metode ekstraksi vanili dalam rangka mengatasi keterbatasan

metode ekstraksi kovensional yang begitu kompleks dan panjang. Enzim yang

digunakan dalam penelitian ini adalah enzim selulase dan pektinase komersial

8

yang mampu mendegradasi dinding sel serta β-glukosidase komersial yang dapat

menghidrolisis glukovanilin. Disamping itu, dilakukan metode persiapan sampel

buah vanili segar dengan cara pengeringan beku dilanjutkan dengan penggilingan

sehingga luas permukaan bahan lebih besar yang menyebabkan interaksi enzim

dengan substrat lebih optimum. Hal ini berbeda dengan penelitian ekstraksi

enzimatik buah vanili segar lainnya, yang pada umumnya menggunakan buah

vanili segar utuh dengan suhu penyimpanan 40C sebelum percobaan dilakukan.

TUJUAN PENELITIAN

Tujuan Umum

Tujuan penelitian ini secara umum adalah untuk mendapatkan metode

ekstraksi vanili secara enzimatik dari buah vanili segar.

Tujuan Khusus

Tujuan yang lebih khusus dari penelitian ini antara lain:

1. Mengetahui karakteristik kimia buah vanili segar dan kering.

2. Menentukan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase.

3. Menentukan pengaruh penggunaan enzim selulase, pektinase dan β-

glukosidase komersial secara tunggal maupun kombinasi serta penggunaan

pelarut air dan atau etanol terhadap kadar vanilin dan glukosa dalam ekstrak

vanili dari buah vanili segar.

4. Menentukan konsentrasi optimum enzim terpilih yang terbaik.

5. Menentukan waktu inkubasi optimum enzim terpilih yang terbaik.

6. Mengetahui karakteristik kimia ekstrak vanili segar.

HIPOTESIS

Hipotesis dari penelitian ini adalah penambahan enzim selulase, pektinase

dan β-glukosidase komersial secara tunggal maupun kombinasi serta penambahan

pelarut air dan atau etanol akan berpengaruh terhadap kadar vanilin dan glukosa

ekstrak vanili segar. Ekstrak vanili segar yang diperoleh melalui optimasi metode

ekstraksi enzimatik memiliki kadar vanilin dan glukosa yang lebih tinggi

dibanding ekstrak buah vanili segar dan vanili kering sebagai kontrol tanpa

penambahan enzim komersial.

9

MANFAAT PENELITIAN

Penelitian ini diharapkan dapat berguna bagi:

1. Industri flavor agar mendapatkan ekstrak vanili alami dengan kadar vanilin

tinggi dan waktu ekstraksi yang singkat.

2. Pengembangan diversifikasi hasil olahan vanili disamping ekstrak, seperti

vanilla flavouring, vanilla tincture, vanilla oleoresin, vanilla-vanilin extract

and flavoring, solvent-extracted product for perfume, perfumery vanilla

tincture, vanilla absolute dan lain- lain.

10

TINJAUAN PUSTAKA

TINJAUAN STATISTIK KOMODITAS VANILI DI INDONESIA

Salah satu komoditas hasil perkebunan yang mempunyai nilai ekonomi

relatif tinggi adalah buah vanili. Trend ekspor dan impor vanili di Indonesia dari

tahun 1999 sampai dengan 2003 dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2 Ekspor dan impor komoditas vanili di Indonesia

pada tahun 1999-2003 ( BPS, diolah Deptan 2004)

Bentuk komoditas vanili yang diekspor dan diimpor dapat dikelompokkan

menjadi 2 yakni whole bean dan other vanilla. Bentuk whole bean merupakan

bentuk vanili utuh kering yang telah mengalami proses kuring. Sedangkan other

vanilla merupakan bentuk olahan vanili lainnya setelah dilakukan proses kuring,

yakni berupa ekstrak vanili, oleoresin, bubuk dan lain- lain. Adapun bentuk

komoditas vanili yang diekspor dan impor dapat dilihat pada Gambar 3.

Berdasarkan data Biro Pusat Statistik (BPS) yang diolah Deptan (2004), 3

negara tujuan ekspor Indonesia terbesar pada tahun 2002 untuk bentuk vanili utuh

kering antara lain Amerika Serikat 241.786 ton, Jerman 51.315 ton dan Hongkong

9.356 ton. Posisi ini berubah pada tahun 2003 dimana peringkat pertama

digantikan oleh Cina sebesar 6.000.000 ton, disusul Amerika Serikat 190.010 ton

dan Jerman 25.028 ton. Untuk ekspor olahan vanili, 3 negara tujuan ekspor

Indonesia terbesar pada tahun 2002 antara lain Cina sebesar 3.000.000 ton,

Malaysia 216.919 ton dan Amerika Serikat 36.539 ton. Posisi ini berubah pada

468350339

3599

6363

23058

1514

1161470

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

1999 2000 2001 2002 2003

tahun

volu

me

(ton)

ekspor impor

11

3278

213 280 412 321

6233

126 70 58 1306414 34 180

1477

385010 25 530

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

1999 2000 2001 2002 2003

tahun

volu

me

(ton

)

tahun 2003 dimana urutan pertama digantikan oleh Amerika Serikat 63.971 ton,

disusul Korea 26.030 ton dan Singapura 19.815 ton. Sedangkan data dari Cina

sendiri yang tahun sebelumnya menempati peringkat pertama sebagai negara

tujuan ekspor bentuk olahan vanili Indonesia, masih belum tercantum.

Gambar 3 Bentuk ekspor dan impor komoditas vanili di Indonesia

pada tahun 1999-2003 (BPS, diolah Deptan 2004)

Negara pengimpor terbesar pada tahun 2002 berdasarkan data Biro Pusat

Statistik (BPS) yang diolah Deptan (2004), untuk bentuk vanili utuh kering adalah

Papua New Giunea 1.476.789 ton. Pada tahun 2003, 3 negara pengimpor terbesar

adalah Papua New Giunea sebesar 53.418 ton, Amerika Serikat 8.121 ton dan

Singapura 1.050 ton. Sedangkan untuk impor olahan vanili, 3 negara pengimpor

terbesar pada tahun 2002 antara lain Timor Timur 14.804 ton, Australia 10.457

ton dan Malaysia 8.277 ton. Posisi ini berubah pada tahun 2003 dimana posisi

pertama digantikan oleh Korea 33.025 ton, disusul Amerika Serikat 16.814 ton

dan Papua New Giunea 1.148 ton. Sedangkan data dari Timor Timur sendiri yang

tahun sebelumnya menempati urutan pertama sebagai negara pengimpor, masih

belum tercantum.

Negara terbesar yang memproduksi dan mengekspor vanili, dimana

memenuhi kebutuhan pasar dunia adalah Indonesia (682 ton, 40%), Madagaskar

ekspor vanili utuh impor vanili utuh ekspor olahan vanili impor olahan vanili

12

0 0 0 0 0

15796157961462414571

15502

1261261251211280

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

1999 2000 2001 2002 2003

tahun

luas

(Ha)

(673 ton, 40%), Comoros (211 ton, 12%), dan Tonga (38 ton, 2%). Negara Asia

Tenggara lainnya yang mengekspor sejumlah kecil vanili adalah Malaysia,

Filipina, Thailand dan Singapura (de Guzman dan Siemonsma 1999). Adapun

profil luas area perkebunan vanilli berdasarkan status pengusahaan di Indonesia

dapat dilihat pada Gambar 4.

Gambar 4 Luas areal perkebunan vanilli berdasarkan status pengusahaan di Indonesia pada tahun 1999-2003 (BPS, diolah Deptan 2004)

Berdasarkan data Biro Pusat Statistik (BPS) yang diolah Deptan (2004), luas

areal tanaman vanili yang mayoritas Perkebunan Rakyat (PR) tersebut, tersebar di

berbagai provinsi di Indonesia. Sejak tahun 2001 sampai 2003 areal terluas yang

digunakan untuk tanaman vanilli terdapat di Prov. Sulawesi Utara dengan rata-rata

5877 ha, Sulawesi Selatan 2742 ha dan Nusa Tenggara Timur 2175 ha. Di

provinsi lainnya pun terdapat perkebunan vanilli milik rakyat, tapi dengan luas

yang lebih rendah, kecuali untuk Provinsi Nanggroe Aceh Darussalam, Riau,

Bangka Belitung, DKI Jakarta, Kalimantan Barat, Kalimantan Tengah, Sulawesi

Tenggara dan Irian Jaya yang sama sekali tidak memiliki perkebunan vanili

dengan status PR, Perkebunan Negara (PN) maupun Perkebunan Swasta (PS).

Adapun profil produksi vanilli kering berdasarkan status pengusahaan dapat

dilihat pada Gambar 5.

Perkebunan Rakyat Perkebunan Negara Perkebunan Swasta

13

0 0 0 0 0

1791 1680

2196

27302372

1 1 2 1 30

500

1000

1500

2000

2500

3000

1999 2000 2001 2002 2003

tahun

jum

lah

(ton)

301.33

79.8755.1254.0360.53

0

50

100

150

200

250

300

350

1997 1998 1999 2000 2001

tahun

harg

a (0

00 R

p/kg

)

Gambar 5 Produksi vanili kering berdasarkan status pengusahaan di

Indonesia pada tahun 1999-2003 (BPS, diolah Deptan 2004)

Seperti halnya harga vanili kering, harga vanili segar pun naik turun. Profil

harga vanili segar rata-rata di pasar dalam negeri dapat dilihat pada Gambar 6

(BPS, diolah Deptan 2004). Harga tahun 2000 dan 2001 yang terlihat pada

Gambar 6 adalah data daerah Provinsi Jawa Tengah. Pada awal tahun 2005 ini,

menurut informasi yang diperoleh dari para petani di Kabupaten Kuningan, Jawa

Barat, harga vanilli segar berkisar Rp.65.000/kg dan vanili kering Rp.700.000/kg.

Gambar 6 Harga vanili segar di pasar dalam negeri pada tahun 1997-2001

(BPS, diolah Deptan 2004)

Perkebunan Rakyat Perkebunan Negara Perkebunan Swasta

14

BOTANI, STRUKTUR DAN SENYAWA KIMIAWI PENYUSUN BUAH VANILI

Secara sistematik, vanili termasuk bunga monokotil famili Orchidaceae

yang merupakan famili tumbuhan bunga terbesar dengan 700 genus dan 20.000

spesies. Untuk tujuan komersial, terdapat 3 spesies yang mempunyai nilai

ekonomi tinggi yakni Vanilla planifolia Andrews, Vanilla pompana Schieda dan

Vanilla tahitensis JW Moore. Jenis vanili yang paling banyak ditemui di

Indonesia adalah Vanilla fragrans (Salibs.) Ames (syn. V. planifolia Andrews)

yang sangat terkenal bermutu tinggi dan menduduki peringkat 1 dunia karena

kadar vanilinnya yang tinggi (Deptan 2004). Buah vanili jenis V. planifolia

Andrews dapat dilihat pada Gambar 7 (http://www.uyseg.org/greener_industry/

pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm 2005; http:// www.ipa.gov.pg.com 2005).

(a) (b) Gambar 7 Bunga serta buah vanili mentah (a) dan buah vanili matang (b)

Vanili dapat tumbuh dengan baik di iklim tropis dengan curah hujan 1000-

3000 mm/tahun, suhu 200C serta kelembaban 60-80%. Tanaman vanili merupakan

tanaman hutan dan hidup di bawah naungan pohon-pohon rindang. Tanaman ini

tumbuh melekat pada pohon dengan sulur panjatnya, hingga mencapai tinggi

berpuluh-puluh meter (http://www.kpel.or.id/TTGP/komoditi/PANILI1 2005)

Tanaman vanili mulai masuk ke Pulau Jawa pada tahun 1846 oleh

Teysmann, Direktur Buitenzorg Botanic Garden (Kebun Raya Bogor). Ia

menemukan metode yang memuaskan dengan penyerbukan menggunakan tangan.

Metode ini dilakukan karena penyerbukan bunga V. planifolia Andrews alami

15

hanya dapat terjadi di Meksiko, Guatemala dan bagian lain dari Amerika Tengah,

yakni dengan lebah genus Melapona, disamping burung kolibri yang juga

diperkirakan sebagai agen penyerbukan. Metode penyerbukan menggunakan

tangan ditemukan pertama kali oleh Morren di Liege tahun 1836 dan Edmond

Albius yang menemukan metode praktis penyerbukan buatan pada tahun 1841,

dimana metode ini masih digunakan sampai sekarang (Purseglove et al. 1981).

Tanaman vanili akan berbunga setelah 2 tahun, mulai berbuah setelah 3

tahun dan mencapai hasil maksimum dalam waktu 10-12 tahun. Vanili berbunga

satu kali dalam setahun dan hanya 50 bunga dari setiap tanaman yang dapat

dilakukan penyerbukan menggunakan tangan (Heath dan Reineccius 1986).

Setelah pembuahan berhasil, buah membutuhkan waktu 6 bulan untuk mencapai

ukuran yang maksimal (6-10 inci) dan 8-9 bulan untuk matang. Masa panen vanili

di Indonesia berlangsung sekitar 2-3 bulan antara Mei sampai dengan Juli

(http://www.kpel.or.id/TTGP/komoditi/PANILI1 2005).

Buah vanili berbentuk silinder dengan panjang 10-25 cm dan diameter 5-15

mm (Purseglove et al. 1981). Secara prinsip terdapat 2 bagian dalam buah vanili

yakni dinding buah atau daerah hijau yang meliputi epidermis, ground dan

jaringan vaskular dari dinding buah. Kedua adalah bagian putih yang terdiri dari 3

plasenta parietal (tidak termasuk biji) dan 3 pita dari glandular rambut yang

berperan penting dalam biosintesis vanilin. Daerah hijau terdapat sekitar 60% dan

daerah putih serta biji masing-masing sekitar 20% dari berat buah.

Epidermis mengandung sel-sel epidermal dengan diameter yang sama.

Setiap sel epidermal mengandung suatu kristal romboidal dari kalsium oksalat dan

terikat rapat di dinding sel. Dinding buah mengandung suatu cincin yang terdiri

dari 15 bundel vaskular yang tidak bercabang, dimana masing-masing

mengandung satu untai silem terdiri dari elemen-elemen anular sampai helikal

serta retikulat dan floem dengan satu sclerotic bundle sheath.

Jaringan di luar cincin bundel vaskular terdiri dari sel-sel parenkim

berdinding tipis. Setiap dasar sel parenkim dalam dinding buah bagian luar

mengandung kloroplas dan kadang-kadang kristal romboidal kalsium oksalat.

Dinding buah bagian luar yang mengandung kantung rafid dapat melepaskan rafid

yang mengandung mucilage jika buah dipotong. Dibandingkan dengan dinding

16

buah bagian luar, jaringan dinding di samping cincin dari bundel vaskular

mengandung sel-sel lebih besar, tapi sedikit mengandung kloroplas sehingga tidak

begitu hijau.

Perkembangan buah menyebabkan rambut inter plasenta membentuk

dinding yang lunak dan suatu sitoplasma yang kompleks. Akibat ukuran, jumlah

dan lunaknya dinding, rambut dengan mudah dapat dilihat dalam potongan

melintang buah vanili sebagai 3 lustrous white band. Beberapa biji dapat tertekan

masuk ke dalam rambut dalam buah matang. Dimana sel-sel rambut tersebut

mengandung sejumlah besar lemak, yang dilepaskan ke dalam lokul dan

menyelimuti biji jika kemudian rambut tersebut matang dalam buah masak

(Havkin-Frenkel et al. 2004). Struktur buah vanili segar sebagaimana telah

dijelaskan di atas, akan berubah jika buah mengalami proses kuring (Gambar 8)

(http://wwwchem.uwimona.edu.jm:1104/lectures/vanilla.html 2005).

Gambar 8 Buah vanili kering

Vanilin merupakan komponen aroma utama yang terdapat dalam buah vanili

yakni sebesar 85% dari total senyawa volatil. Komponen lainnya adalah p-

hidroksi benzaldehid (sampai 9%) dan p-hidroksi benzil metil eter (1%).

Disamping itu, khusus untuk vanili Tahiti memiliki flavor berbeda akibat adanya

komponen tambahan yakni piperonal (heliotropin, 3,4-dioksimetilen benzaldehid)

dan diasetil (butandion) (http://www.portal.remarkablefoods.com 2005).

Selain prekursor dan enzim pembentuk flavor, buah vanili mengandung

komponen zat gizi lengkap yang meliputi protein, lemak, karbohidrat, vitamin dan

mineral. Menurut de Guzman dan Siemonsma (1999), per 100 g berat buah vanili

17

kering Vanilla planifolia Andrews, mengandung 20 g air, 3-5 g protein, 11 g

lemak, 7-9 g gula, 15-20 g serat, 5-10 g abu, 1.5-3 g vanilin, 2 g soft resin dan

asam vanilat yang tidak berflavor.

PREKURSOR DAN ENZIM PEMBENTUK VANILIN

DI DALAM BUAH VANILI

Flavor dan aroma unik vanili berasal dari senyawa fenolik vanilin (98% dari

total komponen flavor vanili) serta dari senyawa lainnya. Vanilin (4-hidroksi-3-

metoksi benzaldehid) dengan rumus kimia C8H8O3 dan berat molekul 152.14

merupakan komponen utama senyawa aromatik volatil dari buah vanili

(http://wwwchem.uwimona.edu.jm:1104/lectures/vanilla.html 2005). Struktur

kimia senyawa vanilin dapat dilihat pada Gambar 9

(http://www.uyseg.org/greener_industry/ pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm 2005).

Gambar 9 Struktur kimia vanilin

Senyawa vanilin dapat diperoleh melalui kerja enzim terhadap suatu

komponen heterosida (glukosida). Prekursor vanilin dalam buah vanili hijau

adalah koniferosida, dimana melalui reaksi oksidasi akan terpecah menjadi

vanilosida (glukovanilin) yang menghasilkan vanilin dan glukosa jika dihidrolisis

oleh enzim. Disamping itu, terdapat mekanisme alternatif dari pembentukan

vanilin dimana glukosida dari vanililalkohol dioksidasi menjadi glukovanilin.

Selanjutnya diketahui bahwa vanili hijau mengandung paling sedikit 4 glukosida

yang menghasilkan vanilin dan komponen flavor lainnya. Jumlah yang terbanyak

adalah glukovanilin, sedangkan glukovanililalkohol ditemukan dalam jumlah

yang lebih sedikit, diikuti oleh glukosida dari asam protokatekuat (asam 3,4-

dihidroksibenzoat) (Purseglove et al. 1981).

18

Setelah penyerbukan, sejumlah besar serbuk sari mendekati putik. Tabung

serbuk sari terdapat dalam 3 kelompok, dimana masing-masing berlokasi dalam

suatu kantung pada salah satu sisi dari setiap 3 plasenta, diapit oleh rambut.

Biasanya glandular rambut mulai berkembang cepat dalam wilayah antara

plasenta. Masing-masing rambut tidak bercabang dan kemudian mencapai panjang

sekitar 300 mikrometer (Gambar 10). Rambut menjadi terikat bersama-sama

selama masa pengembangan dan kemudian rusak lalu melepaskan kandungannya

ke dalam lokul. Rambut yang berkembang memiliki banyak retikulum

endoplasma, struktur ribosom dan plastida yang mengandung globula lemak dan

komponen lainnya yang menandai adanya sel-sel aktif secara metabolik. Swamy

(1947) diacu dalam Odoux et al. (2003), menunjukkan bahwa vanilin dihasilkan

dalam glandular rambut. Pendapat ini dikonfirmasi oleh Havkin-Frenkel et al.

(2004), yang membuktikan bahwa vanilin dan intermediet yang berhubungan

dalam biosintesis vanilin terakumulasi dalam jaringan putih bagian dalam (pada

buah matang), di sekeliling rambut plasenta. Dengan kata la in selama

pengembangan buah yakni sekitar 8-10 bulan, prekursor flavor terakumulasi

dalam jaringan plasenta disekeliling biji. Ditemukan juga bahwa jaringan plasenta

mengandung intermediet dari biosintesis vanilin yang meliputi asam 4-kumarat, 4-

hidroksi benzaldehid dan 3,4-dihidroksi benzaldehid.

Penemuan Kuras et al. (1999) diacu dalam Odoux et al. (2003),

menunjukkan bahwa dalam buah matang, prekursor vanilin terutama terdapat

dalam plasenta dan pada jumlah yang lebih sedikit terdapat dalam papila.

Keberadaan glukovanilin dalam bagian tengah buah yang mengelilingi biji

(plasenta dan papila) berhubungan dengan adanya pengaruh komponen fenolik

dalam germinasi biji. Hal ini didukung oleh hipotesis Swamy (1947) diacu dalam

Odoux et al. (2003), mengenai adanya pengaruh papila dalam biosintesis

prekursor aroma glikosilasi yang selanjutnya akan disekresikan ke dalam medium

di sekeliling biji. Sedangkan biji sendiri menurut Odoux et al. (2003), tidak

mengandung glukovanilin sama sekali. Beberapa hasil penelitian di atas,

mematahkan hipotesis Arana (1943) diacu dalam Odoux et al. (2003), yang

menyatakan bahwa glukovanilin terutama terdistribusi dalam dinding buah bagian

luar (60-80% dari total glukovanilin), sementara bagian pusat buah yakni jaringan

19

plasenta serta biji hanya mengandung 20-40% dari total glukovanilin. Pada

Gambar 10 ditunjukkan jaringan plasenta yang mengelilingi biji (berwarna hitam)

dan sel rambut yang merupakan daerah hijau.

korteks

sel rambut biji jaringan plasenta

Gambar 10 Komposisi bagian dalam buah vanili dengan potongan melintang pembesaran 20 kali (Havkin-Frenkel et al. 2004)

Mengenai lokasi utama enzim β-glukosidase dalam buah vanili, Havkin-

Frenkel et al. (2004), berpendapat bahwa enzim-enzim hidrolitik (β-glukosidase)

atau enzim degradatif lainnya yang mengkatalisis pelepasan komponen flavor dari

prekursor flavor, berlokasi paling banyak dalam daerah dinding buah bagian luar.

Diperkirakan bahwa aktifitas β-glukosidase beberapa kali lebih tinggi dalam

dinding buah bagian luar dari pada dalam jaringan plasenta dan glandular sel

rambut. Sedangkan Arana (1943) diacu dalam Odoux et al. (2003), menyatakan

bahwa β-glukosidase terdapat dalam dinding buah bagian luar, sedangkan

jaringan plasenta sama sekali tidak mengandung aktifitas β-glukosidase.

Mengenai vanilin yang dilepaskan selama proses kuring, ia menyimpulkan bahwa

glukovanilin berdifusi dalam air dari bagian pusat ke permukaan buah sehingga

terjadi hidrolisis.

Pada Gambar 11 ditunjukkan inter jaringan plasenta (kiri) dan sel-sel

parenkim putih dalam dinding buah (kanan). Sel-sel seperti rambut mengandung

enzim-enzim yang diperlukan dalam biosintesis vanilin. Sel-sel tersebut

melepaskan sejumlah lemak yang terlihat berbentuk globular (kiri atas).

20

globular lemak

rambut inter sel parenkim plasenta

Gambar 11 Potongan melintang buah vanili hijau dengan pembesaran 400

kali (Havkin-Frenkel et al. 2004)

Akan tetapi, pendapat Havkin-Frenkel et al. (2004) dan Arana (1943) diacu

dalam Odoux et al. (2003) tersebut, disanggah oleh Odoux et al. (2003), yang

menunjukan bahwa distribusi jaringan dari aktifitas β-glukosidase sama dengan

glukovanilin, meskipun sejumlah kecil aktifitas β-glukosidase terdeteksi dalam

bagian luar yang berdaging, dimana glukovanilin tidak terdeteksi. Enzim ini

terutama berlokasi dalam lamina plasenta dan dengan jumlah yang lebih sedikit

terdapat dalam papila. Disamping itu ditemukan pula bahwa antara enzim dan

substrat terdapat dalam jaringan yang sama, meskipun mungkin terdapat dalam 2

bagian berbeda di dalam sel (sitoplasma dan atau periplasma untuk β-glukosidase

dan vakuola untuk glukovanilin). Hal inilah yang menyebabkan mengapa vanilin

tidak dilepaskan hingga buah matang atau saat kuring. Hidrolisis glukovanilin

yang terjadi pada tahap pematangan lambat ketika buah menjadi hitam dan pada

tahap awal kuring, dapat disebabkan perubahan tonoplas sehingga membran

sitoplasma dan dinding sel bersatu.

Kandungan glukovanilin buah vanili secara bertahap meningkat seiring

dengan tingkat kematangan buah dan terdistribusi di dalam buah. Distribusi

glukovanilin berhubungan dengan perubahan warna dari hijau, kuning lalu

menjadi coklat saat matang. Jumlah glukovanilin terbanyak terdapat pada

blossom-end dan paling sedikit pada stem-end. Hal ini dibuktikan dengan

21

kenyataan bahwa kristalisasi vanilin lebih banyak terjadi pada bagian blossom-end

matang dibanding pada stem-end (Purseglove et al. 1981).

Begitu pula dengan kandungan dan aktifitas β-glukosidase yang meningkat

dengan meningkatnya kematangan buah (seiring dengan terbentuknya

glukovanilin). Pada saat buah hijau, aktifitas β-glukosidase dan kandungan vanilin

bebas dapat diabaikan. Aktifitas maksimum β-glukosidase terjadi saat fase split

blossom-end yellow dan kandungan vanilin bebas paling tinggi terdapat pada

tahap yang mengakibatkan warna buah menjadi coklat. Aktifitas β-glukosidase

sebagian tidak aktif jika buah menjadi coklat (chocolate brown) pada setengah

panjangnya, tapi dapat diaktifkan kembali selama kuring (Purseglove et al. 1981).

REAKSI ENZIMATIK SELAMA PROSES KURING

Tujuan proses kuring secara umum adalah untuk menginduksi kontak antara

prekursor flavor dengan enzim yang mengkatalisis hidrolisis senyawa prekursor

menjadi vanilin sebagai komponen flavor utama. Proses kuring ini terdiri dari 4

tahap yakni killing yang merupakan tahap pertama dari kuring dengan

menggunakan air panas (blanching), pembekuan atau dengan metode lainnya,

bertujuan untuk mencegah pertumbuhan vegetatif buah dan untuk mendegradasi

jaringan buah sehingga terjadi kontak antara substrat dengan enzim (memicu

reaksi enzimatik). Metode killing yang biasa digunakan karena kepraktisannya

adalah pencelupan dalam air panas 60-700C selama 3 menit. Tahap kedua adalah

pemeraman (sweating atau fermenting) dengan kelembaban dan suhu tinggi

(450C-650C) selama 7-10 hari. Tujuannya adalah untuk menyediakan kondisi

dengan kelembaban tinggi, untuk mengkatalisis berbagai proses hidrolisis dan

oksidasi hingga diproduksi komponen flavor secara enzimatik dan non enzimatik

(Havkin-Frenkel et al. 2004). Peningkatan suhu pada tahap ini menyebabkan

meningkatnya kerja enzim dan dapat mencegah fermentasi (kebusukan buah)

(Anandaraj et al. 2001). Pada akhir masa pemeraman, buah berwarna coklat dan

mengembangkan karakteristik flavor dan aroma vanili kering. Akan tetapi, buah

masih mengandung kadar air cukup tinggi yakni 60-70%. Untuk mencegah

kerusakan oleh mikroba dan mencegah aktifitas enzim lebih jauh, maka dilakukan

pengeringan selama 15 sampai 20 hari hingga kadar air buah mencapai 25-30%.

