1

Efek Cekaman Kromium terhadap Profil Protein dan Aktivitas Enzim Glutathion Reduktase pada Biji Sorghum

bicolor (L.) Moench

(The Effect of Stress Chromium on Protein Profile and Glutathione Reductase Activity of Sorghum bicolor (L.)

Moench Seeds)

Oleh :

Nisvi Kusumawardani NIM: 412011006

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi sebagian dari persyaratan untuk memperoleh gelar sarjana Sains (Biologi) dari Program Studi

Biologi, Fakultas Biologi

Fakultas Biologi Universitas Kristen Satya Wacana

Salatiga 2015

2

3

4

1

ABSTRAK

Soil contamination by chromium is increasing due to anthropogenic

activities. Chromium is known to be toxic to plants. Toxicity effects of

chromium inhibits most physiological processes at all levels of plant

metabolism. In this study, Cr toxicity on SDS-PAGE protein profile and

glutathione reductase activity was studied in sorghum seeds. Seeds were

harvested from three varieties sorghum plants which were growth in Hoagland

medium with 5 treatments i.e. control, trivalent chromium (two treatments

i.e. 500 mg Cr/L CrCl3 and 500 mg Cr/L KCr(SO4)2) and hexavalent treatments

(two treatments i.e. 5 mg Cr/L K2CrO4 and 5 mg Cr/L K2Cr2O7). Characterization

using SDS PAGE showed that the protein profile of three varieties of sorghum

seeds from chomium treated plants was different from control plants. The

banding patterns of protein profile in seeds from chromium treated sorghum

plants revealed both qualitative and quantitative changes. Chromium

treatments, either trivalent or hexavalent increased the number of

polypeptides synthesized in Kawali and Keris M3 varieties seeds, but inhibited

in Numbu. In three sorghum varieties were used, the band intensity of

glutathione reductase enzyme was increased by chromium treatments.

Moreover, in the three varieties of sorghum seeds, glutathione reductase

activity increased significantly as a result of treatments of chromium. The total

protein content in the seeds of three varieties of sorghum also increased

significantly as a result of treatment of chromium. In conclusion, the seeds

proteins extracted from chromium treated sorghum plants showed variation in

the range of molecular weights, total protein contents, and glutathione

reductase activity compared to control plants.

Key words: Chromium, seed, sorghum, protein profile, glutathione reductase

LATAR BELAKANG

Kromium (Cr) secara alami tersedia di alam, dan biasanya terdapat di

batu-batuan, tanah, tumbuhan, udara, dan hewan (Shanker et al. 2005).

Aktivitas manusia seperti pembuatan asam kromat, pelapisan logam, industri

tekstil, penyamakan kulit (Liu et al. 2009; Yadav, 2010; Mongkhonsin et al.

2011), produksi senyawa kimia mengandung Cr, dan penggunaan pupuk dan

pestisida dapat meningkatkan pencemaran Cr di lingkungan (Bielicka et al.

2005). Cr termasuk kelompok logam transisi yang berada pada kelompok VIB

pada tabel periodik unsur dan ditemukan dalam beberapa bentuk, seperti ion,

2

kompleks senyawa anorganik dan ligand organik, serta partikel koloid (Bielicka

et al. 2005). Cr digolongkan ke dalam logam berat karena memiliki sifat-sifat

logam, memiliki berat spesifik lebih dari 5 g/m3, dan memiliki nomor atom

>20 (Zayed dan Terry, 2003). Menurut Revathi et al. (2011), konsentrasi Cr

dalam tanah berkisar antara 0,1 sampai dengan 250 ppm, dan di daerah

tertentu terdapat tanah yang mengandung kromium sebesar 400 ppm. Secara

keseluruhan, sebagian besar tanah telah terbukti mengandung kromium

dengan rata-rata 50 ppm (Hartel, 1986).

Spesies Cr yang bentuknya stabil di lingkungan adalah Cr (III) dan Cr (VI)

(Shanker et al. 2005; Yu dan Gu, 2008). Cr(III) dan Cr(VI) memiliki perbedaan

dalam hal mobilitas, kelarutan, reaktivitas, ketersediaan, dan toksisitas (Yu dan

Gu, 2008; Oliveira, 2012). Berdasarkan toksisitasnya, diketahui bahwa Cr(VI)

lebih toksik dibandingkan dengan Cr(III) (Panda dan Patra, 1997). Jenis Cr(VI)

yang paling dominan dilaporkan adalah kromat (CrO42-) dan dikromat (CrO7

2-).