22

Selanjutnya dilakukan conditioning selama beberapa bulan yang bertujuan agar

dihasilkan vanili kering dengan flavor optimum. Seluruh proses kuring ini

memakan waktu sekitar 3 sampai 6 bulan atau lebih lama lagi tergantung metode

kuring yang digunakan (Havkin-Frenkel et al. 2004).

Pada tahap awal proses kuring terjadi degradasi dinding sel buah secara

enzimatik oleh enzim-enzim tertentu seperti selulase, pektinase, hemiselulase dan

lain- lain. Setelah itu diikuti oleh transformasi prekursor flavor oleh enzim β-

glukosidase yang termasuk tipe ketiga dari enzim selulase. Mekanisme

transformasi glukovanilin menjadi vanilin dapat dilihat pada Gambar 12.

β-glukosidase glukovanilin glukosa + vanilin

peroksidase polifenol oksidase pigmen stabil asam vanilat (kuinon) transformasi

nonenzimatik

aroma khas vanilin

Gambar 12 Transformasi glukovanilin dan vanilin (Purseglove et al. 1981)

Penelitian-penelitian telah banyak dilakukan untuk mengidentifikasi

komponen kimia yang membentuk flavor vanili kering, tapi sangat sedikit

penelitian yang mempublikasikan bagaimana komponen-komponen tersebut

terbentuk selama proses kuring. Proses panas, reaksi enzim dan aktifitas mikroba

adalah yang digambarkan penting dalam pembentukan flavor (Roling et al. 2001).

EKSTRAKSI BUAH VANILI

Ekstraksi Vanili Konvensional

Ekstraksi adalah metode efisien yang digunakan untuk memisahkan dan

mengkonsentrasikan suatu bahan. Ekstraksi dengan pelarut dapat memisahkan

campuran berdasarkan perbedaan kelarutan dari komponen-komponen yang

terkandung didalamnya.. Ekstraksi konvensional vanilin dapat dilakukan melalui

23

pencampuran buah vanili dengan pelarut polar seperti etanol dan air. Like

dissolves like adalah acuan untuk memilih jenis pelarut yang digunakan (Tesla

2000; http://www.ktf-split.hr/glossary/en_o.php?def=extraction 2005).

Air merupakan molekul polar yang memiliki ujung muatan negatif dan

positif sehingga molekul air dapat berinteraksi satu dengan yang lainnya. Molekul

air juga dapat berinteraksi dengan molekul polar lainnya. Polaritas dari suatu

ikatan adalah distribusi muatan listrik atom yang digabungkan melalui ikatan.

Muatan listrik pada beberapa atom yang tidak sama disebut muatan parsial dan

keberadaan muatan parsial tersebut adalah terdapat dalam suatu ikatan polar.

Sedangkan molekul non polar adalah molekul yang mengandung distribusi yang

simetris dari muatan lisrik (Tesla 2000).

Jenis pelarut lainnya yang biasa digunakan dalam ekstraksi vanili adalah

etanol. Etanol (CH3CH2OH) merupakan suatu alkohol yang mengandung gugus

hidroksil (-OH) yang terikat pada atom karbon. Titik didih etanol adalah 78.50C

dan memiliki berat jenis 0.789 g/ml pada 200C. Etanol bersifat polar yang dapat

dicampur dengan air dan pelarut organik lainnya (http://www.

scifun.chem.wisc.edu/chemweek/ethanol/ethanol.html 2005). Pelarut etanol cair

yang digunakan dalam pembuatan ekstrak vanili mampu mengekstrak senyawa

aromatik yang terdapat dalam buah vanili. Kandungan alkohol minimum adalah

35%v/v dan kandungan buah vanili adalah 1 bagian (berat) dalam 10 bagian

(volume) dari ekstrak. Di Australia kandungan alkoho l dari ekstrak vanili

bervariasi antara 50-57% (Cowley 1973).

Disisi lain, beberapa industri besar yang memproduksi ekstrak vanili

mengacu pada Food and Drug Administration (FDA) yang mengatur bahwa

ekstrak vanili alami harus mengandung alkohol minimum 35%, bahan terlarut dari

13.5 ons per galon (dengan kandungan air buah tidak lebih dari 25%) serta

mengandung bahan lainnya seperti air, gliserin, propilen glikol, gula, dekstrosa

atau sirup jagung. Spesifikasi ini menghasilkan konsentrasi single fold dan ekstrak

biasanya dibuat pada konsentrasi two (26.7 ons per galon) atau four fold

(http://www.uyseg.org/greener_industry/ pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm 2005).

Ekstrak vanili merupakan bentuk olahan vanili yang biasa digunakan

sebagai flavouring. Ekstraksi dapat dilakukan dengan metode maserasi yakni

24

merendam buah vanili dalam larutan alkohol dan air. Campuran tersebut biasanya

disimpan selama beberapa bulan untuk menghasilkan cairan coklat jernih dengan

flavor vanili yang kuat. Pemanasan campuran dapat mempercepat proses, tapi hal

ini dapat menyebabkan beberapa komponen flavor yang bersifat volatil menjadi

hilang. Beberapa industri merekomendasikan proses ekstraksi dingin yang lebih

lambat menggunakan resirkulasi pelarut (perkolasi) diatas buah untuk

meminimalkan kehilangan komponen volatil. Salah satu metode perkolasi yang

digunakan untuk ekstraksi vanili dapat dilihat pada Gambar 13

(http://www.uyseg.org/greener_industry/ pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm 2005).

irisan buah vanili pompa sirkulasi

suhu 38-490C alkohol 60%

Gambar 13 Ekstraksi vanili dengan metode perkolasi

Ekstraksi Vanili Secara Enzimatik

Meningkatnya permintaan terhadap produk-produk alami menyebabkan

proses alternatif terus dikembangkan. Pengertian alami yang digunakan di Eropa

dan Amerika Serikat adalah jika produk tersebut dihasilkan dari suatu bahan baku

alami melalui proses biologis (misalnya enzim atau whole cells) atau proses mild

(misalnya ekstraksi dan destilasi). Pada tahun-tahun terakhir, mulai dilakukan

penelitian-penelitian mengenai biosintesis ekstrak vanili murni dan vanilin alami

menggunakan mikroorganisme atau isolat enzim.

Enzim komersial yang digunakan dalam ekstraksi buah vanili segar pada

umumnya merupakan enzim-enzim hidrolase. Hal ini berdasarkan kenyataan

bahwa pada tahap awal kuring, diperkirakan mulai terjadi reaksi enzimatik yang

berhubungan dengan degradasi dinding sel buah (terutama terdiri dari

25

polisakarida, protein serta lignin) dan kemudian terjadi transformasi prekursor

vanilin menjadi vanilin oleh enzim hidrolitik. Biopolimer tersebut bergabung

bersama-sama dengan sejumlah kecil komponen lainnya seperti kelompok asetil

dan senyawa fenolik. Adapun polisakarida utama penyusun dinding sel buah

antara lain selulosa, hemiselulosa dan pektin (Aman dan Westerlund 1996).

Selulosa merupakan polisakarida linier dari residu glukosa, yang

dihubungkan oleh ikatan β-1,4. Selulosa terdiri dari daerah kristalin dan daerah

amorf (non-kristalin) yang membentuk suatu struktur dengan kekuatan tegangan

tinggi, yang pada umumnya tahan terhadap hidrolisis enzimatik terutama pada

daerah kristalin. Selulosa dapat dihidrolisis oleh kelompok enzim selulase yang

terdiri dari suatu kompleks campuran dari enzim dengan spesifisitas berbeda

dalam menghidrolisis ikatan glikosidiknya (Howard et al. 2003).

Enzim selulase terdiri dari 3 komponen besar yakni endoglukanase atau

endo-1,4-β-glukanase (EC 3.2.1.4)/Cx, ekso-1,4-β-glukanase atau

selobiohidrolase (EC 3.2.1.91)/C1 serta β-glukosidase atau selobiase (EC

3.2.1.21). Endoglukanase yang sering disebut karboksimetilselulosa (CM)-

selulase, berperan dalam memulai serangan acak pada sisi internal daerah amorf

dari serat selulosa sehingga sisi yang terbuka dapat diserang oleh selobiohidrolase.

Enzim ini dapat memutuskan ikatan selulosa secara random menghasilkan glukosa

dan selooligosakarida. Sedangkan ekso-1,4-β-glukanase atau selobiohidrolase

menyerang bagian luar non-reducing end (Gambar 14) dari selulosa dengan

selobiosa sebagai struktur utamanya (http://www.fibersource.com/f-

tutor/selulosa.htm 2005). Ekso-1,4-β-glukanase adalah komponen utama dari

sistem selulase fungi yakni sekitar 40-70% dari total protein selulase dan mampu

menghidrolisis daerah kristalin. Ekso-1,4-β-glukanase memisahkan mono- dan

dimer dari ujung rantai glukosa (Pilnik dan Voragen 1991; Howard et al. 2003).

Tipe ketiga dari enzim selulase adalah enzim β-glukosidase yang dapat

menghidrolisis dimer glukosa dan dalam beberapa kasus mengubah selo-

oligosakarida menjadi glukosa. Enzim β-glukosidase ini dapat menghidrolisis

selobiosa dan selodekstrin (Pilnik dan Voragen 1991; Howard et al. 2003). Pada

Gambar 15. dapat dilihat mekanisme kerja enzim selulase dari ketiga tipe yang

telah dijelaskan di atas (http://www.fao.org/docrep/w7241e/w7241e08.htm 2005).

26

non-reducing end reducing end

Gambar 14 Struktur selulosa

daerah kristalin daerah amorf

A. ENDO β-GLUKANASE, Cx, CMCase

B. EKSO β-GLUKANASE, C1, Avicelase

C. Cx / C1

D. β-GLUKOSIDASE

GLUKOSA

Gambar 15 Skema tahapan dalam selulolisis

27

Beberapa mikroorganisme yang menghasilkan selulase antara lain fungi

(Aspergillus niger, A. fumigatus, A. aculeatus, Acremonium cellulolyticus,

Fusarium solani, Irpex lacteus, Penicillium funmiculosum, Phanerochaete,

Chrysosporium, Schizophyllum commune, Sclerotium rolfsii, Sporotrichum

cellulophillum, Talaromyces emersonii, Thielavia terrestris, Trichoderma

koningii, T. reesii dan T. viride). Selain itu bakteri Clostridium thermocellum,

Ruminococcus albus, Streptomyces sp. serta Actinomycetes seperti Streptomyces

sp. dan Thermomonospora curvata dapat juga memproduksi enzim selulase.

Meskipun sejumlah besar mikroorganisme dapat mendegradasi selulosa, tapi

hanya sedikit yang memproduksi enzim yang dapat secara sempurna

menghidrolisis selulosa kristalin in vitro. Fungi adalah mikroorganisme utama

yang memproduksi selulase. Genus Trichoderma dan Aspergillus menghasilkan

selulase dan enzim kasar yang dihasilkan oleh mikroorganisme tersebut

diproduksi secara komersial. Mikroorganisme dari genus Trichoderma

menghasilkan sejumlah besar endo-β-glukanase dan ekso-β-glukanase, tapi hanya

sedikit menghasilkan β-glukosidase. Sedangkan Aspergillus memproduksi endo-

β-glukanase dan β-glukosidase dalam jumlah besar, tapi sedikit menghasilkan

ekso-β-glukanase (http://www.fao.org/docrep/w7241e/w7241e08.htm 2005). Pada

umumnya enzim komersial selulase dari T. viride mengandung beberapa aktifitas

enzim yang mampu mendegradasi dinding sel. Enzim kasar tersebut meliputi

selulase, pektinase, hemiselulase dan lain- lain (http://www.

serva.de/products/knowledge/061097.shtml 2005).

Disamping selulosa, komponen penyusun dinding sel lainnya adalah

hemiselulosa. Hemiselulosa merupakan polisakarida larut dalam alkali,

berhubungan dengan selulosa dalam dinding sel dan meliputi non-selulosa β-D-

glukan, senyawa pektik (poligalakturonan) dan beberapa heteropolisakarida yang

terdiri dari manosa (galaktogluko- dan glukomanan) serta silosa

(arabinoglukurono- dan glukuronosilan). Akan tetapi, hanya heteropolisakarida

yang memiliki derajat polimerisasi lebih rendah (100-200 unit) daripada selulosa

(10,000-14,000 unit) yang dianggap sebagai hemiselulosa. Komponen gula utama

dari hemiselulosa adalah D-silosa, D-manosa, D-glukosa, D-galaktosa, L-

arabinosa, asam D-glukuronat, asam 4-O-metil-D-glukuronat dan asam D-

28

galakturonat. Sedangkan komponen yang jumlahnya lebih sedikit antara lain L-

ramnosa, L-fukosa dan berbagai gula O-metil (Howard et al. 2003).

Hemiselulase seperti enzim-enzim lainnya yang menghidrolisis polisakarida

dinding sel tanaman, merupakan protein multidomain. Protein tersebut pada

umumnya mengandung modul katalitik dan non katalitik yang berbeda secara

struktur. Modul non katalitik paling penting terdiri dari daerah yang mengikat

karbohidrat, dimana memfasilitasi penargetan enzim pada polisakarida, pengikat

interdomain dan modul dokerin yang menghubungkan pengikatan daerah katalitik

melalui interaksi kohesi dokerin pada permukaan sel mikroba atau pada kompleks

enzimatik seperti selulosom (Howard et al. 2003).

Senyawa silan merupakan hemiselulosa paling banyak dan silanase adalah

salah satu hemiselulase terbesar yang menghidrolisis ikatan β-1,4 dalam rantai

silan menghasilkan silooligomer pendek dimana lebih jauh dapat dihidrolisis

menjadi unit silosa tunggal oleh β-silosidase. Silanase lainnya adalah α-D-

glukuronidase yang menghidrolisis ikatan α-1,2-glikosidik dari asam 4-O-metil-

D-glukuronik rantai samping silan. Hemiselulolitik esterase meliputi asetil

esterase yang menghidrolisis substitusi asetil pada silosa dan feruloil esterase

yang menghidrolisis ikatan ester antara substitusi arabinosa dan asam ferulik.

Feruloil esterase dapat melepaskan hemiselulosa dari lignin dan membuat produk

polisakarida bebas lebih mudah didegradasi oleh hemiselulase lainnya (Howard et

al. 2003). Makro molekul hemiselulosa merupakan suatu polimer dari pentose

(silosa dan arabinosa), heksosa (paling banyak manosa) dan sejumlah asam-asam

gula. Sedangkan selulosa merupakan polimer homogen dari glukosa yang lebih

tahan dibanding hemiselulosa karena struktur kristalinnya tinggi (Howard et al.

2003).

Enzim yang juga dapat menghidrolisis dinding sel adalah pektinase yang

digunakan dengan selulase dalam industri jus buah untuk membantu ekstraksi,

klarifikasi dan modifikasi. Enzim pektinase ini dihasilkan selama pematangan

alami buah dan bersama dengan selulase menyebabkan pelunakan dinding sel.

Enzim-enzim tersebut juga disekresikan oleh patogen tumbuhan seperti fungi

Monilinia fructigena dan bakteri soft-rot Erwinia carotovora, sebagai bagian dari

strategi mereka untuk berpenetrasi ke dalam dinding sel tumbuhan inang (Pilnik

29

dan Rombouts 1981; http://www.saps.plantsci.cam.ac.uk/osmoweb/pektinase.htm

2005).

Semua tumbuhan hijau mengandung pektin yang bersama selulosa dapat

mempengaruhi sifat struktural buah dan sayuran. Pektin terdiri dari unit-unit asam

galakturonat dan asam galakturonatmetil ester yang membentuk rantai

polisakarida linear dan secara normal diklasifikasikan berdasarkan derajat

esterifikasinya. Pektin termasuk karbohidrat koloid larut air yang terdapat dalam

buah atau sayuran matang dan dapat digunakan dalam pembuatan jeli dan jam

buah (http://www.cpkelco.com/food/pektin.html 2005). Struktur pektin dapat

dilihat pada Gambar 16 (http://www.cpkelco.com/food/pektin.htm 2005).

Gambar 16 Struktur kimia pektin

Pektin adalah suatu kelompok heterogen dari struktur asam polisakarida

yang terdapat terutama dalam dinding sel dan lamela tengah pada buah dan

sayuran. Pektin memiliki struktur kompleks yang terdiri dari homopolimer

termetilasi sebagian asam poli-α-(1→4)-D-galakturonat (smooth, Gambar 17) dan

terdapat wilayah non-gelling rambuty (Gambar 18) dari perubahan bagian α-

(1→2)-L-ramnosil-α-(1→4)-D-galakturonosil yang mengandung branch-points

dengan rantai samping netral (1-20 residu) dari L-arabinosa dan D-galaktosa

(ramnogalakturonan I). Pektin dapat juga mengandung rantai samping

ramnogalakturonan II yang mengandung residu lainnya seperti D-silosa, L-fukosa,

asam D-glukuronat, D-apiosa, asam 3-deoksi-D-mano-2-oktulosonat (Kdo) dan

asam 3-deoksi-D-likso-2-heptulosonat (Dha) yang terikat pada daerah asam poli-

α-(1→4)-D-galakturonat (Chaplin 2004).

30

Gambar 17 Wilayah smooth homopolimer pektin termetilasi (Chaplin 2004)

Gambar 18 Wilayah non-gelling rambuty pektin (Chaplin 2004)

Pada umumnya, pektin tidak menunjukkan struktur yang pasti. Bentuk

residu asam D-galakturonat paling banyak dari molekul, dalam memisahkan

daerah ‘smooth’ dan ‘rambuty’ (Chaplin 2004). Campuran enzim dengan sifat

khusus yang dapat meningkatkan aktifitas spesifik, dapat dibuat dengan

mengkombinasikan masing-masing protein murni atau setiap domain dari

organisme yang memproduksinya atau dari rekombinan organisme. Kombinasi

tersebut dapat enzim murni yang berasal dari organisme berbeda atau

suplementasi enzim kasar dengan enzim murni atau suplementasi enzim murni

dengan domain yang mengikat selulosa dari organisme lainnya atau dengan ko-

faktor spesifik (Howard et al. 2003).

Beberapa produk enzim komersial merupakan campuran dari beberapa

enzim yang berbeda, sehingga enzim komersial pektinase mungkin mengandung

enzim pektinase, hemiselulase, silanase dan selulase. Campuran enzim tersebut

bersama-sama bekerja secara sinergis mendegradasi dinding sel tanaman

31

(http://worhington-biochem.com 2005). Disisi lain produk enzim komersial

lainnya mungkin hanya mengandung 1 jenis enzim, terutama jika enzim tersebut

diproduksi oleh strain termodifikasi secara genetik atau yang tingkat

kemurniannya tinggi. Enzim yang terdapat dalam pektinase campuran meliputi

poligalakturonase, pektin metil esterase dan pektin liase. Enzim-enzim pektin

tersebut bekerja dengan berbagai cara terhadap pektin

(http://www.saps.plantsci.cam.ac.uk/osmoweb/pektinase.htm 2005).

Penggunaan enzim komersial dalam ektraksi vanili segar telah banyak

dikembangkan karena mampu meningkatkan rendemen serta mempercepat reaksi

pembentukan vanilin. Enzim memiliki fungsi penting sebagai katalisator reaksi

biokimia yang mampu mengaktifkan senyawa lain secara spesifik. Seperti katalis

lainnya, enzim mampu bekerja dengan menurunkan energi aktivasi sehingga

reaksi kimia dapat berlangsung lebih cepat. Dalam hal ini, enzim bergabung

dengan reaktan, sedemikian rupa sehingga dihasilkan keadaan transisi yang

mempunyai energi bebas lebih rendah dibanding keadaan transisi reaksi tanpa

katalisator. Setelah hasil reaksi (produk) terbentuk, enzim dibebaskan kembali ke

keadaan semula. Keuntungan enzim dibanding katalis lainnya adalah sifat

sterioregio, kemoselektivitas dan spesifisitasnya yang tinggi (Chaplin dan Bucke

1990; Dordick 1991; Tucker 1995; http://wikipedia.org/wiki/Enzyme 2006).

Suatu bagian yang sangat kecil dari suatu molekul besar protein enzim

berperan mengkatalisis reaksi. Bagian kecil yang disebut bagian aktif (active site)

ini melalui suatu mekanisme khas dan selektif dalam hubungan yang disebut

kunci dan anak kunci (lock and key), dapat berikatan dengan substrat. Selain

bagian katalitik yang merupakan bagian reaktif karena mengandung gugus fungsi,

bagian sisanya yang besar dari molekul enzim juga dibutuhkan untuk

berlangsungnya reaksi katalisis. Dalam hal ini aktifitas enzim ditentukan juga oleh

struktur 3 dimensinya (Price dan Steven 1991; Wirahadikusumah, 2001). Interaksi

enzim dan substrat yang merupakan hipotesis Daniel Koshland pada tahun 1958

dapat dilihat pada Gambar 19 (http://wikipedia.org/wiki/Enzyme 2006).

Enzim digambarkan memiliki struktur tidak terlalu kaku. Sisi aktif enzim

dapat terbentuk ketika substrat berinteraksi dengan enzim. Sisi aktif enzim

berubah akibat beberapa interaksi lemah antara enzim dengan substrat. Rantai

32

samping asam amino yang menyebabkan sisi aktif yang terbentuk menjadi suatu

bentuk yang tepat sehingga memudahkan enzim untuk melakukan fungsi

katalitiknya. Hanya substrat yang dapat terikat pada enzim dan menginduksi

perubahan konformasi enzim yang cocok, yang baik bagi substrat (Price dan

Steven 1991; http://wikipedia.org/wiki/Enzyme 2006)

molekul substrat

molekul enzim

Gambar 19 Model induced fit Koshland

Beberapa faktor penting yang mempengaruhi aktifitas enzim antara lain

suhu, pH dan keberadaan inhibitor. Reaksi-reaksi yang dikatalisis enzim akan

sangat menguntungkan jika dilakukan pada suhu tinggi. Walaupun demikian,

enzim bersifat labil dan menjadi inaktif pada suhu yang terlalu tinggi (Tucker

1995). Denaturasi enzim oleh panas adalah akibat dari perubahan ikatan- ikatan

non kovalen penstabil konformasi enzim seperti ikatan hidrogen, interaksi

hidrofobik, jembatan garam internal dan ikatan disulfida (Price dan Steven 1991).

Kondisi suhu selama ekstraksi vanili secara enzimatik menjadi hal penting yang

harus diperhatikan. Laju reaksi pembentukan vanilin akan meningkat, jika suhu

dinaikan. Namun pengaruhnya terhadap aktifitas enzim dan komponen flavor

harus menjadi pertimbangan. Suhu ekstraksi vanili antara 38-490C dapat

digunakan, tanpa merusak flavor (Purseglove et al. 1981).

Enzim merupakan molekul amfoter yang mengandung sejumlah besar gugus

asam dan basa di permukaannya. Muatan pada gugus tersebut bervariasi

tergantung pada konstanta disosiasi asamnya dengan pH lingkungannya. Ini akan

mempengaruhi muatan total dari enzim dan dis tribusi muatan pada permukaan

luar, juga pada reaktifitas gugus yang aktif secara katalitik. Perubahan muatan

oleh pH akan mempengaruhi aktifitas, stabilitas struktur dan kelarutan enzim

33

(Chaplin dan Bucke 1990). Apabila pH terlalu rendah maka terlalu banyak ion- ion

H+ yang mengelilingi enzim dan kemudian ion- ion H+ akan tertarik pada enzim

membentuk ikatan hidrogen. Sedangkan jika pH terlalu tinggi, terlalu banyak ion-

ion OH-, maka akan berinteraksi dengan daerah-daeah positif dalam enzim, yang

mungkin daerah ini merupakan sisi aktif enzim. Akibat adanya kenyataan bahwa

interaksi enzim dengan substrat sangat spesifik, maka terjadinya perubahan

bentuk sisi aktif, secara langsung ataupun tidak langsung akan menyebabkan kerja

enzim yang tidak tepat. Perubahan ini jika permanen akan mendenaturasi enzim

(http://en.wikipedia.org/wiki/Pectinase 2006). Di dalam ekstraksi vanili, tingkat

keasaman medium alami yang dihasilkan telah sesuai dengan kondisi pH yang

diperlukan enzim-enzim hidrolitik penting. Berbagai penelitian ekstraksi vanili

secara enzimatik menggunakan pH sekitar 5 yang merupakan pH alami buah.

Faktor lainnya yang mempengaruhi aktifitas enzim adalah keberadaan

penghambat. Penghambat bersaing (competitive inhibitor) terikat secara reversible

pada enzim, sehingga mencegah pengikatan substrat. Penghambatan bersaing

menyebabkan nilai Km meningkat, tapi tidak mempengaruhi Vmaks. Sedangkan

penghambat tidak bersaing (non competitive inhibitor) tidak terikat pada sisi aktif

enzim. Penghambatan ini bersifat irreversible, artinya enzim tidak akan berfungsi

lebih lama karena konformasinya berubah. Penghambatan tidak bersaing

menyebabkan penurunan Vmaks, tapi tidak mengubah nilai Km. Tipe ketiga

adalah penghambatan bersaing sebagian (partially competitive inhibitor), dimana

sama dengan penghambatan tidak bersaing, tapi kompleks enzim-penghambat-

substrat mempunyai aktifitas katalitik. Penghambatan ini menyebabkan penurunan

Vmaks, tapi tidak mengubah Km. Tipe selanjutnya adalah penghambat yang

hanya terikat pada kompleks enzim-substrat, tidak pada enzim bebas

(uncompetitive inhibitor). Kompleks enzim-penghambat-substrat secara katalitik

tidak aktif. Tipe penghambatan ini jarang menyebabkan penurunan Vmaks dan

Km. Tipe terakhir adalah penghambatan campuran (mixed inhibitor), dimana

penghambat dapat terikat pada enzim dan kompleks enzim-substrat, bersifat

bersaing ataupun tidak (mixed inhibitor) serta menyebabkan penurunan Vmaks

dan peningkatan Km (Chaplin dan Bucke 1990; Price dan Steven 1991; Tucker

1995; http://wikipedia.org/wiki/Enzyme 2006).

34

BAHAN DAN METODE PENELITIAN

TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mutu dan Keamanan Pangan,

SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor (IPB), Laboratorium Kimia Pangan,

Departemen Ilmu Teknologi Pangan (ITP), IPB, serta Laboratorium Gizi

Masyarakat dan Sumberdaya Keluarga (GMSK), IPB. Adapun lama penelitian

berlangsung sekitar 10 bulan dari Oktober 2005 sampai Juli 2006.

BAHAN DAN ALAT

Bahan

Bahan baku yang digunakan adalah buah vanili segar dan kering jenis

Vanila planifolia ANDREWS yang diperoleh dari Desa Tundagan, Kecamatan

Ciniru, Kabupaten Kuningan, Provinsi Jawa Barat. Buah vanili segar merupakan

buah vanili hijau berusia buah 7-8 bulan dengan karakteristik seragam yakni

warna buah hijau, polong penuh, utuh, tanpa cacat atau pecah, panjang minimum

15 cm dan diameter minimum 10 mm. Sedangkan buah vanili kering merupakan

buah yang telah mengalami proses kuring dan termasuk mutu II berdasarkan SNI

01-0010-1990 (BSN 1990), dengan syarat umum buah kering memiliki wangi

khas vanili, hitam mengkilat, penuh berisi, berminyak, lentur, bebas kapang dan

benda asing. Syarat khusus antara lain buah utuh atau terpotong-potong, ukuran

polong utuh minimum 8 cm, ukuran polong terpotong-potong tidak disyaratkan,

polong utuh yang pecah dan terpotong tidak disyaratkan, kadar air maksimum

30%bb, kadar vanilin minimum 1.5%bk dan kadar abu maksimum 9%bk. Seluruh

buah vanili segar dan kering melalui proses pengeringan beku selama 52 jam.

Selanjutnya digiling dan diayak dengan saringan berukuran 32 mesh. Pengemasan

dilakukan menggunakan plastik rapat dengan keberadaan silica gel, lalu disimpan

dalam freezer hingga percobaan dilakukan. Pada Gambar 20 dapat dilihat buah

Vanilla planifolia Andrews segar dan kering yang digunakan dalam penelitian ini.

Disamping bahan baku, diperlukan juga bahan untuk analisis kimia yakni

analisis serat pangan (buffer Na2PO4, HCl, NaOH, etanol, aseton Puriss, petroleum

eter, enzim Termamyl, Pepsin, Pankreatin, kertas saring), analisis vanilin (standar

vanilin, kertas saring Whatman No.1), analisis glukosa yang terdiri dari pereaksi

35

Nelson (asam molibdat, H2SO4 pekat, Na arsenal), Somogy I (Na2SO4, KNa

Tartart, Na2CO3, NaHCO3), Somogy II (Na2SO4, CuSO4), bahan untuk pembuatan

buffer sitrat (asam sitrat dan Na-sitrat) serta bahan untuk ekstraksi enzimatik dan

optimasi ekstraksi enzimatik yang terdiri dari Celluclast L. (Novo), Viscozyme L.

(Novo), β-glukosidase (SIGMA), etanol 95% dan alumunium foil.

(a) (b)

Gambar 20 Buah Vanilla planifolia Andrews segar (a) dan kering (b)

Viscozyme adalah pektinase komersial campuran arabinase, selulase,

hemiselulase, silanase dan β-glukanase dari Aspergillus aculeatus dengan aktifitas

optimum pada pH 3.3-5.5 dan suhu 25-550C. Viscozyme mengandung 120

FBG/ml dan 32.2 unit aktivitas enzim β-glukosidase (1 unit akan membebaskan

1.0 µmol glukosa dari selobiosa per menit pada pH 4 dan suhu 450C). Sedangkan

Celluclast adalah selulase komersial yang memiliki aktifitas selulase dari

Trichoderma reesei dengan pH optimum 4.5-6 dan suhu 50-600C. Celluclast

mengandung 840 EGU/ml dan 27.7 unit aktivitas enzim β-glukosidase (1 unit

akan membebaskan 1.0 µmol glukosa dari selobiosa per menit pada pH 4 dan

suhu 450C). Enzim β-glukosidase komersial berasal dari buah almond dengan pH

optimum 5. Adapun unit aktivitas enzim β-glukosidase yang terkandung dalam 1

ml enzim adalah 10 unit (1 unit akan membebaskan 1.0 µmol glukosa dari salisin

per menit pada pH 5).

Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi peralatan gelas, pH

meter, refraktometer, termometer, shaker water bath, spektrofotometer double

36

beam, refrigerator, alat pengeringan beku, alat penyaring vakum, timbangan

analitik, cawan alumunium, desikator, oven dan krusibel.

PROSEDUR PENELITIAN

Pada Gambar 21 dapat dilihat bahwa prosedur penelitian terbagi ke dalam 5

tahap yakni; (1) Karakterisasi kimia buah vanili segar dan kering, (2) Penentuan

suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase, (3) Ekstraksi enzimatik buah vanili

segar; (a) Satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol serta (b)

Dua atau tiga jenis enzim komersial dengan pelarut etanol, (4) Optimasi ekstraksi

enzimatik dan (5) Pengamatan terhadap kadar air, serat pangan, vanilin, glukosa

dan padatan terlarut.

Gambar 21 Diagram alir tahapan penelitian

Tahap 1: 1.Karakterisasi kimia - Air - Serat pangan - Vanilin 2.Ekstraksi vanili kering

tanpa enzim komersial dengan pelarut etanol

Parameter : Vanilin

Buah Vanili

Kering Segar

Tahap 2: Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase Parameter : Vanilin

Tahap 4: Optimasi ekstraksi enzimatik 1.Penentuan konsentrasi enzim Parameter : Vanilin 2.Penentuan waktu inkubasi enzim Parameter : Vanilin

Tahap 3: Ekstraksi enzimatik 1.Satu jenis enzim komersial

dengan pelarut etanol/air 2.Dua/tiga jenis enzim komersial

dengan pelarut etanol Parameter: Vanilin

Ekstrak Terbaik

Ekstrak Terbaik

37

Karakterisasi Kimia Buah Vanili Segar dan Kering

Karakterisasi kimia buah vanili segar dan kering merupakan tahap awal dari

penelitian ini. Karakterisasi kimia bertujuan untuk mengetahui kadar senyawa-

senyawa penting dalam buah vanili segar dan kering, yang dapat mendukung

penelitian. Analisis kimia yang dilakukan antara lain kadar air dengan metode

gravimetri, serat pangan metode enzimatik dan vanilin metode spektrofotometri.

Disamping itu, pada tahap ini pun dilakukan penentuan kadar vanilin dari

ekstrak vanili kering yang berfungsi sebagai kontrol terhadap kadar vanilin

ekstrak vanili segar yang diproses secara enzimatik. Prosedur ekstraksi vanili

kering antara lain dengan menimbang sejumlah vanili kering (perhitungan bahan

kering disamakan dengan bahan kering vanili segar), lalu dimasukkan ke dalam

tabung tertutup dan ditambahkan aquadest 10 ml. Reaksi dibiarkan berlangsung

selama 8 jam pada suhu 500C menggunakan shaker water bath 150 rpm.

Kemudian ekstraksi dilanjutkan dengan penambahan etanol 47.5%v/v selama 30

menit. Campuran diencerkan dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu

ukur. Setelah itu ekstrak disaring melalui kertas saring Whatman No.1 dan diukur

kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri.

Penentuan Suhu Inkubasi Optimum Enzim β -Glukosidase

Penentuan suhu optimum aktifitas enzim β-glukosidase dilakukan dengan

memvariasikan suhu inkubasi pada 30, 37, 45 dan 500C. Prosedurnya antara lain

dengan menimbang 3.33 g vanili segar (dikonversikan menjadi berat vanili segar

setelah pengeringan beku), lalu dimasukkan ke dalam tabung tertutup dan

ditambahkan enzim β-glukosidase 1 ml serta aquadest 9 ml. Reaksi enzimatik

dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 30, 37, 45 dan 500C menggunakan

shaker water bath 150 rpm dan dilanjutkan 30 menit dengan penambahan etanol

47.5%v/v. Setiap hasil ekstraksi yang diperoleh, diencerkan dengan aquadest

sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Ekstrak disaring melalui kertas saring

Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri.

Suhu inkubasi enzim β-glukosidase yang menghasilkan kadar vanilin tertinggi

dianggap sebagai suhu optimum bagi aktifitas enzim β-glukosidase dan kondisi

suhu tersebut digunakan untuk inkubasi enzim β-glukosidase pada tahapan

38

penelitian berikutnya yakni ekstraksi enzimatik serta optimasi ekstraksi enzimatik

buah vanili segar.

Ekstraksi Enzimatik Buah Vanili Segar

Ekstraksi enzimatik buah vanili segar bertujuan untuk mengetahui

bagaimana pengaruh penggunaan enzim komersial tunggal atau kombinasinya

dengan atau tanpa etanol terhadap kadar vanilin ekstrak vanili segar. Pada tahap

ini digunakan konsentrasi enzim, jumlah vanili segar, suhu, waktu inkubasi serta

konsentrasi larutan etanol berdasarkan hasil penelitian Ruiz-Teran et al. (2001)

sebagai acuan. Ekstraksi enzimatik buah vanili segar terdiri dari 2 bagian yakni;

Penambahan Satu Jenis Enzim Komersial dengan Pelarut Air dan atau Etanol Tahap ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh penggunaan enzim

selulase, pektinase dan β-glukosidase komersial secara tunggal serta pelarut yakni

air dan atau etanol terhadap kadar vanilin ekstrak vanili segar. Pada tahap ini

terdapat 2 prosedur berdasarkan jenis pelarut yang digunakan. Prosedur pertama

adalah ekstraksi enzimatik yang menggunakan air sebagai pelarut yakni dengan

menimbang 3.33 g vanili segar (dikonversikan menjadi berat vanili segar setelah

pengeringan beku) lalu dimasukkan ke dalam tabung tertutup dan ditambahkan 1

jenis enzim sebanyak 1 ml serta aquadest 9 ml. Reaksi enzimatik dibiarkan

berlangsung selama 8 jam pada suhu 500C menggunakan shaker water bath 150

rpm. Sebagai prosedur kedua adalah ekstraksi enzimatik yang menggunakan air

dan etanol 95% sebagai pelarut. Prosedurnya sama dengan prosedur 1, namun

setelah reaksi berlangsung selama 8 jam, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan

proses ekstraksi dilanjutkan selama 30 menit. Disamping itu, dilakukan ekstraksi

menggunakan pelarut air dengan atau tanpa etanol, tapi tanpa penambahan enzim.

Setiap hasil ekstraksi yang diperoleh dari kedua prosedur di atas, diencerkan

dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Ekstrak disaring melalui

kertas saring Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode

spektrofotometri. Pada Tabel 1 dapat dilihat perlakuan penggunaan 1 jenis enzim

komersial berikut perlakuan pelarut untuk ekstraksi.

39

Tabel 1 Rekapitulasi perlakuan 1 jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol untuk ekstraksi Perlakuan Penambahan

1 2 3 4 5 6 7 8

air a

air+etanolb

selulase+airc

selulasel+air+etanol pektinase+air pektinase+air+etanol β-glukosidase+air β-glukosidase+air+etanol

Keterangan: 1. aair 10 ml ditambahkan pada 3.33 g vanili segar, lalu reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 500C.

bair 10 ml diditambahkan pada 3.33 g vanili segar, setelah reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 500 C, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan reaksi dilanjutkan selama 30 menit. cselulase 1 ml ditambahkan pada 9 ml air lalu reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 500C.

2. Jumlah vanili (3.33 g) dikonversikan terlebih dahulu, apabila digunakan vanili yang telah melalui proses pengeringan beku. Misalnya: berat vanili segar sebelum pengeringan beku adalah 3.33 g dengan kadar air 82.28%, maka berat keringnya 0.5901. Jika digunakan vanili segar setelah pengeringan beku dengan berat kering yang sama, maka jumlah yang digunakan sebesar 0.6464 g.

Hasil dari penelitian tahap ini akan memberikan informasi jenis pelarut yang

mampu menghasilkan kadar vanilin lebih tinggi, sehingga selanjutnya jenis

pelarut tersebut digunakan pada perlakuan ekstraksi dengan penambahan

kombinasi enzim. Disamping itu, kadar vanilin ekstrak yang dihasilkan dari setiap

perlakuan penggunaan enzim tunggal, selanjutnya dibandingkan dengan perlakuan

kombinasi enzim. Kemudian dilakukan optimasi konsentrasi dan waktu inkubasi

enzim terhadap perlakuan ekstraksi enzimatik yang menghasilkan kadar vanilin

tertinggi, sehingga diperoleh kadar vanilin ekstrak optimum.

Penambahan Dua atau Tiga Jenis Enzim Komersial dengan Pelarut Air dan Etanol Tahap ini dilakukan untuk mengetahui efek sinergisme enzim selulase,

pektinase dan β-glukosidase sehingga dapat ditentukan apakah ketiga enzim

komersial tersebut lebih efektif digunakan secara tunggal atau kombinasi. Pada

tahap ini terdapat 2 prosedur berdasarkan jumlah enzim yang digunakan. Prosedur

pertama adalah ekstraksi enzimatik menggunakan 2 jenis enzim yakni dengan

menimbang 3.33 g vanili segar (dikonversikan menjadi berat vanili segar

40

setelah pengeringan beku) lalu dimasukan ke dalam gelas tertutup dan

ditambahkan enzim I dan enzim II masing-masing sebanyak 1 ml dan aquadest 8

ml. Reaksi enzimatik dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 500C

menggunakan shaker water bath 150 rpm. Setelah ekstraksi enzimatik,

ditambahkan 10 ml etanol 95%, lalu proses ekstraksi dilanjutkan selama 30 menit.

Sebagai prosedur kedua adalah ekstraksi enzimatik yang menggunakan 3 jenis

enzim, dimana prosedurnya sama dengan prosedur 1, tapi ditambahkan enzim III

yakni β-glukosidase sebanyak 1 ml sehingga jumlah air yang digunakan adalah 7

ml. Reaksi enzimatik dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 500C.

Setelah ekstraksi enzimatik, ditambahkan 10 ml etanol 95%, lalu proses ekstraksi

dilanjutkan selama 30 menit.

Setiap hasil ekstraksi yang diperoleh dari kedua prosedur di atas, diencerkan

dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Ekstrak disaring melalui

kertas saring Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode

spektrofotometri. Pada Tabel 2 dapat dilihat perlakuan penggunaan 2 atau 3 jenis

enzim komersial untuk ekstraksi.

Tabel 2 Rekapitulasi perlakuan 2 atau 3 jenis enzim komersial dengan pelarut air

dan etanol untuk ekstraksi Perlakuan Penambahan

1

2

3

4

selulase+pektinasea

selulase+β-glukosidase

pektinase+β-glukosidase

selulase+pektinase+β-glukosidaseb

Keterangan: 1. aselulase 1 ml dan pektinase 1 ml ditambahkan pada 8 ml air, setelah reaksi berlangsung 8 jam

pada suhu 500C, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan reaksi dilanjutkan selama 30 menit. bselulase 1 ml, pektinase 1 ml dan β-glukosidase 1 ml ditambahkan pada 7 ml air, setelah reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 500C, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan reaksi dilanjutkan selama 30 menit.

2. Jumlah vanili (3.33 g) dikonversikan terlebih dahulu, apabila digunakan vanili yang telah melalui proses pengeringan beku.. Misalnya: berat vanili segar sebelum pengeringan beku adalah 3.33 g dengan kadar air 82.28%, maka berat keringnya 0.5901. Jika digunakan vanili segar setelah pengeringan beku dengan berat kering yang sama, maka jumlah yang digunakan sebesar 0.6464 g.

41

Kadar vanilin ekstrak yang dihasilkan dari setiap perlakuan kombinasi

enzim, selanjutnya dibandingkan dengan perlakuan penggunaan enzim tunggal.

Kemudian dilakukan optimasi konsentrasi dan waktu inkubasi enzim terhadap

perlakuan ekstraksi enzimatik yang menghasilkan kadar vanilin tertinggi,

sehingga diperoleh kadar vanilin ekstrak optimum.

Optimasi Ekstraksi Enzimatik

Pada tahap ini dilakukan optimasi ekstraksi enzimatik untuk memperoleh

kadar vanilin ekstrak optimum dengan penambahan enzim komersial secara

efisien. Adapun optimasi ekstraksi enzimatik yang dilakukan antara lain;

Penentuan Konsentrasi Optimum Enzim Terbaik

Berdasarkan hasil percobaan pada tahap 3 akan diketahui ekstrak terbaik

dengan kadar vanilin tertinggi yang diperoleh melalui penambahan enzim tertentu

dengan pelarut air dan atau etanol. Selanjutnya untuk menentukan unit aktifitas

enzim optimum dilakukan prosedur percobaan yang sama, tapi unit aktifitas enzim

yang ditambahkan divariasikan. Dari percobaan ini akan diketahui berapa jumlah

enzim yang diperlukan agar seluruh substrat yang terdapat dalam buah dapat

berikatan dengan enzim secara optimal, dimana hal ini ditunjukkan dengan kadar

vanilin bebas dalam ekstrak yang mencapai batas optimum.

Penentuan Waktu Inkubasi Optimum Enzim β -glukosidase

Setelah diketahui konsentrasi enzim optimum, lalu dilakukan penentuan

waktu inkubasi optimum dengan prosedur yang sama. Hal ini bertujuan untuk

meningkatkan efisiensi ekstraksi enzimatik. Pada tahap ini waktu inkubasi

divariasikan, lalu ekstrak diukur kadar vanilinnya dengan metode

spektrofotometri.

Pengamatan

Pengamatan yang dilakukan meliputi analisis kadar air, serat pangan,

vanilin, glukosa dan padatan terlarut dalam ekstrak.

Kadar Air Metode Gravimetri (Apriyantono dkk. 1989)

Penetapan kadar air buah vanili segar dan kering sebelum dan sesudah

pengeringan beku dilakukan dengan metode gravimetri. Cawan alumunium

42

kosong dikeringkan dalam oven selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator

selama 10 menit kemudian ditimbang. Selanjutnya sampel sebelum pengeringan

beku ditimbang sebanyak kurang lebih 5 g untuk analisis kadar air buah awal dan

sampel setelah pengeringan beku ditimbang kurang lebih 0,5 g. Setelah itu

dimasukkan ke dalam oven selama sekitar 16 jam hingga diperoleh berat tetap.

Cawan beserta is inya dipindahkan ke dalam desikator, didinginkan lalu ditimbang.

Perhitungan:

% kadar air (berat kering) = 1002

3 xww

% kadar air (berat basah) = 1001

3 xww

Keterangan: w1 = berat sampel (g) w2 = berat sampel setelah dikeringkan(g) w3 = kehilangan berat (g)

Kadar Serat Pangan Metode Enzimatik (Asp et al. 1993)

Serat pangan (serat makanan) adalah bagian dari makanan yang tidak dapat

dihidrolisis oleh enzim-enzim pencernaan, meliputi selulosa, hemiselulosa, lignin,

pentosan, gum dan senyawa pektik. Analisis serat pangan meliputi homogenisasi

dan liofilisasi. Prosedur analisisnya antara lain; sampel digiling menggunakan

petroleum eter pada suhu kamar selama 15 menit (40 ml petroleum eter per gram

sampel). Lalu ditimbang 1 g sampel dan dimasukan ke dalam erlenmeyer.

Kemudian ditambahkan 25 ml 0.1 M buffer Na2PO4 pH 6 dan diaduk merata.

Enzim Termamyl ditambahkan 0.1 ml dan erlenmeyer ditutup dengan alumunium

foil. Lalu diinkubasi di dalam penangas air pada suhu 1000C selama 15 menit.

Campuran dibiarkan dingin dan ditambahkan 20 ml air destilata, atur pH menjadi

1.5 menggunakan HCl. Kemudian ditambahkan 100 mg Pepsin, erlenmeyer

ditutup dan diinkubasi di dalam penangas air bergoyang pada suhu 400C selama

60 menit. Setelah itu 20 ml air destilata ditambahkan dan atur pH menjadi 6.8

menggunakan NaOH. Sebanyak 100 mg Pankreatin ditambahkan, erlenmeyer

ditutup dan diinkubasi di dalam penangas air bergoyang pada suhu 400C selama

60 menit. Lalu pH diatur menggunakan HCl. Campuran kemudian disaring

43

menggunakan crucible (porosity 2) yang telah diketahui beratnya dan

mengandung 0.5 celite kering, lalu dibilas dengan 2x10 ml air destilata.

- Residu (serat yang tidak larut)

Dari prosedur di atas, selanjutnya residu (serat yang tidak larut) dibilas

dengan 2x10 ml etanol 95% dan 2x10 ml aseton. Kemudian dikeringkan pada

suhu 1050C sampai mencapai berat konstan (semalam). Lalu didinginkan dalam

desikator dan ditimbang (D1). Selanjutnya diabukan pada suhu 5500C selama 5

jam. Lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang (I1).

- Filtrat (serat yang larut)

Volume filtrat diatur menjadi 100 ml. Selanjutnya 400 ml etanol 95% hangat

(600C) ditambahkan dan dibiarkan mengendap selama 1 jam. Larutan disaring

menggunakan crucible (porosity 2) yang telah diketahui beratnya dan

mengandung 0.5 celite kering. Serat yang larut dibilas dengan 2x10 ml etanol

78%, 2x10 ml etanol 95% dan 2x10 ml aseton. Kemudian dikeringkan pada suhu

1050C selama semalam. Lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang (D2).

Selanjutnya diabukan pada suhu 5500C selama 5 jam. Lalu didinginkan dalam

desikator dan ditimbang (I2).

Blanko untuk serat yang tidak larut dan serat larut diperoleh melalui cara

yang sama dengan prosedur untuk sampel, tapi tanpa sampel (B1 dan B2). Nilai

blanko ini sewaktu-waktu harus dicek.

Perhitungan:

% serat pangan tidak larut = 100xW

B1I1D1 −−

% serat pangan larut = 100xW

B2I2D2 −−

% serat pangan total = 100xW

BID −−

Keterangan: W = berat sampel (g) D = berat setelah pengeringan (g) I = berat setelah pengabuan (g) B = berat blanko bebas abu (g)

44

Kadar Vanilin Buah Vanili Metode Spektrofotometri (Hayani dan Fatimah 2002)

Kurva standar vanilin yang digunakan untuk penentuan kadar vanilin buah

adalah sama dengan kurva standar yang dipakai untuk penentuan kadar vanilin

dalam ekstrak vanili. Adapun penentuan kadar vanilin dalam buah dilakukan

dengan menimbang 5 g vanili kering. Jumlah ini dikonversikan dulu apabila

digunakan buah vanili segar atau kering yang telah melalui perlakuan pengeringan

beku (Lampiran 5). Selanjutnya buah vanili direndam selama 24 jam dengan 70

ml alkohol 60% di dalam erlenmeyer tertutup. Campuran disaring dengan kertas

saring Whatman No.1 menggunakan alat penyaring vakum dan dibilas dengan

alkohol 60%, lalu ditepatkan dengan penambahan alkohol 60% hingga tanda batas

dalam labu ukur 100 ml. Kemudian larutan dipipet sebanyak 10 ml, dimasukan ke

dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan aquadest hingga tanda batas (larutan X).

Larutan X dipipet sebanyak 2 ml, dimasukan ke dalam labu ukur 25 ml dan

ditambahkan aquadest hingga tanda batas. Disisi lain, larutan X dipipet sebanyak

2 ml, dimasukan ke dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan 1 ml NaOH 0.1N dan

diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas.

Perhitungan :

Kadar vanilin atas dasar bahan kering (µg/g) = %)%100(

25HM

xfpxX−

Keterangan: X = konsentrasi larutan sampel yang terbaca di spektrofotometer (µg/ml) fp = faktor pengenceran (500) M = massa sampel (g)

H% = kadar air setelah pengeringan beku

Kadar Vanilin Ekstrak Metode Spektrofotometri (AOAC 36.2.07 1995, revisi Maret 1998)

Sampel ekstrak vanili segar yang telah disaring dengan kertas saring

Whatman No.1 menggunakan alat penyaring vakum, selanjutnya dianalisis

dengan spektrofotometer double beam. Sebanyak 10 ml larutan sampel dipipet ke

dalam 100 ml labu ukur, diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas. Pada

labu ukur lainnya, ditambahkan 80 ml aquadest dan 1 ml NaOH 0.1N, lalu

diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas. Pengenceran dapat disesuaikan,

45

agar sampel memiliki nilai absorbansi antara 0.2-0.8. Nilai absorbansi dari larutan

basa ditentukan pada 348 nm menggunakan larutan netral sebagai blanko. Lalu

kandungan vanilin sampel diukur melalui kurva standar.

Kurva standar dibuat dengan cara melarutkan 0.1 g vanilin dengan 5 ml

alkohol 99.8% di dalam labu ukur 100 ml. Lalu larutan dipipet 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

9 dan 10 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Aquadest ditambahkan

hingga tanda batas (larutan X). Kemudian masing-masing larutan X dipipet

sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Aquadest ditambahkan

hingga tanda batas. Disisi lain, larutan X dipipet masing-masing 5 ml lalu

dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Setelah itu, sebanyak 1 ml NaOH 0.1 N

ditambahkan dan larutan diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas. Nilai

absorbansi dari larutan basa ditentukan pada 348 nm menggunakan larutan netral

sebagai blanko, lalu dibuat kurva standar.

Kadar Glukosa Ekstrak Vanili Metode Somogy-Nelson (Unpas 2003)

Metode ini cukup akurat untuk mengukur kadar gula pereduksi karena warna

yang terbentuk stabil. Kurva standar dibuat dengan cara melarutkan 0.02 g

glukosa standar dengan air bebas mineral di dalam labu ukur 100 ml. Larutan

tersebut dipipet 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 dan 2 ml, lalu dimasukkan

ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan air bebas mineral hingga mencapai 2 ml.

Kemudian ke dalam setiap tabung yang berisi larutan glukosa tersebut

ditambahkan pereaksi Somogy I sebanyak 1.6 ml dan Somogy II sebanyak 0.4 ml.

Lalu larutan dikocok secara homogen dan ditutup dengan kelereng. Setelah itu

dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Lalu didinginkan dan

ditambahkan pereaksi Nelson sebanyak 2 ml serta air bebas mineral 4 ml. Larutan

dikocok hingga gas CO2 keluar dan nilai absorbansi diukur pada ? 520 nm.

Blanko dibuat sama dengan di atas, tapi sampel diganti dengan air bebas mineral.

Prosedur analisis gula pereduksi yang terdapat dalam ekstrak vanili pun

sama dengan pembuatan standar. Larutan sampel (ekstrak vanili) sebanyak 10 ml

dimasukan ke dalam labu ukur 25 ml. Kemudian larutan Pb asetat jenuh dan air

bebas mineral ditambahkan kedalamnya hingga tanda batas. Larutan dikocok

merata dan disaring dengan kertas saring Whatman No.1 menggunakan alat

penyaring vakum. Untuk menghilangkan kelebihan Pb yang digunakan dalam

46

penjernihan, ditambahkan Na oksalat anhidrat 1 g ke dalam filtrat. Larutan

kemudian disaring kembali dengan kertas saring Whatman No.1 menggunakan

alat penyaring vakum sebanyak 2 kali agar filtrat benar-benar jernih. Selanjutnya

filtrat dipipet sebanyak 1 ml dan diencerkan dengan air bebas mineral hingga

tanda batas labu ukur 50 ml. Lalu sebanyak 1 ml larutan dimasukan ke dalam

tabung reaksi, ditambahkan air bebas mineral 1 ml, lalu dilakukan prosedur

analisis seperti pada pembuatan standar gula pereduksi. Perlu diperhatikan bahwa

sampel harus bebas impuritas dan pemanasan serta pendinginan sampel dengan

standar harus seragam.

Perhitungan :

Kadar glukosa atas dasar bahan kering ekstrak (µg/ml) = Vs

VaxfpxX

Keterangan: X = konsentrasi larutan sampel yang terbaca di spektrofotometer (µg/ml) fp = faktor pengenceran Va = volume akhir Vs = volume sampel (ml) Kadar Padatan Terlarut

Kadar padatan terlarut dalam ekstrak vanili segar dan kering diukur dengan

2 metode yakni gravimetri dan refraktrometri. Pengukuran kadar padatan terlarut

dengan metode gravimetri dilakukan untuk perhitungan kadar vanilin ekstrak atas

dasar berat kering. Prosedurnya antara lain; cawan porselen dikeringkan dalam

oven selama 24 jam dan didinginkan dalam desikator selama 10 menit kemudian

ditimbang. Selanjutnya ekstrak vanili segar sebanyak 2.5 g dimasukan ke dalam

cawan. Lalu dikeringkan menggunakan oven suhu 1050C selama sekitar 20 jam

hingga diperoleh berat tetap. Cawan beserta isinya dipindahkan ke dalam

desikator, didinginkan lalu ditimbang.

Perhitungan:

% kadar padatan terlarut = 1001

2 xww

Keterangan: w1 = berat sampel (g) w2 = berat sampel setelah dikeringkan (g)

47

HASIL DAN PEMBAHASAN

KARAKTERISASI KIMIA BUAH VANILI SEGAR DAN KERING Bahan segar yang digunakan dalam ekstraksi, pada umumnya dikeringkan

terlebih dahulu karena reduksi ukuran sampel dalam bentuk kering lebih mudah

dilakukan. Namun demikian, selama pengeringan sebagian senyawa-senyawa

organik dapat hilang. Oleh sebab itu dalam penelitian ini dilakukan persiapan

sampel dengan cara pengeringan beku. Adapun buah vanili kering dan segar hasil

pengeringan beku dan pengecilan ukuran dengan ayakan 32 mesh dapat dilihat

pada Gambar 22.