Menurut Bartlett (1991), Cr(VI) dalam bentuk kromat dan dikromat memiliki

kelarutan sangat tinggi di dalam air. Cr(III) keberadaannya lebih dominan, dan

dapat dioksidasi menjadi Cr(VI) (Hashim et al. 2011; Violante et al. 2007).

Cr merupakan logam berat non essensial dan bersifat toksik bagi

tumbuhan (Shanker et al.2005). Menurut Shanker et al. (2005) Cr(VI) adalah

oksidan kuat dengan potensial redoks tinggi pada kisaran1,33-1,38 Ev untuk

generasi yang cepat dan ROS yang tinggi serta toksisitas yang dihasilkannya,

sehingga mengakibatkan cekaman oksidatif (Manara, 2012). Cr(VI) memicu

terbentuknya spesies oksigen reaktif, seperti oksida (O2-), hidrogen peroksida

(H2O2), dan hidroksil (OH-) (Zhou et al. 2009). Cr(VI) juga dapat mengakibatkan

penurunan biomassa tanaman (Shanker et al. 2005; Zhang et al. 2009),

mengganggu pertumbuhan dan perkembangan tanaman, serta mengakibatkan

kerusakan protein (Vajpayee et al. 2000; Panda dan Choudhury, 2004), lemak,

dan DNA (Kohen dan Nyska, 2002).

Salt et al. (1998) menyatakan bahwa mekanisme molekuler dalam proses

detoksifikasi logam berat sangat penting untuk mengembangkan tanaman

sebagai agen fitoremediasi pada daerah terkontaminasi. Protein merupakan

ekspresi dari gen, karakter fenotip sebagai hasil interaksi antara faktor genotip

dan lingkungan (Brock et al. 1992). Beberapa penelitian melaporkan bahwa

tanaman mengekspresikan protein spesifik sebagai respon terhadap akumulasi

logam berat dan kadar garam di lingkungan, seperti senyawa osmolit dan

fitokelatin (Hirata et al. (2005); Inouhe (2005); dan Nayer dan Reza (2007).

3

Rodriguez (1996) dan Jemal et al. (1998) menyatakan bahwa salah satu cara

untuk mengetahui keberadaan protein cekaman dapat dilakukan dengan

analisa profil protein. Analisa profil protein dapat dilakukan dengan metode

SDS-PAGE (Laemmli, 1970) yang merupakan metode pemisahan protein

berdasarkan perbedaan berat molekulnya (Bollag et al. 1991).

Mekanisme toleransi pada spesies dan varietas tumbuhan yang berbeda

dikontrol oleh gen yang berbeda serta melalui lintasan biokimia yang berbeda

pula. Kelompok tumbuhan akumulator mempunyai mekanisme khusus untuk

dapat mengakumulasi logam dengan kadar tinggi dan dapat

mendetoksifikasinya di dalam sel. Tumbuhan memiliki mekanisme toleransi

terhadap toksisitas Cr, yaitu melalui detoksifikasi dengan mengubah valensi Cr

(VI) menjadi Cr (III). Pengubahan valensi tersebut dengan proses reduksi secara

enzimatis maupun oleh senyawa pereduksi di dalam sel, misalnya

menggunakan enzim kromat reduktase seperti pada bakteri (Thato et al. 2014).

Salah satu jenis tumbuhan potensial yang perlu dikaji mekanisme toleransinya

terhadap cekaman kromium adalah Sorgum (Sorghum bicolor), karena belum

banyak diteliti dan dilaporkan. Sorghum bicolor merupakan tanaman sereal

yang tumbuhnya mencapai 5 m, termasuk ke dalam famili Poaceae (Dial,

2012). Tanaman ini mampu tumbuh di daerah dengan curah hujan marjinal,

dan suhu tinggi (Barcelos et al. 2011). Sorgum dipilih dalam penelitian, karena

merupakan tanaman pangan, banyak dibudidayakan di Indonesia, mudah

diperoleh, mampu tumbuh pada kondisi tanah yang terkontaminasi logam

berat, dan toleran pada kondisi tanah yang basah maupun kering (Agustina et

al. 2010; Revathi et al. 2011). Pernyataan ini diperkuat oleh Revathi et al.