(a) (b)

Gambar 22 Serbuk buah vanili kering (a) dan segar (b) hasil pengeringan beku

Pengeringan beku atau liofilisasi adalah penghilangan air melalui sublimasi

yakni perubahan wujud padat (es) langsung menjadi gas (uap), sehingga

menghambat aktifitas mikroorganisme dan enzim yang secara normal dapat

mendegradasi senyawa di dalam bahan pangan

(http://en.wikipedia.org./wiki/Freeze_drying 2006). Dengan kata lain,

pengeringan beku menyebabkan kerusakan bahan pangan yang minimum

(Menyhart 1995). Berdasarkan FR-A-2634979 diacu dalam Brunerie (1998),

dipatenkan proses pengeringan beku vanili segar pada suhu –5 sampai –300C dan

kemudian memanaskannya kembali sebelum proses ekstraksi dengan tujuan

menghindari proses kuring yang memakan waktu lebih panjang. Faktanya bahwa

sampel berbentuk bubuk akan lebih mudah memfasilitasi serangan enzim terhadap

substrat. Menurut Fellow (2000), laju transfer massa berhubungan langsung

48

dengan luas permukaan padatan yang terekspos dengan pelarut sehingga reduksi

ukuran partikel (peningkatan luas permukaan) akan menambah laju ekstraksi.

Jones dan Vincente pada tahun 1949 diacu dalam Purseglove et al. (1981),

menemukan bahwa kuring terhadap buah vanili segar bubuk akan menghasilkan

kandungan vanilin yang lebih tinggi dibanding kuring buah vanili utuh dan proses

ini tidak menyebabkan kerusakan flavor. Fenomena ini diyakini disebabkan lebih

mudahnya kontak antara glukovanilin dan β-glukosidase yang diperoleh akibat

penggilingan.

Setelah dilakukan persiapan sampel, selanjutnya dilakukan analisis dasar

untuk mengetahui karakteristik buah vanili segar dan kering. Analisis dasar yang

dilakukan dalam penelitian ini adalah analisis kadar air, serat pangan dan vanilin.

Data dasar buah vanili dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3 Data dasar buah vanili segar dan kering hasil pengeringan beku

Kadar Air (%) Jenis Vanili

Rendemen (%)

Ka1* Ka2*

Kadar Serat Pangan (%bk)

Kadar Vanilin (%bk)

Segar 17.72±1.88 83.50±1.72 9.04±0.44 10.17±0.036 0.76±0.0014

Kering 86.00±0.12 20.48±0.51 8.40±0.37 9.84±0.17 1.63±0.039

Keterangan: *Ka1 = kadar air sebelum pengeringan beku *Ka2 = kadar air setelah pengeringan beku Rendemen = berat sampel setelah pengeringan beku per berat sampel sebelum pengeringan beku

Pada Tabel 3 dapat dilihat bahwa terjadi penyusutan berat buah vanili segar

maupun kering akibat dilakukannya proses pengeringan beku. Rendemen untuk

vanili segar sebesar 17.72%, sedangkan vanili kering 86.00%. Adapun kadar air

yang terkandung dalam buah vanili kering relatif rendah yakni sebesar 20.48%bb

buah vanili kering. Berdasarkan SNI 01-0010-1990 (BSN 1990), vanili kering

yang digunakan dalam penelitian ini termasuk mutu II karena memiliki kadar air

20.48%bb di bawah kadar maksimum 30%bb buah vanili kering yang

dipersyaratkan dan kadar vanilin 1.63%bk di atas kadar minimum 1.5 %bk buah

vanili kering yang dipersyaratkan. Hasil penelitian de Guzman dan Siemonsma

(1999) menunjukkan bahwa kadar air buah vanili Vanilla planifolia Andrews

yang telah mengalami proses kuring adalah 20%bk dan kadar vanilinnya 1.5-

49

3%bk. Ia juga menambahkan bahwa buah vanili kering yang telah mengalami

proses fermentasi selama kuring mengandung vanilin sekitar 2%bk, tapi jumlah

ini tergantung pada sumber buah dan metode kuring yang digunakan.

Pada Tabel 3 dapat dilihat bahwa kadar air dan kadar vanilin vanili segar

dengan usia buah sekitar 7 bulan yang digunakan dalam penelitian ini berturut-

turut sebesar 83.50%bb dan 0.76%bb. Diketahui bahwa kadar air vanili segar

semakin menurun dengan bertambahnya usia buah. Hasil penelitian Sagrero-

Nieves dan Schwartz (1988) menunjukkan bahwa Vanilla planifolia yang dipanen

pada bulan Agustus hingga Desember 1986 mengalami penurunan kadar airnya

dari 87.6%bb menjadi 81.4%bb. Sedangkan kadar vanilinnya semakin meningkat

yakni dari 0.02%bk menjadi 1.13%bk. Menurut Purseglove et al. (1981),

kandungan air pada buah vanili segar atau blossom-end yellow adalah sekitar

80%. Kadar air buah akan menurun selama kuring pada tahap pemeraman atau

pengeringan serta pada 3 bulan pertama tahap pengkondisian. Oleh sebab itu dari

sekitar 6 kg buah vanili segar akan dihasilkan 1 kg vanili kering.

Pada Tabel 3 dapat dilihat bahwa kadar serat pangan buah vanili segar yang

digunakan dalam penelitian ini sebesar 10.17%bk. Serat pangan terdiri dari

beberapa jenis karbohidrat seperti selulosa, hemiselulosa dan pektin yang

merupakan komponen penyusun dinding sel buah. Seiring dengan meningkatnya

kematangan buah, serat pangan yang umumnya polisakarida berubah menjadi

gula-gula pereduksi (Schwimmer 1981). Degradasi komponen serat pangan ini

terjadi lebih lanjut selama kuring, dimana kadar serat pangan pada buah vanili

kering yang digunakan dalam penelitian ini sebesar 9.84%bk.

Hasil penelitian de Guzman dan Siemonsma (1999) menunjukkan bahwa

kadar serat vanili kering Indonesia berkisar 15-20%bk. Sedangkan kandungan

karbohidratnya memiliki kisaran yang cukup luas yakni 8-20%bk (Purseglove et

al. 1981). Dalam hal ini varietas buah, metode kuring serta metode analisis yang

digunakan akan sangat mempengaruhi kadar serat pangan yang terdeteksi.

Disamping itu metode persiapan sampel yakni proses penggilingan buah yang

dilakukan setelah pengeringan beku menyebabkan menurunnya kandungan serat

pangan, terutama terjadi karena penurunan kadar serat tidak larut seperti selulosa

dan hemiselulosa (http://www.fao.org/docrep/W8079E/w8079e0j.htm 2006).

50

Sebagai pembanding, dalam penelitian ini dilakukan ekstraksi terhadap buah

vanili kering dengan metode maserasi yang biasa digunakan di industri ekstrak

vanili alami. Hasilnya menunjukkan bahwa kadar vanilin ekstrak vanili kering

adalah sebesar 3.28%bk ekstrak atau 0.029g/100ml ekstrak, dengan kadar glukosa

11.95%bk ekstrak atau 0.11g/100ml ekstrak buah vanili kering. Disisi lain, hasil

penelitian Ruiz-Teran et al. (2001) mendapatkan kadar vanilin sebesar 1.14%bk

buah vanili kering pada kondisi suhu dan waktu inkubasi yang sama, namun

menggunakan ekstraktor Soxhlet serta tanpa persiapan sampel pengeringan beku.

PENENTUAN SUHU INKUBASI OPTIMUM ENZIM β -GLUKOSIDASE

Di dalam penelitian ini dilakukan penentuan suhu inkubasi optimum bagi

aktifitas enzim β-glukosidase, dimana β-glukosidase komersial yang digunakan

memiliki pH optimum 5. Dua enzim komersial lainnya yakni pektinase komersial

dari Aspergillus aculeatus memiliki aktifitas optimum pada pH 3.3-5.5 dan suhu

50-600C serta selulase komersial dari Trichoderma reseii dengan pH optimum

4.5-4.8 dan suhu 48-600C. Kedua enzim tersebut diaplikasikan untuk penelitian

ini pada suhu 500C. Di dalam penelitian ini tidak dilakukan penentuan pH

optimum enzim karena pH alami ekstrak buah vanili segar yakni 4.8-5.3, telah

sesuai untuk aktifitas ketiga enzim tersebut. Adapun data penentuan suhu inkubasi

optimum enzim β-glukosidase dapat dilihat pada Gambar 23.

Gambar 23 Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase

16.1815.5615.1713.37

70.9975.85

62.92

42.29

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 30 37 45 50suhu (C)

kada

r (%

bk e

kstr

ak)

vanilin

glukosa

51

Pada Gambar 23 dapat dilihat bahwa aktifitas enzim β-glukosidase semakin

meningkat seiring dengan meningkatnya suhu, ditandai dengan peningkatan kadar

vanilin hingga mencapai 16.18%bk ekstrak pada suhu 500C. Sedangkan pada

suhu 30, 37 dan 450C menghasilkan kadar vanilin berturut-turut sebesar 13.37,

15.17, dan 15.56%bk ekstrak.

Data pada Gambar 23 menunjukkan pula bahwa produksi vanilin yang

meningkat, diimbangi dengan produksi glukosa yang juga semakin meningkat.

Kadar glukosa tertinggi sebesar 75.85%bk ekstrak dicapai pada suhu 500C.

Sedangkan pada suhu 30, 37 dan 450C menghasilkan kadar glukosa berturut-turut

sebesar 42.29, 62.92 dan 70.99%bk ekstrak. Kurva pembentukan vanilin yang

serupa dengan glukosa ini kemungkinan besar disebabkan glukosa merupakan

produk lain dari hasil pemecahan glukovanilin. Disamping itu, semakin tinggi

suhu maka laju degradasi karbohidrat kompleks pada buah vanili segar semakin

tinggi. Peningkatan suhu menyebabkan pemutusan ikatan lemah antar rantai

polisakarida, termasuk ikatan glikosida dalam polisakarida serat pangan pun akan

rusak (http://www.fao.org/docrep/W8079E/w8079e0j.htm 2006). Oleh sebab itu,

selanjutnya dapat difahami bahwa walaupun kurva peningkatan vanilin dan

glukosa serupa, namun jumlah glukosa yang terbentuk akibat peningkatan suhu

lebih berbeda nyata diantara perlakuan suhu yang digunakan. Tingginya kadar

glukosa di dalam ekstrak buah vanili segar ini ditandai dengan kadar padatan

terlarut yang tinggi pula (Lampiran 4).

Suhu merupakan faktor yang sangat mempengaruhi penggunaan enzim

dalam pengolahan pangan. Biasanya industri menginginkan penggunaan suhu

tinggi pada proses reaksinya. Hal ini bukan ditujukan untuk mengurangi tingkat

kontaminasi saja, tetapi suhu tinggi juga akan mengurangi masalah viskositas dan

meningkatkan laju reaksi (Chaplin dan Bucke 1990; Chaplin 2004). Suatu reaksi

dengan penambahan enzim yang hanya memiliki energi aktivasi 12.000 cal mol-1,

laju reaksinya akan meningkat 2 kali jika suhu dinaikan dari 220C menjadi 320C.

Oleh sebab itu, reaksi-reaksi yang dikatalisis enzim akan sangat menguntungkan

jika dilakukan pada suhu tinggi (Tucker 1995). Disamping itu, lebih tingginya

suhu dapat meningkatkan laju difusi produk ke dalam pelarut (Fellow 2000).

52

Akan tetapi, enzim merupakan protein dan akan mengalami denaturasi yang

bersifat irreversible (misalnya perubahan konformasi sehingga kehilangan

aktifitas biologinya) pada suhu yang melebihi suhu yang biasa enzim tersebut

terekspos pada lingkungan alaminya. Diatas suhu kritis, akan terjadi kehilangan

aktifitas dengan laju tinggi. Hal itu dapat disebabkan perubahan kovalen seperti

deaminasi residu asparagin atau perubahan non kovalen seperti rearrangement

rantai protein. Kehilangan aktifitas secara nyata merupakan hasil dari pengaruh

suhu dan lama inkubasi. Inaktivasi akibat denaturasi panas ini memiliki efek

terhadap produktifitas enzim (Chaplin dan Bucke 1990; Chaplin 2004).

Proses inaktifasi enzim pada suhu tinggi dapat berlangsung sedikitnya

melalui 2 tahap yaitu adanya pembukaan partial struktur sekunder, tertier dan atau

kuartener molekul enzim serta terjadinya perubahan struktur primer enzim karena

adanya kerusakan asam-asam amino tertentu oleh panas. Pada kedua tahap

tersebut, keberadaan air sangat penting dalam meningkatkan reaksi inaktivasi oleh

panas karena air menyebabkan konformasi molekul enzim menjadi lebih fleksibel

(Goodenough 1995).

Pada penelitian ini, percobaan yang lebih dari 500C tidak dilakukan karena

dikhawatirkan dapat merusak komponen flavor ekstrak vanili itu sendiri. Mazza

dan LeMagunitr (1980) diacu dalam Fellow (2000), menyatakan bahwa panas

tidak hanya menguapkan air tapi juga menyebabkan hilangnya komponen volatil

bahan pangan. Tingkat kehilangan komponen volatil bahan tergantung pada suhu,

kandungan air dalam bahan, tekanan uap komponen volatil dan kelarutan

komponen volatil tersebut dalam uap air. Disamping itu, menurut Fellow (2000),

suhu yang terlalu tinggi pun akan menyebabkan terekstraksinya komponen yang

tidak diinginkan.

Suhu ekstraksi dianjurkan untuk tidak melebihi suhu maksimum karena

dapat menyebabkan degradasi flavor vanili. Sebaliknya, suhu yang terlalu rendah

dapat mengakibatkan bloking reaksi yang diinginkan. Suhu ekstraksi vanili pada

umumnya antara 10 sampai 600C dan disukai antara 30 sampai 400C (Brunerie

1998). Menurut Purseglove et al. (1981), suhu 38-490C dapat meningkatkan

ekstraksi vanili tanpa merusak flavor. Oleh sebab itu, berdasarkan percobaan pada

tahap ini ditetapkan bahwa suhu optimum untuk aktifitas enzim β-glukosidase

53

adalah 500C dan untuk tahapan penelitian berikutnya, penambahan enzim β-

glukosidase diaplikasikan pada suhu tersebut. Adapun hasil ekstraksi buah vanili

segar yang diperoleh dengan suhu inkubasi enzim β-glukosidase yang berbeda

dapat dilihat pada Gambar 24.

Gambar 24 Ekstrak vanili segar yang diperoleh dengan perlakuan ekstraksi pada suhu inkubasi enzim β-glukosidase yang berbeda

Pada Gambar 24 dapat dilihat bahwa setiap perlakuan menghasilkan

penampakan visual ekstrak yang berbeda. Perlakuan ekstraksi dengan suhu

inkubasi 300C menghasilkan warna lebih gelap dibanding perlakuan lainnya.

Sedangkan pada suhu inkubasi 37, 45 dan 500C, warna coklat yang terbentuk

nyaris serupa. Hal ini kemungkinan besar berhubungan dengan reaksi pencoklatan

enzimatik dari senyawa fenolik, reaksi pencoklatan non enzimatik terutama reaksi

Maillard serta degradasi klorofil buah vanili segar. Berlangsungnya ketiga tipe

reaksi tersebut sangat dipengaruhi oleh suhu.

Naczk dan Shahid i (2004), menegaskan bahwa vanilin yang merupakan

komponen utama flavor dalam ekstrak vanili adalah senyawa fenolik sederhana.

Reaksi pencoklatan enzimatik terhadap senyawa fenolik tersebut banyak

dikatalisis oleh enzim katekol oksigenase (dalam bentuk polifenol oksidase,

EC.1.10.3.1). Pada umumnya katekol oksigenase dapat mengkatalisis 2 tipe reaksi

yakni hidroksilasi (aktifitas kresolase) dan dehidrogenasi (aktifitas katekolase).

Tipe reaksi pertama adalah hidroksilasi monofenol menjadi o-difenol. Sedangkan

tipe kedua adalah oksidasi o-difenol menjadi kuinon. Menurut Francis (1996),

kuinon berkontribusi terhadap timbulnya warna gelap, kuning, oranye dan coklat

300 C 370 C 450 C 500 C

54

pada jamur dan ganggang Reaktifitas kuinon yang tinggi biasanya lebih jauh

memicu terjadinya reaksi kondensasi non enzimatik yang berperan dalam

pembentukan melanin yang berwarna coklat (Eskin 1990; Lee 1993; Davidek et

al. 1990; Richardson dan Hyslop 1985). Oleh sebab itu, peningkatan kadar vanilin

ekstrak buah vanili segar seiring dengan meningkatnya suhu, seperti terlihat pada

Gambar 23 berkontribusi terhadap pembentukan warna coklat akibat reaksi

pencoklatan enzimatik terutama oleh enzim polifenol oksidase.

Menurut Eskin (1990), suhu optimum aktifitas enzim polifenol oksidase

bervariasi tergantung pada jenis buah atau sayuran. Berdasarkan hasil penelitian

Hanum (1997), suhu optimum aktifitas polifenol oksidase pada buah vanili kering

selama kuring adalah 450C. Aktifitas polifenol oksidase meningkat setelah killing

dan menurun saat conditioning. Diduga panas yang tidak terlalu tinggi saat killing

(60-650C selama 2 menit) merangsang aktifitas enzim sehingga lebih aktif atau

terjadi penurunan ketegaran jaringan sel sehingga kontak antara enzim dan

substrat berjalan lebih sempurna. Aktifitas polifenol oksidase tidak banyak

berubah pada tahap pemeraman (suhu kamar, 24 jam) dan mencapai maksimal

pada tahap pengeringan (600C selama 3 hari). Secara umum terjadi kecenderungan

perubahan yang sama antara aktifitas polifenol oksidase, kadar vanilin dan warna

coklat vanili kering selama kuring. Akan tetapi, belum dapat disimpulkan peran

enzim ini terhadap pembentukan flavor mengingat selama ini polifenol oksidase

hanya dikaitkan dengan pencoklatan dan rasa sepat buah-buahan.

Reaksi penting lainnya dalam pembentukan warna coklat adalah reaksi

pencoklatan non enzimatik Maillard. Reaksi ini dapat terjadi dalam ekstrak vanili

segar akibat dihasilkannya gula-gula pereduksi terutama glukosa, yang merupakan

produk lain dari hidrolisis glukovanilin dan degradasi karbohidrat kompleks pada

buah vanili segar. Tahap awal dari reaksi Maillard adalah kondensasi antara α-

amino dari asam amino atau protein dengan gugus karbonil dari gula pereduksi.

Tahap ini disebut reaksi karbonilamino dan produk awal yang terbentuk akan

kehilangan air, membentuk basa Schiff diikuti dengan siklisasi menghasilkan

glikosilamin yang tersubstitusi N. Senyawa ini sangat labil sehingga mengalami

isomerisasi menjadi asam fruktosamino (1-amino-1-deoksi-1-ketosa). Reaksi ini

disebut Amadori rearrangement. Selanjutnya, setidaknya ada 3 jalur pembentukan

55

warna coklat melanoidin dalam reaksi Maillard. Pertama, melalui senyawa

Amadori yang diubah menjadi 1,2-eneaminol dan 2,3-enediol. Kedua, kondensasi

aldol yang merupakan jalur alternatif. Ketiga, degradasi Strecker yang tidak

secara langsung membentuk pigmen tapi menyediakan senyawa pereduksi penting

untuk pembentukan warna coklat (Eskin 1990).

Pada tahap awal reaksi Maillard, gula pereduksi sangat penting

keberadaannya karena menyediakan gugus karbonil untuk berinteraksi dengan

amino bebas dan asam amino, peptida atau protein. Laju awal reaksi ini

tergantung pada pembentukan cincin gula menjadi okso atau bentuk yang mudah

tereduksi. Dilaporkan bahwa pembentukan warna coklat oleh D-fruktosa lebih

cepat dibanding glukosa pada tahap awal reaksi pencoklatan, tapi menurun drastis

setelahnya. Reyes et al. (1982) diacu dalam Eskin (1990), melaporkan bahwa

pada sistem glukosa-glisin dan fruktosa-glisin suhu 600C, pH 3.5 selama 280 jam,

pembentukan coklat oleh fruktosa lebih cepat pada 80 jam pertama, tapi pada

periode selanjutnya konsumsi glukosa justru lebih tinggi.

Reaksi pencoklatan non enzimatik Maillard dipengaruhi beberapa faktor

terutama suhu dan pH. Laju reaksi akan meningkat dengan meningkatnya suhu.

Hal ini dapat ditunjukkan dengan menurunnya jumlah nitrogen amino bebas

secara linier dalam sistem kasein-glukosa berdasarkan rumus Arrhenius, pada

suhu 0-800C. Selain itu pada sistem albumin-glukosa suhu 370C selama 30 hari, ε-

amino lisin mengalami penurunan hingga 89% (Eskin 1990). Menurut Davidek et

al. (1990), peningkatan suhu 100C akan menyebabkan laju reaksi meningkat 2-3

kali. Oleh sebab itu, pembentukan glukosa yang meningkat seiring meningkatnya

suhu seperti terlihat pada Gambar 24 mempengaruhi pembentukan warna coklat

ekstrak vanili segar. Disamping suhu, aspek penting lainnya adalah pH. Intensitas

reaksi Maillard akan meningkat, seiring dengan meningkatnya pH antara 3-8 dan

mencapai maksimum (warna coklat maksimum) pada pH basa (9-10) (Davidek et

al.1990). Dengan kata lain, reaksi Maillard dapat berlangsung pada kondisi basa

maupun asam (Eskin 1990). Hal inilah yang mendukung kemungkinan terjadinya

reaksi Maillard sebagai penyebab warna coklat pada ekstrak vanili segar

walaupun memiliki pH agak asam (4.8-5.3).

56

Reaksi lain yang menyebabkan terbentuknya warna coklat pada ekstrak

vanili adalah rusak atau hilangnya klorofil buah vanili segar. Reaksi utama adalah

penggantian atom Mg2+ dalam klorofil oleh hidrogen di bawah kondisi asam

dengan membentuk peofitin. Selanjutnya piropeofitin a dan b sebagai hasil

degradasi peofitin a dan b dapat menimbulkan warna coklat (Eskin 1990). Kim et

al. (2003), meneliti perubahan kandungan klorofil pada adonan tepung yang

mengandung bubuk bayam (Spinacea oleracea) yang digoreng dalam minyak

kedelai pada suhu 1600C selama 1 menit dan disimpan dalam botol gelas. Setelah

diinkubasikan pada suhu 600C dalam kondisi gelap selama 12 hari, ternyata terjadi

penurunan klorofil, sedangkan kandungan peofitin meningkat lalu menurun.

Disamping peofitinisasi, enzim endogenous klorofilase mampu mengubah

klorofil menjadi klorofilida dengan hilangnya gugus fitol. Kombinasi kerja

klorofilase dan asam menyebabkan hilangnya Mg2+ dan gugus fitol, sehingga

membentuk peoforbida. Perlu dicatat bahwa seluruh reaksi perubahan klorofil ini

dapat berlangsung dengan adanya panas (Eskin 1990; Francis 1996).

EKSTRAKSI ENZIMATIK BUAH VANILI SEGAR

Penambahan 1 Jenis Enzim Komersial dengan Pelarut Air dan atau Etanol

Ekstraksi enzimatik buah vanili segar yang dilakukan dalam penelitian ini

menggunakan berbagai enzim komersial yang mampu mendegradasi dinding sel

buah vanili segar sekaligus mengubah glukovanilin menjadi vanilin. Data hasil

analisis kadar vanilin dan glukosa atas dasar berat kering ekstrak buah vanili segar

dapat dilihat pada Gambar 25.

Pada Gambar 25 terlihat bahwa ekstraksi vanili segar tanpa penambahan

enzim dengan pelarut air menghasilkan kadar vanilin paling rendah yakni sebesar

1.45%bk ekstrak. Sebaliknya kadar vanilin ekstrak tertinggi dicapai dengan

penambahan β-glukosidase+air+etanol yakni sebesar 15.97%bk ekstrak.

Perlakuan dengan enzim lainnya pun menghasilkan kadar vanilin yang lebih

tinggi dibanding ekstrak vanili segar tanpa enzim dan kontrol (ekstrak vanili

kering dengan pelarut air+etanol). Penambahan selulase+air, selulase+air+etanol,

pektinase+air, pektinase+air+etanol dan β-glukosidase+air, berturut-turut

menghasilkan kadar vanilin sebesar 4.84, 5.37, 4.20, 5.14 dan 14.19%bk ekstrak.

57

Hal ini disebabkan enzim berfungsi sebagai katalisator reaksi biokimia yang

mampu mengaktifkan senyawa lain secara spesifik. Seperti katalis lainnya, enzim

bekerja dengan menurunkan energi aktivasi sehingga reaksi berlangsung lebih

cepat. (http://wik ipedia.org/wiki/Enzyme 2006). Keberadaan sejumlah kecil enzim

dapat mengkatalisis biokonversi sejumlah besar substrat (Tucker 1995).

Gambar 25 Kadar vanilin dan glukosa ekstrak buah vanili kering (kontrol) dan vanili segar dengan penambahan satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol

Pada Gambar 25 dapat dilihat bahwa penambahan enzim β-glukosidase

dengan ataupun tanpa etanol menghasilkan kadar vanilin yang lebih tinggi

dibanding dengan perlakuan enzim lainnya. Hal ini dapat dipahami karena kadar

padatan terlarut yang dihasilkan dengan penambahan β-glukosidase adalah lebih

rendah dibanding penambahan dengan enzim selulase dan pektinase komersial

sehingga kadar vanilin per berat kering ekstrak lebih tinggi (Lampiran 5).

Kemungkinan lain penyebab lebih tingginya kadar vanilin yang dihasilkan dengan

penambahan β-glukosidase adalah persiapan sampel yang dilakukan yakni

pengeringan beku dengan penggilingan yang dapat menyebabkan dinding sel

11.95

24.35

32.91

55.96

90.26

49.45

74.91

3.28 1.45 1.534.84 5.37 4.20 5.14

14.19 15.97

3.05 3.29

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

kontrol air

air+etan

ol

selulase

+air

selulase

+air+e

tanol

pektina

se+air

pektina

se+air+

etanol

b-gluk

osidas

e+air

b-gluk

osidase

+air+e

tanol

perlakuan

kada

r (%

bk e

kstr

ak)

vanilin

glukosa

58

jaringan buah sebagian mengalami kerusakan sehingga enzim-enzim pendegradasi

dinding sel seperti selulase dan pektinase komersial tidak lagi berperan nyata.

Namun demikian, penambahan enzim selulase dan pektinase komersial

dengan atau tanpa etanol yakni penambahan selulase+air, selulase+air+etanol,

pektinase+air, pektinase+air+etanol tetap menghasilkan kadar vanilin lebih tinggi

dibanding perlakuan tanpa penambahan enzim. Hal ini disebabkan pektinase

komersial mengandung aktifitas karbohidrase yang meliputi arabinase, selulase,

β-glukanase, hemiselulase dan silanase, yang bersama-sama bekerja sinergis

untuk memecah jaringan dinding sel, sehingga kontak antara enzim dengan

substrat menjadi lebih mudah. Sedangkan selulase komersial mengandung

aktifitas enzim selulase yang mampu mengubah selulosa menjadi glukosa,

selobiosa dan polimer glukosa yang lebih tinggi (http://www.novozyme.com.

2005).

Menurut Taylor dan Leach (1995), beberapa enzim ditemukan bebas dalam

sitoplasma sel, tapi sebagian lainnya terikat pada membran dan sering kontak

langsung dengan substrat. Jika enzim dari luar digunakan untuk mempengaruhi

perubahan dalam sel atau jaringan, maka enzim dapat lebih mudah melalui

membran dan kontak dengan substrat. Metode ektraksi menggunakan enzim

pendegradasi dinding sel ini telah banyak dikembangkan di berbagai industri

karena mampu meningkatkan rendemen serta mempercepat reaksi pembentukan

produk. Penelitian yang dilakukan Sreenath et al. (1994), menunjukkan bahwa

penambahan enzim selulase, pektinase atau kombinasi keduanya pada konsentrasi

enzim 0.025% pada suhu 27-300C selama 30 menit ekstraksi menghasilkan nilai

perolehan kembali 81-86%. Nilai perolehan kembali ini lebih tinggi dibanding

sampel yang tidak mengalami perlakuan enzim yakni sebesar 72%.

Selain itu, Brunerie (1998) (U.S. patent 5705205) menunjukkan bahwa

penggunaan enzim pektinase dan hemiselulase 220 unit/g vanili segar bubuk yang

mengandung aktivitas enzim β-glukosidase 7.2 unit/g vanili segar bubuk, mampu

menghasilkan vanilin sebesar 3.9 g/100 g vanili segar bubuk. Nilai ini tercapai

setelah 7 jam inkubasi enzim pada suhu 370C, dengan pH sekitar 5 yang

merupakan pH alami buah dengan penambahan etanol 50%v/v setelah masa

59

inkubasi enzim berlangsung. Analisis vanilin dilakukan dengan menggunakan

High Performance Liquid Chromatography (HPLC).

Penelitian lainnya yang menggunakan enzim hidrolitik dalam pembuatan

ekstrak vanili segar dilakukan oleh Ruiz-Teran et al. (2001). Ia melaporkan bahwa

vanili segar dapat langsung diekstraksi, dimana reaksi terbaik adalah dengan

47,5% v/v larutan etanol selama 8 jam pada 500C, dalam 2 tahap reaksi enzimatik

menggunakan Viscozyme L. Novo diikuti dengan Celluclast yang merupakan 2

produk enzim komersial yang mengandung aktifitas pektinase dan selulase.

Analisis vanilin dilakukan dengan metode HPLC. Proses reaksi mempunyai

efektifitas tinggi dengan jumlah vanilin ekstrak 3.13 kali lebih tinggi dibanding

ekstrak vanili kering metode Soxhlet. Sedangkan proses kuring atau ekstraksi

klasik hanya menghasilkan 1.1-1.8%bk buah.

Pada Gambar 25 dapat dilihat pula bahwa penambahan selulase+air+etanol

mampu menghasilkan kadar vanilin yang lebih tinggi dibanding penambahan

pektinase+air+etanol. Walaupun perbedaannya tidak nyata, kadar vanilin yang

dihasilkan oleh perlakuan selulase+air pun lebih tinggi dibanding perlakuan

pektinase+air. Lebih tingginya kadar vanilin yang dihasilkan dengan penambahan

selulase komersial dibanding pektinase komersial kemungkinan besar disebabkan

selulase komersial yang digunakan dalam penelitian ini hanya mengandung

aktifitas selulase, dimana selulosa merupakan komponen utama penyusun dinding

sel buah yang sangat rigid (http://food_oregonstate_edu 2006; http://www-

biol.paisley.ac.uk/Courses/stfunmac/glossary/cellulose.html 2006). Pemutusan

jalinan selulosa ini akan mempermudah kontak β-glukosidase dengan substrat

sehingga dihasilkan kadar vanilin yang lebih tinggi. Mekanisme kerjanya yakni

enzim 1,4- β-D-glukan selobiohidrolase (C1) dari selulase merombak selulosa

tidak larut menjadi selulosa yang bersifat larut. Selanjutnya enzim lainnya dari

selulase yakni 1,4- β-D-glukan 4-glukanohidrolase (Cx) menghasilkan selobiosa

yang kemudian didegradasi menjadi glukosa oleh β-glukosidase (Eskin 1990).

Hasil penelitian ini sesuai dengan hasil percobaan yang dilakukan oleh Ruiz-

Teran et al. (2001), yang mendapatkan bahwa dengan penambahan enzim

Celluclast+air+etanol pada kondisi yang sama dengan percobaan ini (konsentrasi

enzim 1%, suhu 500C, dan waktu inkubasi 8 jam), menghasilkan kadar vanilin

60

yang lebih tinggi yakni sebesar 2.7%bk vanili segar, dibanding penambahan

enzim Viscozyme+air+etanol yakni sebesar 2.45%bk vanili segar.

Pada Gambar 25 dapat dilihat bahwa penggunaan etanol mampu

menghasilkan kadar vanilin yang lebih tinggi dibanding air. Perlakuan yang

paling signifikan perbedaannya adalah perlakuan β-glukosidase+etanol dan β-

glukosidase+air dengan kadar vanilin 14.19%bk ekstrak dan 15.97%bk ekstrak.

Perlu dicatat bahwa dalam percobaan ini penambahan etanol 47.5%v/v dalam

ekstraksi dilakukan selama 30 menit, melanjutkan proses ekstraksi enzimatik

dengan pelarut air yang telah berlangsung selama 8 jam. Hal ini bertujuan untuk

mempermudah pengamatan pengaruh etanol terhadap kadar vanilin yang

dihasilkan (tanpa terjadinya bias akibat pengaruh aktifitas enzim yang

ditambahkan) serta menghindari terjadinya perubahan struktur enzim yang

menyebabkan enzim tidak aktif. Pelarut organik polar seperti etanol akan

membatasi air esensial dari permukaan dan kemudian menyebabkan

ketidakstabilan enzim. Efek destabilisasi pelarut organik polar ini terutama karena

kompetisi antara enzim dan pelarut untuk mengikat molekul air (Goodenough

1995). Menurut Zaks (1991), pelarut organik mempengaruhi reaksi enzimatik

dengan berbagai cara. Pertama, pelarut mempengaruhi distribusi air antara enzim

dan medium reaksi. Kedua pelarut organik dapat langsung berinteraksi dengan

enzim, berpengaruh negatif terhadap konformasi yang aktif secara katalitik.

Terakhir, partisi dari substrat dan atau produk dari reaksi antara sisi aktif enzim

dan medium dapat mempengaruhi sejumlah parameter kinetik dan termodinamik

dari enzim. Klibanov (1993), menyatakan bahwa enzim benar-benar tidak aktif

dengan penggunaan pelarut organik sekitar 50-60%.

Diketahui bahwa konsentrasi air pada enzim adalah pengaruh yang paling

signifikan bagi aktifitasnya dalam pelarut organik. Hilangnya air esensial

memiliki efek kuat dalam menurunkan aktifitas enzim. Oleh sebab itu, saat

kebutuhan air terpenuhi lagi, aktifitas katalitik kembali pulih. Penambahan air

pada pelarut organik polar menghasilkan peningkatan air yang moderat pada

enzim, sehingga akan lebih banyak lagi air yang perlu ditambahkan dibanding

pelarut non polar (Zaks 1991). Kemungkinan penggunaan enzim dalam pelarut

organik polar konsentrasi rendah sehingga tidak mengganggu jumlah air esensial

61

pada permukaan enzim ini, dibuktikan oleh Waliszewski et al. (2002). Ia

mendapatkan bahwa ekstraksi buah vanili segar selama 72 jam dengan etanol 5%

tidak menurunkan kinetik dari enzim Crystalzyme PML-MX, Econase Ce-S,

Stonenzyme Plus, Macerex, Cellubrix L dan Cellulase. Disisi lain, Zymafilt L-300

dan Novozym 342 yang memiliki aktifitas enzimatik lebih rendah dalam air, dapat

meningkat aktifitasnya yakni sebesar 10 dan 12.5% dalam etanol 5% dan

aktifitasnya lebih meningkat lagi dalam etanol 10%. Selanjutnya Waliszewski et

al. (2003), menemukan bahwa setelah 26 jam dilakukan pretreatment ekstrak

buah vanili dengan Novozym 342, Crystalzyme PML-MX dan Zymafilt L-300 pada

konsentrasi etanol 5-12% serta 15 hari ekstraksi dengan etanol 60%, konsentrasi

vanilin yang dianalisis dengan HPLC adalah 0.52, 0.59 dan 1.15%bk vanili segar.

Sedangkan kadar vanilin blanko hanya 0.18%bk vanili segar. Jika buah vanili

diperlakukan dengan cara yang sama, sampai 5.22%bk dapat diperoleh setelah 30

hari ekstraksi dan blanko hanya mencapai 2.56%bk vanili segar.

Reaksi yang dikatalisis enzim pada umumnya berlangsung dalam

lingkungan aquous, yakni lingkungan reaksi dimana air berperan sebagai pelarut

utama. Air secara mutlak diperlukan untuk aktifitas katalitik enzim. Hal ini

disebabkan air berperan secara langsung maupun tidak langsung dalam seluruh

interaksi non kovalen (ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, interaksi elektrostatik

dan gaya van der Walls) yang mempertahankan konformasi katalitik alami dari

enzim (Price dan Stevens 1991; Jakubowski 2006). Selain itu air juga berperan

dalam dinamika enzim (Zaks 1991).

Namun demikian, tingginya kadar vanilin ekstrak yang dihasilkan dengan

adanya penambahan etanol selama 30 menit setelah reaksi enzimatik berlangsung

dibanding tanpa etanol, menunjukkan bahwa meskipun air merupakan medium

reaksi konvensional, namun air memiliki beberapa keterbatasan. Keterbatasan air

sebagai pelarut antara lain bahwa pada umumnya senyawa penting dalam bahan

pangan tidak larut dalam air dan air sering memicu terjadinya reaksi samping

yang tidak diinginkan. Selain itu, dalam beberapa reaksi kimia, hanya sedikit

jumlah produk yang terbentuk serta karena tingginya titik didih air maka air jauh

dari lingkungan yang ideal bagi perolehan kembali produk (Jakubowski 2006).

62

Kelarutan vanilin yang lebih tinggi dalam etanol dibanding air berhubungan

dengan polaritas. Walaupun etanol bersifat hidrolitik, namun memiliki polaritas

yang lebih rendah (0.654) dibanding air (1), sehingga ia lebih efektif melarutkan

senyawa vanilin yang tidak begitu polar (Reichardt 1988). Dalam hal ini berlaku

hukum ‘like dissolves like’, komponen yang kurang polar akan terlarut dalam

pelarut yang kurang polar dan sebaliknya (http://en.wikipedia.org/wiki 2006).

Disamping itu, meskipun proses ekstraksinya tidak sempurna, pelarut organik

mampu melarutkan komponen flavor yang masih terikat dalam jaringan selulosa

atau lignin. Selain etanol, pelarut yang dapat digunakan untuk mengekstrak vanili

adalah pentana dan eter, seperti yang telah dilakukan Perez-Silva et

al. (2005). Sebanyak 64 komponen volatil teridentifikasi dalam ekstrak

pentana/eter (1/1) yang merupakan perlakuan terbaik, melalui analisis GC-MS.

Ekstraksi padat-cair berhubungan dengan pemisahan komponen yang

diinginkan (padatan) dari bahan pangan menggunakan cairan (pelarut) yang dapat

melarutkan padatan. Selama proses ekstraksi (holding time) terjadi transfer massa

padatan dari bahan pangan ke pelarut, yang terjadi 3 tahap yakni padatan terlarut

dalam pelarut, larutan bergerak melalui partikel bahan pangan ke permukaan

bahan pangan dan larutan menjadi terdispersi dalam pelarut (Fellow 2000).

Pada Gambar 25 dapat dilihat bahwa perlakuan tanpa penambahan enzim

menghasilkan kadar glukosa ekstrak paling rendah yakni sebesar 3.05%bk.

Sebaliknya kadar glukosa ekstrak tertinggi dicapai dengan penambahan

pektinase+air+etanol yakni sebesar 90.26%bk dengan kadar padatan terlarut

tertinggi yakni sebesar 120brix (Lampiran 6). Perlakuan enzim lainnya pun

menghasilkan kadar glukosa lebih tinggi dibanding perlakuan tanpa enzim serta

ekstrak vanili kering dengan pelarut air+etanol (kontrol), dengan kadar glukosa

berturut-turut sebesar 3.05, 3.29 dan 11.95%bk ekstrak. Sedangkan perlakuan

selulase+air, selulase+air+etanol, pektinase+air, β-glukosidase+air dan β-

glukosidase+air+etanol berturut-turut menghasilkan kadar glukosa sebesar 24.35,

32.91, 55.96, 49.45 dan 74.91%bk.

Hal yang mencolok dari percobaan ini adalah pembentukan vanilin yang

tinggi dalam ekstrak vanili segar tidak selalu diimbangi dengan tingginya glukosa

yang terbentuk (Gambar 25). Enzim β-glukosidase berperan nyata dalam

63

pembentukan vanilin. Sedangkan produksi glukosa tertinggi dihasilkan dengan

penambahan pektinase komersial. Hal ini kemungkinan besar disebabkan

pektinase komersial merupakan enzim kasar selulase dari Aspergillus sp. yang

memproduksi endo-β-glukanase dan β-glukosidase dalam jumlah besar, dengan

sedikit ekso-β-glukanase (http://www.fao.org/docrep/w7241e/w7241e08.htm

2005). Selain itu, pektinase komersial mengandung aktifitas karbohidrase lainnya

yakni arabinase, β-glukanase, hemiselulase dan silanase. Hal ini memperkuat

dugaan bahwa glukosa di dalam ekstrak vanili tidak hanya bersumber dari

prekursor vanilin, tapi juga berasal dari komponen karbohidrat (termasuk serat

pangan) buah vanili segar.

Perbedaan fungsi enzim ini sangat berhubungan dengan spesifisitasnya dan

hal ini sangat menguntungkan bagi industri pangan. Menurut Tucker (1995),

mekanisme yang jelas sebenarnya belum diketahui pasti, tapi konsep kunci dan

anak kunci mengindikasikan bahwa bentuk sisi aktif enzim secara struktur harus

cocok dengan molekul substrat. Ini berarti bahwa enzim pada umumnya memiliki

spesifisitas yang tinggi untuk substratnya, sehingga mereka dapat mengkatalisis

substrat. Misalnya glukosaoksidase (EC.1.1.3.4) mengkatalisis konversi D-

glukosa menjadi D-glukonat. Spesifisitas dapat juga terjadi pada tipe ikatan.

Misalnya α-amilase (EC. 3.2.1.1) selektif terhadap ikatan α antara residu glukosa

dalam pati. Sedangkan selulase (EC. 3.2.1.4) selektif terhadap ikatan β antara

molekul glukosa dalam selulosa. Enzim yang berbeda dapat juga selektif terhadap

cara mereka berinteraksi dengan molekul substrat yang sama. Misalnya kerja α-

amilase dan β-amilase (EC. 3.2.1.2) terhadap pati menghasilkan pembentukan

glukosa dan maltosa. Akan tetapi, tidak semua enzim menunjukkan spesifisitas

ekstrim. Beberapa protease yang spesifik terhadap protein, menunjukkan

spesifisitas rendah dengan kemampuannya menghidrolisa ikatan peptida.

Pada Gambar 25 dapat dilihat bahwa penggunaan etanol mampu

menghasilkan kadar glukosa yang lebih tinggi dibanding air. Perlakuan yang

paling signifikan perbedaannya adalah perlakuan pektinase+air dan

pektinase+air+etano l dengan kadar glukosa 55.96%bk ekstrak dan 90.26%bk

ekstrak. Diketahui pula bahwa ekstraksi enzimatik vanili segar dengan etanol

ternyata menghasilkan kadar glukosa lebih tinggi dibanding kontrol (ekstraksi

64

vanili kering dengan pelarut air+etanol) yang memiliki kandungan glukosa

3.28%bk ekstrak.

Berdasarkan percobaan pada tahap ini, penambahan enzim β-glukosidase

menghasilkan kadar vanilin tertinggi serta semua perlakuan yang menggunakan

pelarut air+etanol menghasilkan kadar vanilin lebih tinggi dibanding pelarut air

sehingga pada tahapan penelitian berikutnya, ekstraksi enzimatik dilakukan

dengan pelarut air+etanol. Adapun ekstrak vanili segar yang dihasilkan dari

penambahan 1 jenis enzim dapat dilihat pada Gambar 26.

Gambar 26 Ekstrak buah vanili segar dengan penambahan satu jenis enzim

komersial dengan pelarut air dan atau etanol, dari kiri ke kanan: air, air+etanol, selulase+air selulase+air+etanol, pektinase+air, pektinase+air+etanol, β-glukosidase+air, β-glukosidase+air+etanol

Pada Gambar 26 dapat dilihat bahwa setiap perlakuan menghasilkan

penampakan visual ekstrak yang berbeda. Perlakuan dengan penambahan etanol

menghasilkan warna coklat yang lebih terang dan jernih dibanding perlakuan

tanpa etanol. Hal ini kemungkinan besar disebabkan gum tidak ikut larut serta pati

akan mengendap dengan adanya alkohol. Perbedaan yang paling nyata terlihat

pada perlakuan dengan penambahan enzim.

Menurut Purseglove et al. (1981), warna coklat secara progresif meningkat

jika kandungan etanol dalam ekstrak dinaikan hingga 60%v/v. Kandungan etanol

lebih dari 70%v/v menyebabkan warna yang terbentuk lebih terang dan dengan

95%v/v etanol sangat sedikit warna yang terekstrak. Kandungan etanol 50-

60%v/v akan menghasilkan ekstrak dengan flavor dan warna yang baik

65

Disamping itu, produksi glukosa dan vanilin yang lebih tinggi pada ekstrak

dengan penambahan etanol (Gambar 25), menyebabkan lebih kuatnya warna

coklat yang terbentuk, sebagai akibat reaksi pencoklatan non enzimatik yakni

pembentukan melanoidin pada reaksi Maillard, pembentukan kuinon pada reaksi

enzimatik serta hilangnya Mg2+ pada gugus porfirin klorofil buah vanili.

Penambahan 2 atau 3 Jenis Enzim Komersial dengan Pelarut Air dan Etanol

Untuk mengetahui peran enzim selulase, pektinase dan β-glukosidase

komersial lebih jauh maka dilakukan percobaan dengan mengkombinasikan

enzim-enzim tersebut. Adapun pengaruh kombinasi enzim terhadap kadar vanilin

dan glukosa yang dihasilkan dapat dilihat pada Gambar 27.

3.28 4.35 5.81 7.56 4.4611.95

62.84 60.10

91.58

63.56

0102030405060708090

100

kontrol

selulase

+pekt

inase

selulase

+b-glu

kosida

se

pektina

se+b-g

lukosid

ase

selulase

+pekt

inase+

b-gluk

osidas

e

perlakuan

kada

r (%

bk e

kstr

ak)

Gambar 27 Kadar vanilin dan glukosa ekstrak buah vanili kering

(kontrol) dan vanili segar dengan penambahan 2 atau 3 jenis enzim komersial dengan pelarut air+etanol

Pada Gambar 27 dapat dilihat bahwa perlakuan dengan penambahan

pektinase+β-glukosidase menghasilkan kadar vanilin ekstrak tertinggi yakni

sebesar 7.56%bk, diikuti perlakuan selulase+β-glukosidase sebesar 5.81%bk,

selulase+pektinase+β-glukosidase sebesar 4.46%bk serta selulase+pektinase

yakni sebesar 4.35%bk ekstrak. Kombinasi enzim dengan β-glukosidase yang

menghasilkan kadar vanilin lebih tinggi, memperkuat dugaan bahwa vanilin yang

dilepaskan dari glukosida merupakan hasil kerja enzim ini. Disisi lain, terlihat

vanilin

glukosa

66

bahwa penambahan kombinasi enzim komersial menghasilkan kadar vanilin lebih

tinggi dibanding kontrol (ekstrak vanili kering dengan pelarut air+etanol) yang

memiliki kadar vanilin 3.28%bk ekstrak.

Pada Gambar 27 dapat dilihat bahwa penambahan pektinase+β-glukosidase

menghasilkan kadar vanilin ekstrak tertinggi yakni sebesar 7.56%bk, walaupun

nilai ini jauh lebih rendah dibanding penambahan β-glukosidase+air dan β-

glukosidase+air+etanol (Gambar 25), sebagai akibat kadar padatan terlarut yang

dihasikan perlakuan pektinase+β-glukosidase lebih tinggi yakni sebesar 2.98%

(Lampiran 7). Perbandingan padatan terlarut ekstrak vanili segar yang dihasilkan

melalui penambahan kombinasi enzim komersial selulase, pektinase dan β-

glukosidase dengan penambahan enzim tunggal β-glukosidase dapat dilihat pada

Gambar 28.

Gambar 28 Padatan terlarut ekstrak vanili segar, dari kiri ke kanan:

selulase+pektinase, selulase+β-glukosidase, pektinase+β-glukosidase, selulase+pektinase+β-glukosidase, β-glukosidase

Sebaliknya kadar vanilin ekstrak paling rendah adalah dengan perlakuan

selulase+pektinase yakni sebesar 4.35%bk, bahkan nilai ini lebih rendah

dibanding penambahan 1 jenis enzim yakni perlakuan selulase+air,

selulase+air+etanol, pektinase+air+etanol, β-glukosidase+air dan β-

glukosidase+air+etanol. Hal ini kemungkinan besar terjadinya efek

penghambatan apabila 2 atau 3 jenis enzim digunakan sekaligus.

Apabila diperhatikan lebih jeli, dari Gambar 25 diketahui bahwa apabila

enzim yang ditambahkan hanya selulase saja maka akan menghasilkan kadar

vanilin yang lebih tinggi dibanding penambahan dengan pektinase. Namun

67

apabila masing-masing enzim tersebut dikombinasikan penggunaannya dengan β-

glukosidase, maka perlakuan pektinase+β-glukosidase menghasilkan kadar

vanilin lebih tinggi dibanding perlakuan selulase+β-glukosidase. Hal ini

disebabkan kadar padatan terlarut yang dihasilkan perlakuan pektinase+β-

glukosidase lebih rendah yakni sebesar 2.98%. Penambahan pektinase komersial

yang mengandung aktifitas pektinase mampu menurunkan viskositas dan

menyebabkan partikel keruh membentuk agregat membentuk unit yang lebih

besar sehingga dengan mudah dipisahkan melalui sentrifugasi atau filtrasi (Pilnik

dan Voragen 1991). Enzim pektik yang berasal dari Aspergillus sp. biasanya

mengandung enzim pektinesterase, poligalakturonase dan pektin liase.

Pektinesterase berperan dalam deesterifikasi enzimatik pektin, menyebabkan

koagulasi kalsium pektat dan klarifikasi alami yang diinginkan dalam jus jeruk.

Selanjutnya endopoligalakturonase dan eksopoligalakturonase menghidrolisis

depolimerisasi asam pektik yang juga menyebabkan penurunan viskositas.

Keberadaan enzim poligalakturonase ini dapat diuji dengan pengukuran viskositas

larutan pektat dan analisis derajat gula pereduksi misalnya dengan metode

Somogy Nelson. Sedangkan pektin liase adalah endo enzim yang dapat

memotong asam poligalakturonik teresterifikasi tinggi secara langsung sehingga

menyebabkan penurunan viskositas yang cepat (Pilnik dan Rombouts 1981).

Disamping itu, pektinase komersial mengandung campuran aktifitas

karbohidrase yang meliputi arabinase, selulase, β-glukanase, hemiselulase dan

silanase. Diketahui bahwa enzim terutama bekerja melalui maserasi jaringan buah

vanili, merusak dinding sel untuk melepaskan komponen flavor yang terikat.

Dinding sel tanaman merupakan struktur yang sangat kompleks, dimana

mengandung jalinan selulosa, silan, pektin dan lain- lain. Degradasi dinding sel

akan lebih baik dilakukan melalui kombinasi beberapa aktifitas enzim seperti

selulase, silanase dan pektinase dibanding penggunaan enzim tunggal

(http://www.biocatalysts.com. 2005).

Pada Gambar 27 dapat dilihat bahwa perlakuan pektinase+β-glukosidase

menghasilkan kadar glukosa ekstrak tertinggi yakni sebesar 91.58%bk.

Sebaliknya kadar glukosa ekstrak paling rendah adalah dengan perlakuan

selulase+β-glukosidase yakni sebesar 60.10%bk. Kombinasi enzim dengan

68

pektinase komersial yang menghasilkan kadar glukosa lebih tinggi memperkuat

dugaan bahwa glukosa yang terbentuk juga berasal dari karbohidrat buah, dimana

peran pektinase komersial sangat dominan.

Berdasarkan percobaan pada tahap ini, penambahan pektinase+β-

glukosidase menghasilkan kadar vanilin ekstrak tertinggi, namun masih lebih

rendah dibanding penambahan β-glukosidase. Oleh sebab itu, percobaan tahap

berikutnya adalah optimasi konsentrasi serta waktu inkubasi β-glukosidase.

Adapun ekstrak vanili segar yang dihasilkan dari penambahan kombinasi enzim

dapat dilihat pada Gambar 29.

Gambar 29 Ekstrak vanili segar dengan penambahan 2 atau 3 jenis enzim

komersial dengan pelarut air+etanol, dari kiri ke kanan: selulase+pektinase, selulase+β-glukosidase, pektinase+β-glukosidase, selulase+pektinase+β-glukosidase

Pada Gambar 29 dapat dilihat perbedaan warna coklat yang mencolok akibat

reaksi pencoklatan enzimatik maupun non enzimatik yang terjadi selama

ekstraksi. Perlakuan pektinase+β-glukosidase yang mengandung kadar glukosa

tertinggi (Gambar 27) menghasilkan warna coklat paling kuat. Dalam kasus ini,

walaupun kadar vanilin perlakuan selulase+β-glukosidase+air+etanol lebih tinggi

dibanding perlakuan selulase+pektinase, tapi warna coklat yang terbentuk justru

lebih muda. Fenomena ini memperkuat dugaan bahwa reaksi yang paling berperan

dalam pembentukan warna coklat adalah reaksi Maillard dengan glukosa sebagai

substrat. Hal ini ditunjukkan dengan kadar glukosa terendah pada perlakuan

selulase+β-glukosidase.

69

OPTIMASI EKSTRAKSI ENZIMATIK

Penentuan Konsentrasi Optimum Enzim β -glukosidase

Penentuan konsentrasi optimum enzim β-glukosidase penting dilakukan

agar penggunaaan enzim lebih efektif dan efisien. Adapun data penentuan

konsentrasi optimum β-glukosidase dapat dilihat pada Gambar 30.