(2011) yang menyatakan bahwa sorgum adalah salah satu jenis tanaman

akumulator logam berat yang produktivitasnya sangat dipengaruhi oleh adanya

cekaman logam berat.

Gambar 1. Siklus reduksi-oksidasi glutathion (Testa et al. 1995)

4

Mekanisme sorgum dalam menghambat toksisitas Cr, yaitu dengan

menggunakan enzim glutathion reduktase (Malmir, 2011). Enzim glutathione

reduktase berperan dalam mengkatalisis substratnya, yaitu GSSG (glutathion

teroksidasi) menjadi GSH (glutathion tereduksi) dengan bantuan NADPH

sebagai koenzimnya (Winarsi, 2007). Enzim ini berlokasi di berbagai

kompartemen subselular seperti kloroplas, sitosol, mitokondria dan

peroksisom (Edwards et al. 1990; Jimenez et al. 1997). Malmir (2011),

melaporkan bahwa hiperaktivitas glutathion reduktase menunjukkan bahwa

enzim ini memainkan peran penting dalam melindungi sorgum dari toksisitas

Cr(VI).

Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis pengaruh cekaman Cr(III) dan

Cr(VI) terhadap profil protein dan menganalisis aktivitas enzim gluthation

reduktase pada biji S. bicolor.

METODOLOGI PENELITIAN

Penelitian dilakukan secara eksperimental. Rancangan penelitian yang

digunakan adalah rancangan acak faktorial dengan 2 faktor, yaitu perlakuan Cr

dan varietas biji sorgum. Setiap perlakuan dengan 5 ulangan, setiap sub-unit

percobaan terdiri dari 1 bulir sorgum.

Gambar 2. Biji S. bicolor varietas Numbu Keris M3, dan Kawali

Keterangan:

a. Kontrol

b. CrCl3

c. KCr(SO4)2

d. K2CrO4

e. K2Cr2O7

5

Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi, biji sorgum dari 3

varietas, yaitu varietas Numbu, Kawali, dan Keris M3. Biji sorgum diperoleh

dari hasil panen tanaman sorgum yang berumur 90 hari, yang yang

sebelumnya telah diberi perlakuan Cr(III) dan Cr(VI). Perlakuan Cr(III) dan Cr(VI)

dengan konsentrasi sebagai berikut, 0 mg Cr/L untuk kontrol, 500 mg Cr/L

untuk CrCl3 dan KCr(SO4)2, serta 5 mg Cr/L untuk K2CrO4 dan K2Cr2O7. Bahan

yang digunakan untuk pengukuran kandungan Cr(VI) pada biji sorgum, yaitu

H2SO4 pekat, tissue, HCl, HNO3, kertas saring, aseton, difenilkarbasid, dan

akuades. Bahan yang digunakan untuk pengukuran aktivitas enzim glutation

reduktase, yaitu NADPH (nikotinamida adenin dinukleotida fosfat), EDTA (asam

etilen diamin tetra asetat), Na-fosfat, GSSG (glutathion disulfida), dan DNTB

(dinitrothiocyanobenzene). Bahan yang digunakan untuk pengukuran total

protein dan profil protein SDS-PAGE (elektroforesis gel poliakrilamida- sodium

dodesil sulfat), di antaranya sukrosa, mercapto ethanol, Tris hidroklorida (HCl),

MgCl2, asam trikloroasetat (TCA), NaOH, Kalium fosfat, H2O, tissue, Tris-base,

Acrylamide/ Bis, SDS (sodium dodesil sulfat), APS (amonium persulfat), TEMED

(tetra metil etilen diamin), Coomassie Brilliant Blue G-250, methanol, asam

asetat, dan glisin.