1.52

15.62 16.09 16.99 17.15 16.72 16.57

76.7573.95

80.61 82.07 79.98 79.12

3.120

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 10 20 30 40 50 60

konsentrasi (unit)

kada

r (%

bk e

kstr

ak)

Gambar 30 Penentuan konsentrasi optimum enzim β-glukosidase

Pada Gambar 30 dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan kadar vanilin dari

1.52%bk (tanpa penambahan enzim β-glukosidase) menjadi 17.15%bk setelah

penambahan 40 unit aktifitas β-glukosidase. Hal ini menunjukkan adanya aktifitas

enzim dan rendahnya kandungan senyawa penghambat seperti ion logam berat

dalam sistem reaksi (Tucker 1995). Sering diasumsikan bahwa laju reaksi

berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. Hal ini benar adanya jika konsentrasi

substrat melebihi konsentrasi enzim seperti terlihat pada perlakuan 0 unit hingga

40 unit. Dengan kata lain, pada konsentrasi enzim yang rendah, seluruh bagian

aktif enzim telah diduduki oleh substrat yang berlebih sehingga laju reaksi

pembentukan produk berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. Sebaliknya

pada konsentrasi enzim yang sangat tinggi, penambahan enzim tidak lagi

meningkatkan laju reaksi. Hal ini terjadi pada penambahan enzim β-glukosidase

40 unit, dimana vanilin sebagai produk hasil reaksi tidak lagi mengalami

peningkatan walaupun konsentrasi enzim ditambah. Bahkan terlihat terjadinya

vanilin

glukosa

70

penurunan dari perlakuan 40 unit hingga 60 unit berturut-turut sebesar 17.15,

16.72 dan 16.57%bk ekstrak. Disamping substrat yang habis, hal ini bisa

disebabkan adanya penghambat dalam jumlah besar sehingga mengganggu

aktifitas enzim. Penghambat adalah molekul yang secara alami ada atau molekul

sintetik yang menurunkan atau menghilangkan aktifitas enzim. Beberapa

penghambat dapat mengikat enzim sangat kuat dan menginaktifkannya secara

irreversible (http://wikipedia.org/wiki/Enzyme, 2006).

Pada Gambar 30 dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan kadar glukosa dari

3.12%bk (tanpa penambahan enzim β-glukosidase) menjadi 82.07%bk ekstrak

setelah penambahan 40 unit aktifitas β-glukosidase. Selanjutnya kadar glukosa

menurun kembali seiring dengan menurunnya kadar vanilin.

Berdasarkan percobaan pada tahap ini, konsentrasi optimum penambahan

enzim β-glukosidase adalah 10 unit karena menghasilkan kadar vanilin ekstrak

yang tidak berbeda nyata dengan penambahan enzim β-glukosidase pada

konsentrasi yang lebih tinggi. Oleh sebab itu, percobaan tahap berikutnya adalah

optimasi waktu inkubasi β-glukosidase, dimana β-glukosidase yang ditambahkan

sebesar 10 unit. Ekstrak vanili segar yang dihasilkan dari penambahan β-

glukosidase sebanyak 0, 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 unit dapat dilihat pada Gambar

31.

Dari Gambar 31 terlihat bahwa perlakuan dengan berbagai konsentrasi

enzim β-glukosidase menghasilkan penampakan visual yang tidak terlalu berbeda.

Namun demikian, apabila diperhatikan lebih jeli pembentukan warna coklat

ekstrak pada penambahan β-glukosidase 10 unit hingga 60 unit mengikuti trend

peningkatan kadar glukosa (Gambar 29).

71

Gambar 31 Ekstrak vanili segar dengan konsentrasi enzim β-glukosidase yang berbeda

Penentuan Waktu Inkubasi Optimum Enzim β -glukosidase

Penentuan waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase dilakukan dengan

memvariasikan waktu inkubasi enzim selama 0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 24 jam

dengan penambahan enzim β-glukosidase sebanyak 10 unit. Data penentuan

waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase dapat dilihat pada Gambar 32.

Gambar 32 Penentuan waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase

60 unit 10 unit 50 unit 40 unit 30 unit 20 unit 0 unit

0.93

14.5014.5214.6715.0015.4915.041.96

73.8674.65 73.86 71.76 71.35 75.10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 4 8 12 16 20 24

waktu (jam)

kada

r (%

bk e

kstr

ak)

vanilin

glukosa

72

Pada Gambar 32 dapat dilihat bahwa kadar vanilin mengalami peningkatan

hingga mencapai optimum 15.49%bk ekstrak pada perlakuan 8 jam dan menurun

kembali menjadi 14.50% pada perlakuan 24 jam. Pada saat awal pengamatan,

kadar vanilin yang dihasilkan berbanding lurus dengan bertambahnya waktu.

Namun sejalan dengan berlalunya waktu tersebut, kadar vanilin tidak mengalami

peningkatan lagi.

Pada Gambar 32 terlihat bahwa laju produksi awal mungkin linier, tapi

selanjutnya laju reaksi mulai menurun. Beberapa enzim dapat menunjukkan laju

awal linier hanya untuk beberapa menit saja, sedangkan enzim lainnya lebih dari

beberapa jam. Hilangnya aktifitas seiring waktu ini, dapat menguntungkan jika

keberadaan aktifitas enzim pada produk akhir tidak diinginkan. Akan tetapi,

hilangnya aktifitas enzim, jika masih diperlukan dalam proses, justru dapat

menurunkan efisiensi dan menuntut adanya biaya tambahan.

Selama tahap awal reaksi, ketika konsentrasi substrat diasumsikan konstan,

reaksi enzim ada pada orde 0 terhadap pembentukan produk. Tapi kenyataannya,

konsentrasi substrat menurun seiring waktu sehingga reaksi mengikuti orde 1.

Alasan lain mengapa laju enzim menurun seiring waktu adalah penghambatan

oleh produk yang terbentuk serta inaktivasi enzim akibat molekul-molekul enzim

yang tidak stabil. Dalam hal ini aktifitas enzim yang paling penting tergantung

pada molekul protein yang dapat mempertahankan struktur 3 dimensinya secara

tepat (Tucker 1995).

Pada Gambar 32 dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan kadar glukosa dari

1.96%bk ekstrak (tanpa penambahan enzim β-glukosidase) menjadi 74.65%bk

ekstrak setelah penambahan β-glukosidase 40 unit. Selanjutnya kadar glukosa

menurun kembali seiring dengan menurunnya kadar vanilin hingga perlakuan 20

jam. Namun berbeda dengan kadar vanilin, perlakuan 24 jam inkubasi

menyebabkan kadar glukosa meningkat kembali menjadi 75.10%bk ekstrak. Hal

ini kemungkinan besar disebabkan pada waktu inkubasi 24 jam dimungkinkan

senyawa-senyawa penghasil glukosa selain prekursor vanilin yang sukar

didegradasi dapat terurai. Meski demikian peningkatan kadar glukosa pada waktu

inkubasi 24 jam tersebut tidak terjadi signifikan.

73

Pada umumnya, selama ekstraksi, holding time harus cukup agar pelarut

mampu melarutkan solut dan untuk perubahan komposisi sehingga mencapai

kesetimbangan. Waktu yang diperlukan tergantung pada kelarutan solut terhadap

pelarut dan juga tergantung pada beberapa faktor, antara lain suhu dan luas

permukaan padatan yang terekspos dengan pelarut (Fellow 2000).

Berdasarkan percobaan pada tahap ini, waktu inkubasi optimum bagi

aktifitas enzim β-glukosidase adalah selama 4 jam karena menghasilkan kadar

vanilin ekstrak yang tidak berbeda nyata dengan waktu inkubasi yang lebih lama.

Adapun ekstrak vanili segar yang dihasilkan dengan enzim β-glukosidase selama

0, 4, 8, 12, 16, 20 dan 24 jam dapat dilihat pada Gambar 33.

Gambar 33 Ekstrak vanili segar dengan waktu inkubasi enzim β-glukosidase yang berbeda

Pada Gambar 33 terlihat bahwa perlakuan waktu inkubasi yang berbeda

akan menghasilkan warna ekstrak vanili segar yang berbeda pula. Penampakan

warna yang paling mencolok adalah perlakuan dengan waktu inkubasi 0 jam yang

berwarna hijau kekuningan. Apabila waktu inkubasi ditingkatkan maka warna

menjadi lebih coklat sesuai dengan kandungan vanilin dan glukosa yang

terbentuk.

24jam 20jam 16jam 12jam 8jam 4jam 0jam

74

KESIMPULAN DAN SARAN

KESIMPULAN

Vanili segar dan kering yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kadar

air 83.50% dan 20.48%, vanilin 0.76%bk dan 1.63%bk serta serat pangan

10.17%bk dan 9.84%bk. Ekstrak vanili kering sebagai kontrol mengandung

vanilin 3.28%bk ekstrak dan glukosa 11.95%bk ekstrak. Adapun suhu optimum

bagi aktifitas enzim β-glukosidase adalah 500C yang menghasilkan kadar vanilin

16.18%bk ekstrak dan glukosa 75.85%bk ekstrak. Untuk perlakuan dengan 1

jenis enzim komersial, kadar vanilin ekstrak tertinggi dicapai dengan perlakuan

β-glukosidase+air+etanol yakni sebesar 15.97%bk ekstrak dan kadar glukosa

tertinggi dicapai dengan penambahan pektinase+air+etanol yakni sebesar

90.26%bk. Diketahui bahwa seluruh perlakuan yang menggunakan etanol

menghasilkan kadar vanilin lebih tinggi dibanding air. Sedangkan untuk

perlakuan dengan 2 atau 3 jenis enzim komersial, kadar vanilin dan glukosa

ekstrak tertinggi dicapai dengan perlakuan pektinase+β-glukosidase yakni sebesar

7.56%bk ekstrak dan 90.26%bk ekstrak. Selanjutnya diperoleh data bahwa

konsentrasi optimum bagi aktifitas enzim β-glukosidase adalah 10 unit yang

menghasilkan kadar vanilin sebesar 15.62%bk ekstrak dan glukosa 73.95%bk

ekstrak. Sedangkan waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase adalah 4 jam

dengan kadar vanilin 15.04%bk ekstrak dan glukosa 73.86%bk ekstrak.

Berdasarkan hal tersebut di atas maka dapat direkomendasikan bahwa

ekstraksi terbaik diperoleh melalui penambahan β-glukosidase 10 unit terhadap

0.5901 g bk buah vanili segar menggunakan shaker water bath terkontrol 150

rpm pada suhu 500C selama 4 jam, yang selanjutnya ditambahkan etanol

47.5%v/v selama 30 menit. Kondisi ekstraksi ini mampu menghasilkan kadar

vanilin 4.6 kali lebih tinggi dibanding metode ekstraksi konvensional yang

menggunakan buah vanili kering.

75

SARAN

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai kadar glukovanilin dalam

buah vanili segar. Selain itu analisis karakteristik dan evaluasi sensori ekstrak

vanili segar yang diproses secara enzimatik penting dilakukan terutama untuk

mengetahui komponen yang berkontribusi dalam pengembangan flavor sehingga

lebih jauh dapat pula diketahui peran kuring yang selama ini dilakukan.

76

DAFTAR PUSTAKA

Aman P, Westerlund E. 1996. Cell Wall Polysaccharides: Structural, Chemical, And Analytical Aspect. Di dalam: Eliason AC, editor. Carbohydrates in Food, New York: Marcel Dekker Inc.

Anandaraj M, Rema J, Sasikumar B. 2001. Vanilla. Di dalam: Rema J, Madan

MS, editor. Calicut, Kerala:Modern Graphic. [AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 1997. Official Methode of

Analysis of the Association of Official Analytical Chemist. Ed ke-14. Virginia: Arlington Inc.

[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 1998. Official Methode of

Analysis of the Association of Official Analytical Chemist. Ed ke-14. Virginia: Arlington Inc.

Apriyantono A, Fardiaz D, Puspitasari NL, Sedarnawati, Budiyanto S. 1989.

Analisis Pangan; Petunjuk Laboratorium. PAU, Institut Pertanian Bogor: IPB Pr.

Asp Johhanson, Hallmer, Siljestorm. 1993. Metode Analisis Komposisi Zat Gizi

Makanan. Di dalam Sulaeman A, Anwar F, Rimbawan, Marliyati SA, editor; Bogor:Jur. GMSK, Fak. Pertanian, IPB.

[BSN] Badan Standarisasi Nasional. 1990. SNI 01-0010-1990. Jakarta. [BPS] Biro Pusat Statistik. 2004. Statistik Perkebunan Indonesia; Panili-

Statistical Estate Crops of Indonesia (Vanilla) 2001-2003. Jakarta: Deptan Dirjen Bina Produksi Perkebunan.

Brunerie PM. 6 Januari 1998. Process of the production of natural vanilla extracts

by enzymatic processing of green vanilla pods and extract thereby obtained. US patent 5705205.

Chaplin MF, Bucke C. 1990. Enzyme Technology. Cambridge: Cambridge

University Press. hlm. 1-39. Chaplin M. 2004. Effect of temperature and pressure. [terhubung berkala].

http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/temperature [5 Mei 2006]. Chaplin M. 2004. Pektin. [terhubung berkala]. http://www.lsbu.ac.uk/water/ [26

Februari 2005]. Cowley E. 1973. Vanilla and its use. Di dalam: Proceedings of the Conference on

Spices; Tropical Product Institute, England: Bush Boake Allen Ltd.

77

Davidek J, Velisek J, Pokorny J. 1990. Chemical Change During Food Processing. Amsterdam: Elsevier Science Pub.Comp.Inc.

de Guzman CC, Siemonsma JS. 1999. Vanilla planifolia HC. Andrews. Di dalam:

Spices;Plant Resources of South East Asia 13, PROSEA Foundation, Bogor, Indonesia, No.13.

[Deptan] Departemen Pertanian, 2004. Vanili (Vanilla Planifolia Andrews);

Pedoman Teknologi Pengolahan. Jakarta: Deptan Dirjen Bina Pengolahan dan Pemasaran Hasil Pertanian.

Dordick JS. 1991. An Introduction to Industrial Biocatalysis. Di dalam: Dordick

JS, editor. Biocatalys for Industry. Iowa: Plenum Press. hlm. 3-19. Eskin NAM. 1990. Biochemistry of Food. Ed ke-2. New York: Academic Press

Inc. Fellow P. 2000. Separation and Concentration of Food Components. Di dalam:

Food Processing Technology. Ed ke-2. Inggris: CRC Press. Francis FJ. 1996. Pigments and Other Colorants. Di dalam: Fennema OR, editor.

Food Chemistry. Ed ke-3. USA: Marcel Dekker Inc. Furth P, Cox D. 2004. Spices and ethnic foods; the spice market expand. Food

Technology 58(8):30-32. Goodenough PW. 1995. Food Enzymes and the New Tehchnology. Di dalam:

Tucker dan Woods LFJ, editor. Enzyme in Food Processing. Ed ke-2. London: Chapman & Hall.

Hanum T. 1997. Perubahan kadar vanilin, aktifitas β-glukosidase dan oksidase

selama pengolahan pasca panen panili (Vanilla planifolia). Bul. Teknol. dan Industri Pangan. Vol.8. No.1.

Hayani E, Fatimah T. 2002. Teknik penentuan kadar vanilin secara

spektrofotometri. Buletin Teknik Pertanian, Vol.7, No.1. Havkin-Frenkel D, French JC, Graft NM, Joel DM. 2004. Interrelation of curing

and botany in vanilla (Vanilla planifolia) bean. Di dalam: Craker LE et al., editor. Proc. XXVI IHC-Future for Medical and Aromatic Plants. USA: Can. Int. Dev. Agency (CIDA), Acta Hort. 629.

Heath HB, Reineccius G. 1986. Flavoring materials of natural origin. Di dalam

Flavor Chemistry and Technology. New York:AVI Book-Van Nostrand Reinhold Company.

Howard RL, Abotsi E, Jansen van Rensburg EL, Howard S. 2003. Lignosellulosa biotechnology : issues of bioconversion and enzyme production, Review,

78

African J of Biotechnology, 2(12):602-619 [terhubung berkala]. http://www.academicjournals.org/AJB [26 Februari 2005].

http://en.wikipedia.org/wiki [8 Agustus 2006].

http://en.wikipedia.org./wiki/Freeze_drying [8 Agustus 2006].

http://en.wikipedia.org/wiki/Pectinase) [8 Agustus 2006].

http://food_oregonstate_edu [19 Mei 2006].

http://wikipedia.org/wiki/Enzyme, 2006 [12 Mei 2006].

http://worhington-biochem.com [3 Maret 2005].

http://www.amadeusvanillabeans.com/faqs/ -13k-, 2006 [13 Juni 2006].

http://www.biocatalysts.com., 2005. The use of enzymes in vanilla extraction. Technical Bulletin:1-3, Wales, UK [5 Maret 2005].

http://www-biol.paisley.ac.uk/Courses/stfunmac/glossary/cellulose.html [19 Mei

2006]. http://wwwchem.uwimona.edu.jm:1104/lectures/vanilla.html [13 April 2005].

http://www.cpkelco.com/food/pektin.html [5 Maret 2005].

http://www.fao.org/docrep/w7241e/w7241e08.htm [13 April 2005].

http://www.fao.org/docrep/W8079E/w8079e0j.htm [8 Agustus 2006].

http://www.fibersource.com/f-tutor/sellulosa.htm [3 Maret 2005].

http://www.hyperdictionary.com. 2004 [14 Februari 2005].

http://www. info@ippi.com. 1995 [26 Februari 2005].

http://www.ipa.gov.pg/vanilla_processing [14 Februari 2005].

http://www.kpel.or.id/TTGP/komoditi/PANILI1 [14 Februari 2005].

http://www.ktf-split.hr/glossary/en_o.php?def=extraction [14 Februari 2005].

http://www.novozyme.com. [5 Maret 2005].

http://www.portal.remarkablefoods.com [13 Februari 2005].

79

http://www.scifun.chem.wisc.edu/chemweek/ethanol/ethanol.html [13 Februari 2005].

http://www.saps.plantsci.cam.ac.uk/osmoweb/pektinase.htm [3 Maret 2005].

http://www.saps.plantsci.cam.ac.uk/osmoweb/pektinase.htm [3 Maret 2005].

http://www.sdahldtp.com/vanilla3.htm [13 April 2005].

htttp://www.serva.de/products/knowledge/061097.shtml [3 Maret 2005].

http://www.uyseg.org/greener_industry/pages/vanilin/1Vanilin_AP.htm [13 Februari 2005].

Jakubowski. 2006. Enzyme Catalysis in Organic Solvents. [terhubung berkala].

http://www.employees.csbju.edu/hjatowski/classes/ch 331/catalysis/olcatorgsolv.html [5 Mei 2006].

Kim, M, Lee J, dan Choe E. 2003. Pigmen change in fried dough containing

spinach powder during storage in the dark. J. of Food Science 68(6): 1923-7. Klibanov AM. 1993. Enzyme Catalysis Without Water. R&D Innovator. 2(4).

[terhubung berkala]. http://www.winstonbrill.com/bril001/html/article-_index/articles/1-50/article32_body.html [5 Mei 2006].

Lee CY. 1993. Enzymatic browning in fruits. Didalam: Downing DL, editor.

Juice Technology Workshop. Special Report. No.67. New York State, Geneva: Agricultural Experiment Station. hlm. 10-15

Menyhart L.1995. Lyophilization: Freeze-Drying A Downstream Process.

[terhubung berkala]. http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/LYO/. [12 Mei 2006].

Naczk M, Shahidi F. 2004. Extraction and analysis of phenolic in food: an review

J of Chromatography A 1054: 95-111. Odoux E, Escoute J, Verdeil JL, Brillouet JM. 2003. Localization of

ß-D-glucosidase activity and glucovanilin in vanilla bean (Vanilla planifolia Andrews). J Annals of Botany 92:437-444.

Perez-Silva A et al. 2005. GC-MS and GC-olfactometry analysis of aroma compound in a representative organic aroma extract from cured vanilla (Vanilla planifolia G. Jackson) beans. J Food Chemistry: [terhubung berkala]. [20 Oktober 2005].

Pilnik W, Voragen GJ. 1991. The Significance of Endogenous and Exogenous

Pectic Enzymes in Fruit and Vegetable Processing. Di dalam: Fox PF,

80

editor. Food Enzymology. Vol 1. London and New York: Elsevier Applied Science.hlm. 303-331.

Pilnik W, Rombouts FM. 1981. Pectic Enzymes. Di dalam: Birch GG,

Blakebrough N, Parker KJ, editor. Enzymes and Food Processing. London: Applied Science.hlm. 105-125.

Price NC, Steven L. 1991. Enzyme: Structure and Function. Di dalam: Fox PF,

editor. Food Enzymology. London and New York: Elsevier Applied Science.hlm.1-51.

Purseglove JW, Brown EG, Green CL, Robbins SRJ. 1981. Vanilla. Di dalam:

Spices. Vol 2. New York:Longman Inc.hlm.644-705. Reichardt C. 1988. Solvent and Solvent Effect in Organic Chemistry. Ed ke-2.

VCH Publ. http://www.virtual.yosemite.cc.ca.us/smurov/orgsoltab.htm [5 Mei 2006].

Reineccius G. 1994. Natural Flavouring Material. Di dalam: Source Book of

Flavors. Ed ke-2, Ch. 7. New York:Chapman& Hall. Richardson T, Hyslop DB. 1985. Enzyme. Di dalam: Fennema OR, editor. Food

Chemistry. Connecticut: AVI Pub Comp. Roling WFM et al. 2001. Microorganisms with a taste for vanilla: microbial

ecology of traditional Indonesian vanilla curing. J Applied and Environmental Microbiology 67(5):1995-2003.

Ruiz-Teran F, Perez-Amador I, Lopez-Munguia A. 2001. Enzymatic extraction

and transformation of glukovanilin to vanilin from vanilla green pods. J Agric Food Chem 49:5207-5209.

Sagrero-Nieves L, Schwartz SJ. 1988. Phenolic content of Vanilla planifolia as

affected by harvest periode. J of Food Composition and Analysis 1:362-365. Sreenath HK, Sudarshanakrishna KR, Santhanam K. 1994. Improvement of juice

recovery from pineapple pulp/residue using cellulases and pectinases. J of Fermentation and Bioengineering 78(6):486-488.

Taylor AJ, Leach RM. 1995. Enzymes in Food Industry. Di dalam: Tucker dan

Woods LFJ, editor. Enzyme in Food Processing. Ed ke-2. London: Chapman & Hall.

Tesla N. 2000. Guru’s Big Guide to Chemistry. [terhubung berkala].

http://www.poppies.org/news/97712072383422 [13 April 2005].

81

Tucker GA. 1995. Fundamentals of Enzyme Activity. Di dalam: Tucker dan Woods LFJ, editor. Enzyme in Food Processing. Ed ke-2. London: Chapman & Hall.

[Unpas] Universitas Pasundan, 2003. Penuntun Praktikum Analisis Pangan.

Bandung: Jur. Teknologi Pangan, Fak. Teknik. Waliszewski K, Pardio V, Ovando SL. 2002. Effect of etanol concentration on the

kinetics of extracted vanilla beans hydrolysis by some commercial cellulases. IFT Annual Meeting and Expo; California. [terhubung berkala]. http://ift.confex.com/ift/2002/techprogram/paper_12818.htm [13 April 2005].

Waliszewski K, Pardio V, Ovando SL. 2003. Effect of commercial cellulases

pretreatment on the kinetics of vanilin extraction from vanilla pods. IFT Annual Meeting; Chicago. [terhubung berkala]. http://ift.confex.com/ift/2003/techprogram/paper_20264.htm [13 April 2005].

Wirahadikusumah M. 2001. Biokimia; Protein, Enzim dan Asam Nukleat.

Bandung: Penerbit ITB. hlm. 50-71. Zahorik R. 2006. The real thing. [terhubung berkala]. http://

www.suburbanchicagonews.com/newssun/features/5_5_WA31_MAIN_S2.htm [13 Juni 2006].

Zaks A. 1991. Enzymes in Organic Solvens. Di dalam: Dordick JS, editor.

Biocatalys for Industry. Iowa: Plenum Press. hlm. 161-179.

83

0.176

0.325

0.481

0.659

0.8220.995

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3 4 5 6

konsentrasi (ppm)

abso

rban

si

Lampiran 1 Data dasar buah vanili segar dan kering

Kadar Air (%) Jenis Vanili

Ulangan Rendemen (%)

Ka1* Ka2*

Kadar Serat

Pangan (%bk)

Kadar Vanilin (%bk)

I 16.39 84.72 9.35 10.19 0.75 Segar II 19.05 82.28 8.72 10.14 0.77

Rata-rata 17.72±1.88 83.50±1.72 9.04±0.44 10.17±0.036 0.76±0.0014

I 85.91 20.85 8.66 9.96 1.60 Kering II 86.09 20.12 8.15 9.71 1.66

Rata-rata 86.00±0.12 20.48±0.51 8.40±0.37 9.84±0.17 1.63±0.039

Keterangan: *Ka1 = kadar air sebelum pengeringan beku *Ka2 = kadar air setelah pengeringan beku Rendemen = berat sampel setelah pengeringan beku per berat sampel sebelum pengeringan beku

Lampiran 2 Kurva standar vanilin dan glukosa

A. Vanilin

- Spektrofotometer double beam

a = -6.6667.10-5

b = 0.1647 R2= 0.9996

84

0.189

0.318

0.49

0.619

0.789

0.922

0

0.1

0.2

0.30.4

0.5

0.60.7

0.8

0.9

1

0 1 2 3 4 5 6

konsentrasi (ppm)

abso

rban

si

- Spektrofotometer UV-visible

B. Glukosa dengan spektrofotometer double beam

a = 3.38.10-2

b = 0.1488 R2= 0.9993

0.1060.192

0.247

0.3800.470 0.516

0.645

0.7830.8430.965

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

konsentrasi (ppm)

abso

rban

si

a = -0.0123

b = 0.0048

R2= 0.9966

85

Lampiran 3 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dalam penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase

Kv ekstrak (bk)

Kv ekstrak (bb) Perlakuan

Ul

Ws2 (g)

As

Ab

Ase

a

b

X (Ug/ml)

KBk (%

w/v) Vf

(ml) WtBk

(g) fp

Va (ml) (Ug/g) (%)

x (%)

SD (Ug/ml) %

x (%)

SD

0.6509 0.249 0.027 0.222 0.0338 0.1488 1.2650 1.2 21.8 0.2616 1090 25 131773.7 13.2 1581.28 0.16I 0.6509 0.237 0.027 0.210 0.0338 0.1488 1.1844 1.2 21.3 0.2556 1065 25 123371.6 12.3

12.76

0.591480.46 0.15

0.15 0.0071

0.6464 0.268 0.026 0.242 0.0338 0.1488 1.3995 1.2 21.1 0.2532 1055 25 145777.3 14.6 1749.33 0.17II 0.6464 0.251 0.026 0.225 0.0338 0.1488 1.2852 1.2 21.3 0.2556 1065 25 133874.3 13.4

13.98

0.841606.49 0.16

0.17 0.010300 C

13.37 0.87 0.16 0.01

0.6509 0.256 0.028 0.228 0.0338 0.1488 1.3054 1.2 21 0.252 1050 25 135974.8 13.6 1631.70 0.16I 0.6509 0.275 0.027 0.248 0.0338 0.1488 1.4398 1.2 20.9 0.2508 1045 25 149978.4 15

14.30

0.991799.74 0.18

0.17 0.012

0.6464 0.291 0.026 0.265 0.0338 0.1488 1.5541 1.2 21 0.252 1050 25 161881.4 16.2 1942.58 0.19II 0.6464 0.287 0.026 0.261 0.0338 0.1488 1.5272 1.2 21.4 0.2568 1070 25 159080.7 15.9

16.05

0.201908.97 0.19

0.19 0.0024370 C

15.17 1.24 0.18 0.015

0.6509 0.262 0.026 0.236 0.0338 0.1488 1.3591 1.2 21.7 0.2604 1085 25 141576.2 14.2 1698.91 0.17I 0.6509 0.277 0.026 0.251 0.0338 0.1488 1.4600 1.2 20.5 0.2460 1025 25 152078.9 15.2

14.68

0.741824.95 0.18

0.18 0.0089

0.6464 0.312 0.025 0.287 0.0338 0.1488 1.7019 1.24 20.3 0.2517 1015 25 171566.5 17.2 2127.42 0.21II 0.6464 0.284 0.026 0.258 0.0338 0.1488 1.5070 1.2 20.9 0.2508 1045 25 156980.2 15.7