Alat-alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi, timbangan analitik

(Shimadzu model TX323L), oven (Memmert), spektrofotometer (Shimadzu UV-

mini 1240), seperangkat alat elektroforesis (Bio-Rad), kuvet, mortar, pestel,

sentrifus (Eppendorf 5418), baki, beaker glass 10 ml; 100 ml; 250 ml; 500 ml;

1000 ml, microtube 1,5 ml; 2 ml, yellow tip, blue tip, mikropipet (Gilson), strirer,

batang pengaduk, spin bar, kaca, plastik, pipet ukur 5 ml; 10 ml, dan pilius.

METODE PENELITIAN

Pengukuran berat basah dan berat kering biji S. bicolor

Pengamatan pertumbuhan biji berdasarkan pada penentuan berat basah

dan berat kering. Biji S. bicolor ditimbang berat basahnya, kemudian

dikeringkan selama 3 hari menggunakan oven (Memmert) pada suhu 80oC.

Setelah kering, ditimbang berat keringnya menggunakan timbangan analitik

(Shimadzu model TX323L).

6

Pengukuran kandungan Cr(VI) pada biji S. bicolor

Pengukuran Cr(VI) dilakukan dengan metode difenilkarbazid secara

spektrofotometrik dengan cara destruksi kering menggunakan furnace

menurut metode Gheju et al. (2009). Biji yang telah dikeringkan, dihaluskan

menggunakan blender. Sebanyak 0,1 g serbuk sampel diabukan pada suhu

500OC selama 5 jam menggunakan furnace. Hasil pengabuan ditambahkan 5 ml

campuran 2 M HCl dan 1 M HNO3, disaring menggunakan kertas saring,

kemudian kandungan Cr(VI) diukur menggunakan metode difenilkarbazid

(Anonim, 1992).

Sampel yang telah didestruksi, diencerkan 50x dengan akuades. H2SO4

pekat digunakan untuk mengatur pH <2. Sebanyak 1 ml difenilkarbasid

ditambahkan dan dibiarkan selama 10-15 menit, kemudian diukur

absorbansinya menggunakan spektrofotometer (Shimadzu UV-mini 1240) pada

panjang gelombang 540 nm. Cr(VI) dari sampel akan bereaksi dengan

difenilkarbasid membentuk kompleks warna merah-ungu dalam kondisi asam

(Anonim, 1992). Kurva standar Cr(VI) dibuat dengan konsentrasi larutan

standar 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; dan 1 g Cr(VI) ml-1 (Anonim, 1992). Konsentrasi

Cr(VI) pada sampel dinyatakan dalam mg Cr(VI) g-1 berat kering sampel.

Penentuan total protein terlarut dan aktivitas enzim glutathion reduktase

Proses ekstraksi untuk memperoleh crude ekstrak protein menurut

metode Sunkar (2010). Crude ekstrak protein digunakan sebagai sampel dalam

pengukuran total protein terlarut dan aktivitas enzim glutathione reduktase biji

S. bicolor. Sebanyak 0,15 gram sampel biji dihaluskan, kemudian

dihomogenasikan dengan 1,5 ml buffer kalium fosfat 0,2 M pH 8,8. Homogenat

disentrifus dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4OC

menggunakan sentrifus (Eppendorf). Supernatan digunakan sebagai crude

ekstrak protein.

Penentuan total proetin terlarut menggunakan metode Bradford (1976).

Sebanyak 30l crude ekstrak protein diambil, ditambahkan 1,5 ml reagen

bradford, lalu divortek dan diinkubasi selama 10 menit. Absorbansinya diukur

dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Kurva standar BSA

dibuat dengan konsentrasi larutan standar 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; dan 1 g Cr ml-1.

Pada blanko, ekstrak diganti dengan buffer.

Proses pengukuran aktivitas enzim glutathione reduktase biji S. bicolor

dilakukan menurut Sunkar (2010). Sebanyak 10 μL sampel crude ekstrak

7

protein ditambahkan pada campuran yang terdiri atas 810 μL buffer Kalium

fosfat yang mengandung 2mM EDTA, 375 μL DTNB, dan 150 μL NADPH 0,1

mM. Sebanyak 150 μL GSSG 1 mM ditambahkan terakhir saat pengukuran nilai

absorbansi. Selanjutnya serapan dibaca pada panjang gelombang 412 nm

selama 3 menit pada suhu 25°C. Aktivitas enzim glutathione reduktase diukur

dengan mengikuti reduksi 5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) menjadi

2-nitro-5-thiobenzoic (TNB) oleh GSH. DTNB dan glutathion (GSH) bereaksi

untuk menghasilkan asam TNB yang memiliki warna kuning. GSSG (glutathione

teroksidasi) yang dihasilkan dari siklus oksidasi GSH dapat direduksi kembali

menjadi GSH oleh enzim glutation reduktase, kemudian GSH bereaksi dengan

DTNB lagi untuk menghasilkan lebih banyak asam 2-nitro-5-thiobenzoic (TNB).