16.43

1.031883.76 0.19

0.20 0.017450 C

15.56 1.23 0.19 0.017

0.6509 0.277 0.025 0.252 0.0338 0.1488 1.4667 1.2 21.7 0.2604 1085 25 152779.1 15.3 1833.35 0.18I 0.6509 0.289 0.027 0.262 0.0338 0.1488 1.5339 1.24 20.8 0.2579 1040 25 154626.7 15.5

15.37

0.131917.37 0.19

0.19 0.0059

0.6464 0.301 0.026 0.275 0.0338 0.1488 1.6213 1.24 20.5 0.2542 1025 25 163435.4 16.3 2026.60 0.20II 0.6464 0.320 0.026 0.294 0.0338 0.1488 1.7490 1.24 20.5 0.2542 1025 25 176309.7 17.6

16.99

0.912186.24 0.22

0.21 0.011500 C

16.18 1.14 0.2 0.016

86

Keterangan: Ul = Ulangan Ws2 = Berat sampel setelah pengeringan beku As = Absorban sampel Ab = Absorban blanko Ase = Absorban selisih (As-Ab) a = Intercep b = Slope X = Konsentrasi vanilin yang terbaca pada spektrofotometer KBk = Kadar berat kering Vf = Volume filtrat WtBk = Total berat kering fp = Faktor pengenceran Va = Volume akhir Kv ekstrak (bk) = Kadar vanillin atas dasar berat kering Kv ekstrak (bb) = Kadar vanillin atas dasar berat basah x = rata-rata SD = Standar deviasi Lampiran 4 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dalam penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase

Kg ekstrak (bk) Kg ekstrak (bb) Perlakuan

Ul

Ws2 (g)

As

a

b

X (Ug/ml)

KBk (% w/v)

Vf (ml)

WtBk (g)

fp

Va (ml) (Ug/g) (%)

x (%)

SD (Ug/ml) %

x (%)

SD

TPT (brix)

x

SD

0.6509 0.279 -0.0123 0.0048 60.7995 1.2 10 0.12 416.7 2 422219 42.22 5066.6 0.51 4.5I 0.6509 0.273 -0.0123 0.0048 59.5471 1.2 10 0.12 416.7 2 413521.5 41.35

41.79 0.624962.3 0.50

0.501 0.00745

4.75 0.35

0.6464 0.278 -0.0123 0.0048 60.5908 1.2 10 0.12 416.7 2 420769.5 42.08 5049.2 0.510 5II 0.6464 0.288 -0.0123 0.0048 62.6782 1.2 10 0.12 416.7 2 435265.4 43.53

42.80 1.035223.2 0.52

0.51 0.0125

5 0300 C

42.29 0.72 0.51 0.0086 4.88 0.18

0.6509 0.203 -0.0123 0.0048 44.9352 1.2 10 0.12 833.3 2 624099.5 62.41 7489.2 0.75 0.745 0.0050 6.5I 0.6509 0.201 -0.0123 0.0048 44.5177 1.2 10 0.12 833.3 2 618301.1 61.83

62.12 0.417419.6 0.74 6.75

6.63 0.18

0.6464 0.206 -0.0123 0.0048 45.5614 1.2 10 0.12 833.3 2 632797.1 63.28 7593.6 0.76 0.765 0.0074 7II 0.6464 0.209 -0.0123 0.0048 46.1876 1.2 10 0.12 833.3 2 641494.6 64.15

63.72 0.627697.9 0.77 7

7 0370 C

62.92 1.13 0.76 0.014 6.81 0.27

0.6509 0.225 -0.0123 0.0048 49.5275 1.2 10 0.12 833.3 2 687881.7 68.79 8254.6 0.83 7 0450 C

I 0.6509 0.227 -0.0123 0.0048 49.945 1.2 10 0.12 833.3 2 693680.1 69.37

69.08 0.418324.2 0.83

0.83 0.00497

7

87

0.6464 0.255 -0.0123 0.0048 55.7897 1.24 10 0.124 833.3 2 749862.1 74.99 9298.3 0.93 0.89 7 0II 0.6464 0.232 -0.0123 0.0048 50.9887 1.2 10 0.12 833.3 2 708176.1 70.82

72.90 2.958498.1 0.85

0.0577

7

70.99 2.7 0.86 0.043 7 00.6509 0.237 -0.0123 0.0048 52.0324 1.2 10 0.12 833.3 2 722672 72.27 8672.1 0.87 6.5I

0.6509 0.256 -0.0123 0.0048 55.9985 1.24 10 0.124 833.3 2 752667.7 75.2773.77 2.12

9333.1 0.930.9 0.047

76.75 0.35

0.6464 0.263 -0.0123 0.0048 57.4597 1.24 10 0.124 833.3 2 772307.4 77.23 9576.6 0.96 7II 0.6464 0.268 -0.0123 0.0048 58.5034 1.24 10 0.124 833.3 2 786335.8 78.63

77.93 0.999750.6 0.98

0.97 0.0127.5

7.25 0.35500 C

75.85 2.95 0.93 0.047 7 0.35

Keterangan: Ul = Ulangan Ws2 = Berat sampel setelah pengeringan beku As = Absorban sampel Ab = Absorban blanko Ase = Absorban selisih (As-Ab) a = Intercep b = Slope X = Konsentrasi vanilin yang terbaca pada spektrofotometer KBk = Kadar berat kering Vf = Volume filtrat WtBk = Total berat kering fp = Faktor pengenceran Va = Volume akhir Kg ekstrak (bk) = Kadar glukosa atas dasar berat kering Kg ekstrak (bb) = Kadar glukosa atas dasar berat basah TPT = Total padatan terlarut x = rata-rata SD = Standar deviasi

88

Lampiran 5 Kadar vanilin ekstrak buah vanili kering dan segar dengan penambahan 1 jenis enzim komersial

Kv ekstrak (bk)

Kv ekstrak (bb) Perlakuan

Ul

Ws2 (g)

As

Ab

Ase

a

b

X (Ug/ml)

KBk (% w/v)

Vf (ml)

WtBk (g)

fp

Va (ml)

(Ug/g)

(%)

x (%)

SD

(Ug/ml)

%

x (%)

SD

0.6460 0.507 0.098 0.409 -6.67.10-5 0.1647 2.4839 0.96 22.8 0.2189 114 25 32342.8 3.23 310.49 0.031I 0.6460 0.498 0.097 0.401 -6.67.10-5 0.1647 2.4353 0.88 22.9 0.2015 114.5 25 34592 3.46

3.35 0.16304.42 0.030

0.031 0.00043

0.6424 0.433 0.069 0.364 -6.67.10-5 0.1647 2.2107 0.88 23.0 0.2024 115 25 31401.6 3.14 276.33 0.028II 0.6424 0.444 0.064 0.380 -6.67.10-5 0.1647 2.3078 0.88 22.7 0.1998 113.5 25 32781.7 3.28

3.21 0.10288.48 0.029

0.028 0.00086Kontrol

3.28 0.097 0.029 0.0018

0.6509 0.265 0.035 0.230 -6.67.10-5 0.1647 1.3970 0.8 24.2 0.1936 80.67 25 14552.1 1.46 116.42 0.012I 0.6509 0.265 0.037 0.228 -6.67.10-5 0.1647 1.3849 0.8 24 0.192 80 25 14425.6 1.44

1.45 0.0090115.41 0.012

0.012 0.00007

0.6464 0.281 0.039 0.242 -6.67.10-5 0.1647 1.4699 0.84 24 0.2016 80 25 14582.1 1.46 122.49 0.012II 0.6464 0.277 0.036 0.241 -6.67.10-5 0.1647 1.4638 0.84 23.8 0.1999 79.33 25 14521.8 1.45

1.46 0.0043121.98 0.012

0.012 0.00004air 1.45 0.0045 0.012 0.00045

0.6509 0.318 0.066 0.252 -6.67.10-5 0.1647 1.5306 0.84 22 0.1848 73.33 25 15184.5 1.52 127.55 0.013I 0.6509 0.328 0.068 0.26 -6.67.10-5 0.1647 1.5792 0.88 22.3 0.1962 74.33 25 14954.3 1.50

1.51 0.016131.60 0.013

0.013 0.00029

0.6464 0.327 0.07 0.257 -6.67.10-5 0.1647 1.561 0.84 23.1 0.194 77 25 15485.7 1.55 130.08 0.013II 0.6464 0.335 0.074 0.261 -6.67.10-5 0.1647 1.5852 0.84 22.8 0.1915 76 25 15726.6 1.57

1.56 0.017132.10 0.013

0.013 0.00014

air+ etanol

1.53 0.038 0.013 0.00011

0.6509 0.47 0.013 0.457 -6.67.10-5 0.1647 2.7754 3.64 23.9 0.87 597.5 25 47654.3 4.77 1734.62 0.17I 0.6509 0.479 0.013 0.466 -6.67.10-5 0.1647 2.83 3.64 23.7 0.8627 592.5 25 48592.7 4.86

4.81 0.0661768.77 0.18

0.18 0.0024

0.6464 0.489 0.019 0.47 -6.67.10-5 0.1647 2.8543 3.68 23.7 0.8722 592.5 25 48477 4.85 1783.95 0.18II 0.6464 0.489 0.019 0.468 -6.67.10-5 0.1647 2.8422 3.64 23.5 0.8554 587.5 25 48801.2 4.88

4.86 0.0231776.36 0.18

0.18 0.00054

selulase+ air 4.84 0.037 0.18 0.0020

89

0.6509 0.553 0.028 0.525 -6.67.10-5 0.1647 3.1883 3.8 19.8 0.7524 495 25 52439.1 5.24 1992.68 0.20

0.6464 0.558 0.03 0.528 -6.67.10-5 0.1647 3.2065 3.72 19.7 0.7328 492.5 25 53872.8 5.39 2004.07 0.20II 0.6464 0.565 0.034 0.531 -6.67.10-5 0.1647 3.2247 3.72 19.5 0.7254 487.5 25 54178.9 5.42

5.40 0.022015.46 0.20

0.20 0.00081

5.37 0.047 0.20 0.00027

0.6509 0.551 0.027 0.524 -6.67.10-5 0.1647 3.1822 2.56 24.3 0.6221 303.8 25 38845.5 3.88 994.45 0.10I 0.6509 0.562 0.027 0.535 -6.67.10-5 0.1647 3.249 2.56 23.7 0.6067 296.3 25 39660.9 3.97

3.93 0.0581015.32 0.10

0.10 0.0015

0.6464 0.332 0.028 0.304 -6.67.10-5 0.1647 1.8463 2.56 24.2 0.6195 605 25 45076.8 4.51 1153.97 0.12II 0.6464 0.328 0.028 0.3 -6.67.10-5 0.1647 1.8221 2.56 24.2 0.6195 605 25 44483.8 4.45

4.48 0.0421138.79 0.11

0.12 0.0011pektinase+

air 4.20 0.39 0.11 0.01

0.6509 0.398 0.049 0.349 -6.67.10-5 0.1647 2.1196 2.6 20.1 0.5226 502.5 25 50951.8 5.1 1324.75 0.13I 0.6509 0.408 0.055 0.353 -6.67.10-5 0.1647 2.1439 2.6 21 0.546 525 25 51535.6 5.15

5.12 0.0411339.93 0.13

0.13 0.0011

0.6464 0.392 0.042 0.35 -6.67.10-5 0.1647 2.1257 2.56 19.8 0.5069 495 25 51896.1 5.19 1328.54 0.13II 0.6464 0.392 0.046 0.346 -6.67.10-5 0.1647 2.1014 2.56 19.8 0.5069 495 25 51303.1 5.13

5.16 0.0411313.36 0.13

0.13 0.0011

pektinase+ air+

etanol 5.14 0.025 0.13 0.00081

0.6509 0.441 0.025 0.416 0.0338 0.1488 2.5690 1.16 22.5 0.261 562.5 25 138418.2 13.8 1605.65 0.16I 0.6509 0.446 0.028 0.418 0.0338 0.1488 2.5825 1.16 22.5 0.261 562.5 25 139142.5 13.9

13.88 0.0511614.05 0.16

0.16 0.00059

0.6464 0.465 0.029 0.436 0.0338 0.1488 2.7035 1.16 22.9 0.2656 572.5 25 145661.4 14.6 1689.67 0.17II 0.6464 0.447 0.028 0.419 0.0338 0.1488 2.5892 1.12 23.1 0.2587 577.5 25 144487 14.4

14.51 0.0831618.25 0.16

0.17 0.0051

β-gluko sidase+

air 14.19 0.45 0.16 0.0031

0.6509 0.282 0.025 0.257 0.0338 0.1488 1.5003 1.2 21.2 0.2544 1060 25 156280 15.6 15.58 0.069 1875.36 0.19I 0.6509 0.289 0.026 0.263 0.0338 0.1488 1.5406 1.24 20.5 0.2542 1025 25 155304.3 15.5 1925.77 0.19

0.19 0.0036

0.6464 0.303 0.027 0.276 0.0338 0.1488 1.6280 1.24 20.6 0.2554 1030 25 164113 16.4 16.37 0.059 2035.00 0.20II 0.6464 0.293 0.026 0.267 0.0338 0.1488 1.5675 1.2 21 0.252 1050 25 163281.8 16.3 1959.38 0.20

0.20 0.0054

β-gluko sidase+

air+ etanol

15.97 0.56 0.20 0.0068

90

Keterangan: Ul = Ulangan Ws2 = Berat sampel setelah pengeringan beku As = Absorban sampel Ab = Absorban blanko Ase = Absorban selisih (As-Ab) a = Intercep b = Slope X = Konsentrasi vanilin yang terbaca pada spektrofotometer KBk = Kadar berat kering Vf = Volume filtrat WtBk = Total berat kering fp = Faktor pengenceran Va = Volume akhir Kv ekstrak (bk) = Kadar vanillin atas dasar berat kering Kv ekstrak (bb) = Kadar vanillin atas dasar berat basah x = rata-rata SD = Standar deviasi Lampiran 6 Kadar glukosa ekstrak vanili kering dan segar dengan penambahan 1 jenis enzim komersial

Kg ekstrak (bk) Kg ekstrak (bb) Perlakuan

Ul

Ws2 (g)

As

a

b

X (Ug/ml)

KBk (% w/v)

Vf (ml)

WtBk (g)

fp

Va (ml) (Ug/g) (%)

X (%)

SD (Ug/ml) %

x (%)

SD

TPT (brix)

x

SD

0.646 0.232 -0.0123 0.0048 50.9887 0.96 10 0.096 111.1 2 118029.3 11.80 1133.1 0.11 1I 0.646 0.215 -0.0123 0.0048 47.4401 0.88 10 0.088 111.1 2 119798.1 11.98

11.89 0.131054.2 0.11

0.11 0.00561

1 0

0.6424 0.214 -0.0123 0.0048 47.2313 0.88 10 0.088 111.1 2 119271 11.93 1049.6 0.11 1.5II 0.6424 0.217 -0.0123 0.0048 47.8575 0.88 10 0.088 111.1 2 120852.4 12.09

12.01 0.111063.5 0.11

0.11 0.000981.5

1.5 0Kontrol

11.95 0.081 0.11 0.0026 1.25 0.35

0.6509 0.261 -0.0123 0.0048 57.0422 0.8 10 0.08 20.83 2 29709.47 2.97 237.68 0.024 0I 0.6509 0.27 -0.0123 0.0048 58.9209 0.8 10 0.08 20.83 2 30687.95 3.07

3.02 0.069245.5 0.025

0.02 0.000550

0 0

0.6464 0.288 -0.0123 0.0048 62.6782 0.84 10 0.084 20.83 2 31090.39 3.11 261.2 0.026 0.03 0.25II 0.6464 0.282 -0.0123 0.0048 61.4258 0.84 10 0.084 20.83 2 30469.13 3.05

3.08 0.044255.9 0.026

0.000370

0.13 0.18air

3.05 0.041 0.03 0.0012 0.06 0.09

91

0.6509 0.303 -0.0123 0.0048 65.8093 0.84 10 0.084 20.83 2 32643.53 3.26 274.2 0.027 0.25I 0.6509 0.315 -0.0123 0.0048 68.3142 0.88 10 0.088 20.83 2 32345.76 3.25

3.25 0.021284.6 0.028

0.03 0.000740.5

0.38 0.18

0.6464 0.312 -0.0123 0.0048 67.688 0.84 10 0.084 20.83 2 33575.41 3.36 282.0 0.028 0.25II 0.6464 0.307 -0.0123 0.0048 66.6443 0.84 10 0.084 20.83 2 33057.7 3.31

3.33 0.037277.7 0.028

0.03 0.000310.25

0.25 0air+

etanol 3.29 0.058 0.03 0.00003 0.31 0.09

0.6509 0.238 -0.0123 0.0048 52.2411 3.64 10 0.364 833.3 2 239199.3 23.92 8706.9 0.87 5.5I 0.6509 0.235 -0.0123 0.0048 51.6149 3.64 10 0.364 833.3 2 236332 23.63

23.78 0.208602.5 0.86

0.87 0.00745.5

5.5 0

0.6464 0.251 -0.0123 0.0048 54.9548 3.68 10 0.368 833.3 2 248889.4 24.89 9159.1 0.92 6II 0.6464 0.249 -0.0123 0.0048 54.5373 3.64 10 0.364 833.3 2 249712.9 24.97

24.93 0.0589089.6 0.91

0.91 0.00496

6 0selulase+

air 24.35 0.82 0.89 0.033 5.75 0.35

0.6509 0.333 -0.0123 0.0048 72.0716 3.72 10 0.372 833.3 2 322901.4 32.29 12011.9 1.20 8.5I 0.6509 0.348 -0.0123 0.0048 75.2027 3.8 10 0.38 833.3 2 329836.5 32.98

32.64 0.4912533.8 1.25

1.23 0.0379

8.75 0.35

0.6464 0.339 -0.0123 0.0048 73.3241 3.72 10 0.372 833.3 2 328512.8 32.85 12220.7 1.22 9II 0.6464 0.346 -0.0123 0.0048 74.7852 3.72 10 0.372 833.3 2 335059.4 33.51

33.18 0.4612464.2 1.25

1.23 0.0178.5

8.75 0.35

selulase+ air+

etanol 32.91 0.38 1.23 0.0049 8.75 0

0.6509 0.399 -0.0123 0.0048 85.8486 2.56 10 0.256 833.3 2 558909.9 55.89 14308.1 1.43 9I 0.6509 0.396 -0.0123 0.0048 85.2223 2.56 10 0.256 833.3 2 554832.9 55.48

55.69 0.2914203.7 1.42

1.43 0.00749

9 0

0.6464 0.406 -0.0123 0.0048 87.3098 2.56 10 0.256 833.3 2 568422.9 56.84 14551.6 1.46 1.44 0.022 9 9 0II 0.6464 0.397 -0.0123 0.0048 85.4311 2.56 10 0.256 833.3 2 556191.9 55.62

56.23 0.8614238.5 1.42 9

pektinase+ air

55.96 0.38 1.43 0.0098 9 0

0.6509 0.655 -0.0123 0.0048 139.286 2.6 10 0.26 833.3 2 892862.1 89.29 23214.4 2.32 12I 0.6509 0.665 -0.0123 0.0048 141.374 2.6 10 0.26 833.3 2 906242.9 90.62

89.96 0.9523562.3 2.36

2.34 0.02512

12 0

0.6464 0.426 -0.0123 0.0048 91.4846 2.56 10 0.256 1250 2 893404.3 89.34 22871.1 2.29 12II 0.6464 0.438 -0.0123 0.0048 93.9895 2.56 10 0.256 1250 2 917866.2 91.79

90.56 1.7323497.4 2.35

2.32 0.04412

12 0

pektinase+ air+

etanol 90.26 0.43 2.33 0.014 12 0

0.6509 0.256 -0.0123 0.0048 55.9985 1.16 10 0.116 500 2 482745.5 48.27 5599.85 0.56 4.75I 0.6509 0.253 -0.0123 0.0048 55.3723 1.16 10 0.116 500 2 477347 47.73

48.01 0.385537.23 0.55

0.56 0.00444

4.38 0.53

0.6464 0.262 -0.0123 0.0048 57.2509 1.16 10 0.116 500 2 493542.5 49.35 5725.09 0.57 4.5II 0.6464 0.269 -0.0123 0.0048 58.7121 1.12 10 0.112 500 2 524215.4 52.42

50.89 2.175871.21 0.59

0.58 0.0104

4.25 0.35

β-gluko sidase+

air 49.45 2.04 0.57 0.016 4.31 0.09

0.6509 0.238 -0.0123 0.0048 52.2411 1.2 10 0.12 833.3 2 725571.2 72.56 8706.9 0.87 7.5β-gluko sidase+

I 0.6509 0.259 -0.0123 0.0048 56.6247 1.24 10 0.124 833.3 2 761084.8 76.11

74.33 2.519437.5 0.94

0.91 0.0528

7.75 0.35

92

0.6464 0.261 -0.0123 0.0048 57.0422 1.24 10 0.124 833.3 2 766696.1 76.67 9507.0 0.95 8II 0.6464 0.244 -0.0123 0.0048 53.4936 1.2 10 0.12 833.3 2 742966.4 74.30

75.48 1.688915.6 0.89

0.92 0.0427.5

7.75 0.35air+ etanol

74.91 0.81 0.91 0.0098 7.75 0

Keterangan: Ul = Ulangan Ws2 = Berat sampel setelah pengeringan beku As = Absorban sampel Ab = Absorban blanko Ase = Absorban selisih (As-Ab) a = Intercep b = Slope X = Konsentrasi vanilin yang terbaca pada spektrofotometer KBk = Kadar berat kering Vf = Volume filtrat WtBk = Total berat kering fp = Faktor pengenceran Va = Volume akhir Kg ekstrak (bk) = Kadar glukosa atas dasar berat kering Kg ekstrak (bb) = Kadar glukosa atas dasar berat basah TPT = Total padatan terlarut x = rata-rata SD = Standar deviasi

93

Lampiran 7 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dengan penambahan 2 atau 3 jenis enzim komersial

Kv ekstrak(bk) Kv ekstrak(bb) Perlakuan

Ul

Ws2 (g)

As

Ab

Ase

a

b

X (Ug/ml)

KBk (% w/v)

Vf (ml)

WtBk (g)

fp

Va (ml) (Ug/g) (%)

x (%)

SD (Ug/ml) %

x (%)

SD

0.6509 0.321 0.027 0.294 0.0338 0.1488 1.749 5.16 20.4 1.0526 1020 25 42368.99 4.24 2186.24 0.22I 0.6509 0.325 0.027 0.298 0.0338 0.1488 1.7759 5 21.0 1.0500 1050 25 44396.97 4.44

4.34 0.142219.85 0.22

0.22 0.0024

0.6464 0.325 0.026 0.299 0.0338 0.1488 1.7826 5.04 21.1 1.0634 1055 25 44211.32 4.42 2228.25 0.22II 0.6464 0.39 0.03 0.36 0.0338 0.1488 2.1926 6.4 16.7 1.0688 835 25 42824.71 4.28

4.35 0.0982740.78 0.27

0.25 0.036

selulase+ pektinase

4.35 0.0096 0.23 0.020

0.6509 0.334 0.027 0.307 0.0338 0.1488 1.8364 3.6 17.9 0.6444 895 25 63762.99 6.38 2295.47 0.23I 0.6509 0.335 0.027 0.308 0.0338 0.1488 1.8431 4.4 16.9 0.7436 845 25 52360.68 5.24

5.81 0.812303.87 0.23

0.23 0.00059

0.6464 0.389 0.030 0.359 0.0338 0.1488 2.1859 4.44 15.3 0.6793 765 25 61540.08 6.15 2732.38 0.27II 0.6464 0.335 0.040 0.295 0.0338 0.1488 1.7557 4 18.9 0.7560 945 25 54866.05 5.49

5.82 0.472194.64 0.22

0.25 0.038

selulase+ β-gluko sidase

5.81 0.01 0.24 0.012

0.6509 0.331 0.027 0.304 0.0338 0.1488 1.8162 3 20.2 0.6060 1010 25 75675.37 7.57 2270.261 0.23I 0.6509 0.32 0.027 0.293 0.0338 0.1488 1.7423 3 21.7 0.6510 1085 25 72594.58 7.26

7.41 0.222177.84 0.22

0.22 0.0065

0.6464 0.347 0.027 0.32 0.0338 0.1488 1.9238 3.12 20.5 0.6396 1025 25 77073.58 7.71 2404.70 0.24II 0.6464 0.321 0.031 0.29 0.0338 0.1488 1.7221 2.8 22.3 0.6244 1115 25 76879.68 7.69

7.70 0.0132152.63 0.22

0.23 0.018

pektinase+ β-gluko sidase

7.56 0.20 0.23 0.0039

0.6509 0.362 0.033 0.329 0.0338 0.1488 1.9843 5.68 19.0 1.0792 950 25 43667.52 4.37 2480.32 0.25I 0.6509 0.380 0.033 0.347 0.0338 0.1488 2.1052 5.88 17.3 1.0172 865 25 44754.31 4.48

4.42 0.0772631.55 0.26

0.26 0.011

0.6464 0.375 0.034 0.341 0.0338 0.1488 2.0649 5.72 19.2 1.0982 960 25 45124.84 4.51 2581.14 0.26II 0.6464 0.388 0.033 0.355 0.0338 0.1488 2.159 6 17.6 1.0560 880 25 44979.51 4.50

4.51 0.0102698.77 0.27

0.26 0.0083

selulase+ pektinase+

β-gluko sidase

4.46 0.060 0.26 0.0059

94

Keterangan: Ul = Ulangan Ws2 = Berat sampel setelah pengeringan beku As = Absorban sampel Ab = Absorban blanko Ase = Absorban selisih (As-Ab) a = Intercep b = Slope X = Konsentrasi vanilin yang terbaca pada spektrofotometer KBk = Kadar berat kering Vf = Volume filtrat WtBk = Total berat kering fp = Faktor pengenceran Va = Volume akhir Kv ekstrak (bk) = Kadar vanillin atas dasar berat kering Kv ekstrak (bb) = Kadar vanillin atas dasar berat basah x = rata-rata SD = Standar deviasi Lampiran 8 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dengan penambahan 2 atau 3 jenis enzim komersial

Kg ekstrak (bk) Kg ekstrak (bb)Perlakuan

Ul

Ws2 (g)

As

a

b

X (Ug/ml)

KBk (% w/v)

Vf (ml)

WtBk (g)

fp

Va (ml) (Ug/g) (%)

x (%)

SD (Ug/ml) %

x (%)

SD

TPT (brix)

x

SD

0.6509 0.453 -0.0123 0.0048 97.121 5.16 10 0.516 1667 2 627394.2 62.74 32373.5 3.24 13I 0.6509 0.432 -0.0123 0.0048 92.737 5 10 0.5 1667 2 618247 61.82

62.28 0.6530912.3 3.09

3.16 0.1013.5

13.25 0.35

0.6464 0.45 -0.0123 0.0048 96.494 5.04 10 0.504 1667 2 638190.5 63.82 32164.8 3.22 13.5II 0.6464 0.567 -0.0123 0.0048 120.917 6.4 10 0.64 1667 2 629777.1 62.98

63.40 0.5940305.7 4.03

3.62 0.5813.75

13.63 0.18

selulase+ pektinase

62.84 0.79 3.39 0.33 13.44 0.27

0.6509 0.317 -0.0123 0.0048 68.732 3.6 10 0.36 1667 2 636404.9 63.64 22910.6 2.29 11.5I 0.6509 0.343 -0.0123 0.0048 74.159 4.4 10 0.44 1667 2 561810.8 56.18

59.91 5.2724719.7 2.47

2.38 0.1311.75

11.63 0.18

0.6464 0.374 -0.0123 0.0048 80.63 4.44 10 0.444 1667 2 605330.5 60.53 26876.7 2.69 12II 0.6464 0.333 -0.0123 0.0048 72.072 4 10 0.4 1667 2 600596.7 60.06

60.30 0.3324023.9 2.40

2.55 0.2011.75

11.88 0.18

selulase+ β-gluko sidase

60.10 0.27 2.46 0.12 11.8 0.18

pektinase+ I 0.6509 0.382 -0.0123 0.0048 82.3 3 10 0.3 1667 2 914443.9 91.44 91.21 0.33 27433.3 2.74 2.74 0.009 12.5 12.8 0.35

95

0.6509 0.38 -0.0123 0.0048 81.883 3 10 0.3 1667 2 909805.2 90.98 27294.2 2.73 130.6464 0.4 -0.0123 0.0048 86.057 3.12 10 0.312 1667 2 919415.7 91.94 91.942 28685.8 2.87 2.87 13 13

β-gluko sidase

II 91.58 0.52 2.80 0.094 12.88 0.18

0.6509 0.482 -0.0123 0.0048 103.174 5.68 10 0.568 1667 2 605482 60.55 34391.4 3.44 13.5I 0.6509 0.527 -0.0123 0.0048 112.568 5.88 10 0.588 1667 2 638137.9 63.81

62.18 2.3137522.5 3.75

3.60 0.2213.5

13.5 0

0.6464 0.528 -0.0123 0.0048 112.776 5.72 10 0.572 1667 2 657204.3 65.72 37592.1 3.76 13.5II 0.6464 0.541 -0.0123 0.0048 115.49 6 10 0.6 1667 2 641610.6 64.16

64.94 1.1038496.6 3.85

3.80 0.06414

13.8 0.35

selulase+

pektinase+ β-gluko sidase

63.56 1.95 3.70 0.15 13.63 0.18

Keterangan: Ul = Ulangan Ws2 = Berat sampel setelah pengeringan beku As = Absorban sampel Ab = Absorban blanko Ase = Absorban selisih (As-Ab) a = Intercep b = Slope X = Konsentrasi vanilin yang terbaca pada spektrofotometer KBk = Kadar berat kering Vf = Volume filtrat WtBk = Total berat kering fp = Faktor pengenceran Va = Volume akhir Kg ekstrak (bk) = Kadar glukosa atas dasar berat kering Kg ekstrak (bb) = Kadar glukosa atas dasar berat basah TPT = Total padatan terlarut x = rata-rata SD = Standar deviasi

96

Lampiran 9 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dalam penentuan konsentrasi optimum enzim β-glukosidase

Kv ekstrak (bk)

Kv ekstrak (bb) Perlakuan

Ul

Ws2 (g)

As

Ab

Ase

a

b

X (Ug/ml)

KBk (% w/v)

Vf (ml)

WtBk (g)

fp

Va (ml)

(Ug/g)

(%)

x (%)

SD

(Ug/ml)

%

x (%)

SD

0.6509 0.342 0.07 0.272 0.0338 0.1488 1.6011 0.84 22.7 0.1907 75.7 25 15884.07 1.588 133.43 0.013I 0.6509 0.331 0.072 0.259 0.0338 0.1488 1.5137 0.84 23 0.1932 76.7 25 15017.18 1.502

1.54 0.061126.14 0.013

0.013 0.00051

0.6464 0.324 0.07 0.254 0.0338 0.1488 1.4801 0.84 23.2 0.1949 77.3 25 14683.76 1.468 123.34 0.012II 0.6464 0.335 0.072 0.263 0.0338 0.1488 1.5406 0.84 22.9 0.1924 76.3 25 15283.91 1.528

1.50 0.042128.38 0.013

0.013 0.00036

0 unit

1.52 0.013 0.013 0.00028

0.6509 0.294 0.026 0.268 0.0338 0.1488 1.5742 1.24 20.2 0.2505 1010 25 158692.2 15.87 1967.8 0.20I 0.6509 0.274 0.026 0.248 0.0338 0.1488 1.4398 1.2 20.6 0.2472 1030 25 149978.4 15

15.43 0.621799.7 0.18

0.19 0.012

0.6464 0.281 0.026 0.255 0.0338 0.1488 1.4868 1.2 20.8 0.2496 1040 25 154879.6 15.49 1858.6 0.19II 0.6464 0.29 0.026 0.264 0.0338 0.1488 1.5473 1.2 21 0.252 1050 25 161181.3 16.12

15.80 0.451934.2 0.19

0.19 0.0054

10 unit

15.60 0.12 0.19 0.00089

0.6509 0.312 0.03 0.272 0.0338 0.1488 1.6011 1.28 20 0.256 1000 25 156358.8 15.64 2001.4 0.20I 0.6509 0.32 0.03 0.278 0.0338 0.1488 1.6414 1.28 19.7 0.2522 985 25 160297.3 16.03

15.83 0.282051.8 0.21

0.20 0.0036

0.6464 0.334 0.03 0.286 0.0338 0.1488 1.6952 1.28 20.3 0.2598 1015 25 165548.6 16.55 2119 0.21II 0.6464 0.302 0.03 0.272 0.0338 0.1488 1.6011 1.24 20.6 0.2554 1030 25 161402.6 16.14

16.35 0.292001.4 0.20

0.21 0.0083

20 unit

16.09 0.01 0.20 0.0024

0.6509 0.33 0.029 0.301 0.0338 0.1488 1.796 1.32 19.3 0.2548 965 25 170079.9 17.01 2245.1 0.23I 0.6509 0.326 0.031 0.295 0.0338 0.1488 1.7557 1.32 18.8 0.2482 940 25 166260.7 16.63

16.82 0.272194.6 0.22

0.22 0.0036

0.6464 0.335 0.029 0.306 0.0338 0.1488 1.8297 1.32 18.7 0.2468 935 25 173262.5 17.33 2287.1 0.23II 0.6464 0.332 0.031 0.301 0.0338 0.1488 1.796 1.32 18.5 0.2442 925 25 170079.9 17.01

17.17 0.232245.1 0.23

0.23 0.003

30 unit

16.99 0.032 0.22 0.0033

0.6509 0.333 0.031 0.302 0.0338 0.1488 1.8028 1.36 17.5 0.238 875 25 165695.4 16.57 2253.5 0.2340 unit I

0.6509 0.344 0.031 0.313 0.0338 0.1488 1.8767 1.4 16.9 0.2366 845 25 167562.9 16.7616.66 0.13

2345.9 0.240.23 0.0065

97

0.6464 0.347 0.031 0.316 0.0338 0.1488 1.8969 1.36 17.7 0.2407 885 25 174344.6 17.43 2371.1 0.24II 0.6464 0.362 0.031 0.331 0.0338 0.1488 1.9977 1.4 16.5 0.231 825 25 178365.7 17.84

17.63 0.282497.1 0.25

0.24 0.0089

17.15 0.11 0.24 0.0095

0.6509 0.335 0.029 0.306 0.0338 0.1488 1.8297 1.44 16.6 0.239 830 25 158824 15.88 2287.1 0.23I 0.6509 0.346 0.029 0.317 0.0338 0.1488 1.9036 1.44 17.2 0.2477 860 25 165242.3 16.52

16.20 0.452379.5 0.24

0.23 0.0065

0.6464 0.356 0.029 0.327 0.0338 0.1488 1.9708 1.44 17.9 0.2578 895 25 171077.1 17.11 2463.5 0.25II 0.6464 0.369 0.029 0.34 0.0338 0.1488 2.0582 1.48 16.5 0.2442 825 25 173833.7 17.38

17.25 0.202572.7 0.26

0.25 0.0077

50 unit

16.72 0.18 0.24 0.013

0.6509 0.333 0.029 0.304 0.0338 0.1488 1.8162 1.44 16.5 0.2376 825 25 157657 15.77 2270.3 0.23I 0.6509 0.346 0.03 0.316 0.0338 0.1488 1.8969 1.48 16.1 0.2383 805 25 160208.6 16.02

15.89 0.182371.1 0.24

0.23 0.0071

0.6464 0.368 0.029 0.339 0.0338 0.1488 2.0515 1.48 16.3 0.2412 815 25 173266 17.33 2564.3 0.26II 0.6464 0.366 0.03 0.336 0.0338 0.1488 2.0313 1.48 16 0.2368 800 25 171562.8 17.16

17.24 0.122539.1 0.25

0.26 0.0018

60 unit

16.57 0.042 0.24 0.016

Keterangan: Ul = Ulangan Ws2 = Berat sampel setelah pengeringan beku As = Absorban sampel Ab = Absorban blanko Ase = Absorban selisih (As-Ab) a = Intercep b = Slope X = Konsentrasi vanilin yang terbaca pada spektrofotometer KBk = Kadar berat kering Vf = Volume filtrat WtBk = Total berat kering fp = Faktor pengenceran Va = Volume akhir Kv ekstrak (bk) = Kadar vanillin atas dasar berat kering Kv ekstrak (bb) = Kadar vanillin atas dasar berat basah x = rata-rata SD = Standar deviasi

98

Lampiran 10 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dalam penentuan konsentrasi optimum enzim β-glukosidase

Kg ekstrak (bk)

Kg ekstrak (bb) Perlakuan

Ul

Ws2 (g)

As

a

b

X (Ug/ml)

KBk (% w/v)

Vf (ml)

WtBk (g)

fp

Va (ml) (Ug/g) (g/g bk)

x (%)

SD (Ug/ml) %

x %

SD

TPT (brix)

x

SD

0.6509 0.289 -0.0123 0.0048 62.88696 0.84 10 0.084 20.83 2 31193.9 3.12 262 0.03 0I 0.6509 0.280 -0.0123 0.0048 61.00829 0.84 10 0.084 20.83 2 30262 3.03

3.07 0.066254.2 0.03

0.026 0.000580

0 0

0.6464 0.301 -0.0123 0.0048 65.39186 0.84 10 0.084 20.83 2 32436.4 3.24 272.5 0.03 0.25II 0.6464 0.287 -0.0123 0.0048 62.46948 0.84 10 0.084 20.83 2 30986.8 3.10

3.17 0.10260.3 0.03

0.027 0.000290

0.13 0.18 0 unit

3.12 0.070 0.026 0.00058 0.063 0.088

0.6509 0.38 -0.0123 0.0048 81.88247 1.24 10 0.124 555.6 2 733714 73.37 9098 0.91 6I 0.6509 0.365 -0.0123 0.0048 78.75134 1.2 10 0.12 555.6 2 729179 72.92

73.15 0.328750 0.88

0.89 0.00336

6 0

0.6464 0.382 -0.0123 0.0048 82.29995 1.2 10 0.12 555.6 2 762037 76.20 9144 0.91 7II 0.6464 0.367 -0.0123 0.0048 79.16883 1.2 10 0.12 555.6 2 733045 73.30

74.75 2.058797 0.88

0.90 0.00166.5

6.75 0.3510 unit

73.95 1.14 0.9 0.0033 6.38 0.53

0.6509 0.413 -0.0123 0.0048 88.77095 1.28 10 0.128 555.6 2 770581 77.06 9863 0.99 6.5I 0.6509 0.403 -0.0123 0.0048 86.68353 1.28 10 0.128 555.6 2 752461 75.25

76.15 1.289632 0.96

0.98 0.0167

6.75 0.35

0.6464 0.422 -0.0123 0.0048 90.64963 1.28 10 0.128 555.6 2 786889 78.69 10072 1.01 7II 0.6464 0.394 -0.0123 0.0048 84.80486 1.24 10 0.124 555.6 2 759900 75.99

77.34 1.919423 0.94

0.98 0.0467

7 020 unit

76.75 0.84 0.98 0 6.88 0.18

0.6509 0.447 -0.0123 0.0048 95.86817 1.32 10 0.132 555.6 2 806971 80.7 10652 1.07 7.75I 0.6509 0.439 -0.0123 0.0048 94.19824 1.32 10 0.132 555.6 2 792914 79.29

79.99 0.9910466 1.05

1.06 0.0137

7.38 0.53

0.6464 0.444 -0.0123 0.0048 95.24195 1.32 10 0.132 555.6 2 801700 80.17 10582 1.06 7.5II 0.6464 0.456 -0.0123 0.0048 97.74685 1.32 10 0.132 555.6 2 822785 82.28

81.22 1.4910861 1.09

1.07 0.0207.5

7.5 030 unit

80.61 0.87 1.06 0.012 7.44 0.088

0.6509 0.469 -0.0123 0.0048 100.4605 1.36 10 0.136 555.6 2 820756 82.08 11162 1.12 7I 0.6509 0.475 -0.0123 0.0048 101.7129 1.4 10 0.14 555.6 2 807246 80.72

81.40 0.9611301 1.13

1.12 0.00987.75

7.38 0.53

0.6464 0.476 -0.0123 0.0048 101.9217 1.36 10 0.136 555.6 2 832694 83.27 11325 1.13 7.5II 0.6464 0.484 -0.0123 0.0048 103.5916 1.4 10 0.14 555.6 2 822156 82.22

82.74 0.7511510 1.15

1.14 0.0137.5

7.5 040 unit

82.07 0.95 1.13 0.013 7.44 0.088

0.6509 0.481 -0.0123 0.0048 102.9654 1.44 10 0.144 555.6 2 794486 79.45 11441 1.14 8.5I 0.6509 0.479 -0.0123 0.0048 102.5479 1.44 10 0.144 555.6 2 791265 79.13

79.29 0.2311394 1.14

1.14 0.00338.5

8.5 0

0.6464 0.489 -0.0123 0.0048 104.6353 1.44 10 0.144 555.6 2 807371 80.74 11626 1.16 8.5II 0.6464 0.502 -0.0123 0.0048 107.349 1.48 10 0.148 555.6 2 805923 80.59

80.67 0.1011928 1.19

1.18 0.0208.5

8.5 050 unit 79.98 0.97 1.16 0.025 8.5 0

0.6509 0.469 -0.0123 0.0048 100.4605 1.44 10 0.144 555.6 2 775158 77.52 11162 1.12 8.5I 0.6509 0.477 -0.0123 0.0048 102.1304 1.48 10 0.148 555.6 2 766745 76.67

78.58 0.6011348 1.13

1.13 0.0138.5

8.5 0

0.6464 0.496 -0.0123 0.0048 106.0965 1.48 10 0.148 555.6 2 796520 79.65 11789 1.18 8.5II 0.6464 0.590 -0.0123 0.0048 125.7183 1.48 10 0.148 555.6 2 943831 94.38

79.65 10.4213969 1.40

1.29 0.158.5

8.5 060 unit

79.12 0.76 1.21 0.12 8.5 0

99

Keterangan: Ul = Ulangan Ws2 = Berat sampel setelah pengeringan beku As = Absorban sampel Ab = Absorban blanko Ase = Absorban selisih (As-Ab) a = Intercep b = Slope X = Konsentrasi vanilin yang terbaca pada spektrofotometer KBk = Kadar berat kering Vf = Volume filtrat WtBk = Total berat kering fp = Faktor pengenceran Va = Volume akhir Kg ekstrak (bk) = Kadar glukosa atas dasar berat kering Kg ekstrak (bb) = Kadar glukosa atas dasar berat basah TPT = Total padatan terlarut x = rata-rata SD = Standar deviasi Lampiran 11 Kadar vanilin ekstrak buah vanili segar dalam penentuan waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase

Kv ekstrak (bk) Kv ekstrak (bb) Perlakuan

Ul

Ws2 g

As

Ab

Ase

a

b

X (Ug/ml)

KBk (% w/v)

Vf (ml)

WtBk (g)

fp

Va (ml) (Ug/g) (%)

x (%)

SD

(Ug/ml) % x

(%)

SD

0.6509 0.301 0.1 0.201 0.0338 0.1488 1.1239 0.76 21.3 0.1619 53.3 25 9242.37 0.924 70.242 0.007I 0.6509 0.285 0.101 0.184 0.0338 0.1488 1.0096 0.8 22 0.176 55 25 7887.52 0.789

0.86 0.09663.1 0.0063

0.0067 0.0005

0.6464 0.323 0.1 0.223 0.0338 0.1488 1.2717 0.76 21.8 0.1657 54.5 25 10458.5 1.046 79.484 0.0079II 0.6464 0.307 0.101 0.206 0.0338 0.1488 1.1575 0.76 22.1 0.168 55.3 25 9518.75 0.952

0.10 0.06672.343 0.0072 0.0076 0.0005

0 jam 0.93 0.10 0.0071 0.0007

0.6509 0.278 0.029 0.249 0.0338 0.1488 1.4465 1.2 20.7 0.2484 1035 25 150679 15.07 1808.1 0.18I 0.6509 0.283 0.032 0.251 0.0338 0.1488 1.46 1.24 19.6 0.243 980 25 147173 14.72

14.89 0.251824.9 0.18

0.18 0.00124 jam

II 0.6464 0.272 0.027 0.245 0.0338 0.1488 1.4196 1.16 21 0.2436 1050 25 152977 15.3 15.19 0.15 1774.5 0.18 0.18 0.0018

100

0.6464 0.269 0.027 0.242 0.0338 0.1488 1.3995 1.16 20.4 0.2366 1020 25 150804 15.08 1749.3 0.17

15.04 0.21 0.18 0.0039

0.6509 0.277 0.027 0.25 0.0338 0.1488 1.4532 1.2 20.6 0.2472 1030 25 151379 15.14 1816.5 0.18I 0.6509 0.279 0.026 0.253 0.0338 0.1488 1.4734 1.2 21.1 0.2532 1055 25 153479 15.35

15.24 0.151841.8 0.18

0.18 0.0018

0.6464 0.273 0.027 0.246 0.0338 0.1488 1.4263 1.16 19.8 0.2297 990 25 153701 15.37 1782.9 0.18II 0.6464 0.291 0.027 0.264 0.0338 0.1488 1.5473 1.2 19.6 0.2352 980 25 161181 16.12

15.74 0.531934.2 0.19

0.19 0.0118 jam

15.49 0.35 0.18 0.0021

0.6509 0.275 0.036 0.239 0.0338 0.1488 1.3793 1.2 20.1 0.2412 1005 25 143677 14.37 1724.1 0.17I 0.6509 0.288 0.04 0.248 0.0338 0.1488 1.4398 1.24 19.4 0.2406 970 25 145140 14.51

14.44 0.101799.7 0.18

0.18 0.0053

0.6464 0.302 0.034 0.268 0.0338 0.1488 1.5742 1.24 19.2 0.2381 960 25 158692 15.87 1967.8 0.20II 0.6464 0.295 0.036 0.259 0.0338 0.1488 1.5137 1.24 19 0.2356 950 25 152594 15.26

15.56 0.431892.2 0.19

0.19 0.005312 jam

15.00 0.79 0.18 0.012

0.6509 0.289 0.042 0.247 0.0338 0.1488 1.4331 1.28 18.4 0.2355 920 25 139948 13.99 1791.3 0.18I 0.6509 0.294 0.038 0.256 0.0338 0.1488 1.4936 1.28 18.3 0.2342 915 25 145856 14.59

14.29 0.421867 0.19

0.18 0.0053

0.6464 0.293 0.038 0.255 0.0338 0.1488 1.4868 1.28 19 0.2432 950 25 145200 14.52 1858.6 0.19II 0.6464 0.309 0.038 0.271 0.0338 0.1488 1.5944 1.28 18.7 0.2394 935 25 155702 15.57

15.05 0.741993 0.20

0.19 0.009516 jam

14.67 0.53 0.19 0.0068

0.6509 0.272 0.033 0.239 0.0338 0.1488 1.3793 1.28 17.9 0.2291 895 25 134697 13.47 1724.1 0.17I 0.6509 0.276 0.039 0.237 0.0338 0.1488 1.3659 1.28 18.9 0.2419 945 25 133384 13.34

13.40 0.0931707.3 0.17

0.17 0.0012

0.6464 0.319 0.036 0.283 0.0338 0.1488 1.6751 1.32 17.2 0.227 860 25 158622 15.86 2093.8 0.21II 0.6464 0.311 0.035 0.276 0.0338 0.1488 1.628 1.32 16.9 0.2231 845 25 154167 15.42

15.64 0.322035 0.20

0.21 0.004220 jam

14.52 1.58 0.19 0.025

0.6509 0.297 0.033 0.264 0.0338 0.1488 1.5473 1.32 16.9 0.2231 845 25 146528 14.65 1934.2 0.19I 0.6509 0.273 0.034 0.239 0.0338 0.1488 1.3793 1.28 18.6 0.2381 930 25 134697 13.47

14.06 0.841724.1 0.17

0.18 0.0149

0.6464 0.306 0.036 0.27 0.0338 0.1488 1.5877 1.32 16.5 0.2178 825 25 150348 15.03 1984.6 0.20II 0.6464 0.301 0.034 0.267 0.0338 0.1488 1.5675 1.32 16.9 0.2231 845 25 148438 14.84

14.94 0.141959.4 0.20

0.2 0.001824 jam

14.5 0.62 0.19 0.010

101

Keterangan: Ul = Ulangan Ws2 = Berat sampel setelah pengeringan beku As = Absorban sampel Ab = Absorban blanko Ase = Absorban selisih (As-Ab) a = Intercep b = Slope X = Konsentrasi vanilin yang terbaca pada spektrofotometer KBk = Kadar berat kering Vf = Volume filtrat WtBk = Total berat kering fp = Faktor pengenceran Va = Volume akhir Kv ekstrak (bk) = Kadar vanillin atas dasar berat kering Kv ekstrak (bb) = Kadar vanillin atas dasar berat basah x = rata-rata SD = Standar deviasi Lampiran 12 Kadar glukosa ekstrak buah vanili segar dalam penentuan waktu inkubasi optimum enzim β-glukosidase

Kg ekstrak (bk) Kg ekstrak (bb) Perlakuan

Ul

Ws2 (g)

As

A

b

X (Ug/ml)

KBk (% w/v)

Vf (ml)

WtBk (g)

fp

Va (ml) (Ug/g) (%)

x (%)

SD (Ug/ml) %

x (%)

SD

TPT (brix)

x

SD

0.6509 0.211 -0.0123 0.0048 46.6051 0.76 10 0.076 15.63 2 19163.3 1.92 145.6 0.015 0I 0.6509 0.221 -0.0123 0.0048 48.6925 0.8 10 0.08 15.63 2 19020.5 1.90

1.91 0.01152.2 0.015

0.015 0.000460

0 0

0.6464 0.224 -0.0123 0.0048 49.3187 0.76 10 0.076 15.63 2 20279.1 2.03 154.1 0.015 0.25II 0.6464 0.221 -0.0123 0.0048 48.6925 0.76 10 0.076 15.63 2 20021.6 2.00

2.02 0.02152.2 0.015

0.015 0.000140

0.13 0.180 jam

1.96 0.075 0.015 0.0003 0.063 0.088

0.6509 0.368 -0.0123 0.0048 79.3776 1.2 10 0.12 555.6 2 734977 73.50 8820 0.88 5.5I 0.6509 0.373 -0.0123 0.0048 80.4213 1.24 10 0.124 555.6 2 720621 72.06

72.781.02 8936 0.89

0.89 0.00825.5

5.5 0

0.6464 0.359 -0.0123 0.0048 77.4989 1.16 10 0.116 555.6 2 742327 74.23 8611 0.86 5II 0.6464 0.366 -0.0123 0.0048 78.9601 1.16 10 0.116 555.6 2 756323 75.63

74.93 0.998773 0.88

0.87 0.0125

5 04 jam

73.86 1.52 0.88 0.013 5.25 0.35

0.6509 0.376 -0.0123 0.0048 81.0475 1.2 10 0.12 555.6 2 750440 75.04 9005 0.90 5.75I 0.6509 0.366 -0.0123 0.0048 78.9601 1.2 10 0.12 555.6 2 731112 73.11

74.08 1.378773 0.88

0.89 0.0165.5

5.63 0.18

0.6464 0.36 -0.0123 0.0048 77.7076 1.16 10 0.116 555.6 2 744326 74.43 8634 0.863 5.5II 0.6464 0.381 -0.0123 0.0048 82.0912 1.2 10 0.12 555.6 2 760104 76.01

75.22 1.129121 0.912

0.89 0.0346

5.75 0.358 jam

74.65 0.81 0.89 0.0008 5.69 0.088

102

0.6509 0.361 -0.0123 0.0048 77.9164 1.2 10 0.12 555.6 2 721448 72.14 8657 0.866 6.75I 0.6509 0.384 -0.0123 0.0048 82.7174 1.24 10 0.124 555.6 2 741196 74.12

73.13 1.409191 0.919

0.89 0.0387

6.88 0.18

0.6464 0.38 -0.0123 0.0048 81.8825 1.24 10 0.124 555.6 2 733714 73.37 9098 0.91 7.5II 0.6464 0.393 -0.0123 0.0048 84.5961 1.24 10 0.124 555.6 2 758030 75.8

74.59 1.729400 0.94

0.93 0.0217.5

7.5 012 jam

73.86 1.03 0.91 0.023 7.19 0.44

0.6509 0.382 -0.0123 0.0048 82.3 1.28 10 0.128 555.6 2 714409 71.44 9144 0.914 7I 0.6509 0.371 -0.0123 0.0048 80.0038 1.28 10 0.128 555.6 2 694477 69.45

70.44 1.418889 0.889

0.90 0.0187

7 0

0.6464 0.388 -0.0123 0.0048 83.5524 1.28 10 0.128 555.6 2 725281 72.53 9284 0.928 7.5II 0.6464 0.394 -0.0123 0.0048 84.8049 1.28 10 0.128 555.6 2 736153 73.62

73.07 0.779423 0.942

0.94 0.00987.5

7.5 016 jam

71.76 1.86 0.92 0.024 7.25 0.35

0.6509 0.379 -0.0123 0.0048 81.6737 1.28 10 0.128 555.6 2 708973 70.9 9075 0.907 7.25I 0.6509 0.372 -0.0123 0.0048 80.2125 1.28 10 0.128 555.6 2 696289 69.63

70.26 0.908913 0.891

0.90 0.0127

7.13 0.18

0.6464 0.407 -0.0123 0.0048 87.5185 1.32 10 0.132 555.6 2 736688 73.67 9724 0.972 7.75II 0.6464 0.393 -0.0123 0.0048 84.5961 1.32 10 0.132 555.6 2 712089 71.21

72.44 1.749400 0.94

0.96 0.0237.5

7.63 0.1820 jam

71.35 1.54 0.93 0.04 7.38 0.35

0.6509 0.41 -0.0123 0.0048 88.1447 1.32 10 0.132 555.6 2 741959 74.2 9794 0.979 7.5I 0.6509 0.387 -0.0123 0.0048 83.3437 1.28 10 0.128 555.6 2 723469 72.35

73.27 1.319260 0.926

0.95 0.0387.5

7.5 0

0.6464 0.42 -0.0123 0.0048 90.2321 1.32 10 0.132 555.6 2 759530 75.95 10026 1.003 8II 0.6464 0.431 -0.0123 0.0048 92.5283 1.32 10 0.132 555.6 2 778858 77.89

76.92 1.3710281 1.028

1.02 0.0188.5

8.25 0.3524 jam

75.10 2.58 0.98 0.044 7.88 0.53

Keterangan: Ul = Ulangan Ws2 = Berat sampel setelah pengeringan beku As = Absorban sampel Ab = Absorban blanko Ase = Absorban selisih (As-Ab) a = Intercep b = Slope X = Konsentrasi vanilin yang terbaca pada spektrofotometer KBk = Kadar berat kering Vf = Volume filtrat WtBk = Total berat kering fp = Faktor pengenceran Va = Volume akhir Kg ekstrak (bk) = Kadar glukosa atas dasar berat kering Kg ekstrak (bb) = Kadar glukosa atas dasar berat basah TPT = Total padatan terlarut x = rata-rata SD = Standar deviasi