Peningkatan absorbansi per satuan waktu dikarenakan pembentukan TNB

(Sunkar, 2011). Nilai koefisien ekstingsi TNB untuk penentuan aktivitas enzim

Glutathion reduktase adalah 14,15/M/cm. Aktivitas enzim dinyatakan dalam

mol TNB/mg protein.

Aktivitas enzim= (∑ GSH yang diproduksi/ 3 menit) x (1/ koefisien ekstingsi) x (volume total reaksi/ volume ekstrak yang diukur) x (total volume ekstrak/ berat basah sampel x total protein x 1000)

Analisis Profil Protein dengan SDS-PAGE

Ekstraksi protein

Proses ekstraksi protein dilakukan menurut metode Debbritto et al.

(2011). Sampel biji ditimbang sebanyak 500 mg, lalu dihaluskan dengan mortar

dan pestel dalam buffer ekstraksi (0,1 M Tris HCl pH 8,0; 0,01 M MgCl2; 18%

(w/v) Sukrosa; 40mM β-mercaptoethanol). Homogenat tersebut disentrifus

pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit, kemudian supernatan diambil,

lalu dicatat volumenya. 10% TCA ditambahkan sebanyak volume supernatan

(1:1). Campuran disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit.

Pellet diambil, dan dilarutkan dalam 50µl 0,2 N NaOH. Setelah itu disimpan

pada suhu -20OC untuk dianalisis lebih lanjut.

Running elektroforesis

Proses running elektroforesis dilakukan menurut metode Debbritto et al.

(2011). Separating gel 10% disiapkan dengan komposisi sebagai berikut, 2,45

ml H2O, 1,25 ml Tris 1,5 M pH 8,8, 1,25 ml Acrylamide/ Bis, SDS 10%, APS 10%,

dan 0,005 ml Temed. Setelah separating gel membeku ditambahkan stacking

8

gel 4% dengan komposisi sebagai berikut, 3,14 ml H2O, 1,25 ml Tris-base 1,5 M

pH 8,8, 0,5625 ml Acrylamide/ Bis, SDS 10%, APS 10%, dan 0,005 ml Temed.

Sisir (comb) dimasukkan pada puncak glass plate dan ditunggu hingga menjadi

gel. Sisir dikeluarkan sehingga terbentuk sumur-sumur pada gel. Seperangkat

glass plate dipasang, kemudian dimasukkan ke dalam chamber yang berisi

running buffer. Secara berurutan, sumuran diisi dengan 10 µL marker protein

untuk dijadikan patokan skala berat molekul protein, lalu 5 µL enzim

glutathione reduktase, 20 µL sampel biji kontrol, 20 µL sampel biji CrCl3, 20 µL

sampel biji KCr(SO4)2, 20 µL sampel biji kromat, dan 20 µL sampel biji dikromat.

Voltase yang digunakan, yaitu 30 V selama 30 menit, dilanjutkan 75 V selama 1

jam, dan 100 V selama 30 menit. jika elektroforesis sudah selesai, kemudian

diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue G-250 selama 30 menit. Setelah itu

proses destaining selama 30 menit, kemudian gel dipacking. Data hasil

elektroforesis dianalisis dengan membuat kurva kalibrasi untuk estimasi berat

molekul. Nilai Rf diukur dan ditempatkan sebagai sumbu x, sedangkan berat

molekul (biasanya dinyatakan dalam sebagai fungsi dari log berat molekul)

ditempatkan sebagai sumbu y. Grafik yang didapatkan berupa grafik linear

dengan persamaan garis y= a + bx.

Rf=

ANALISIS DATA

Data yang telah diperoleh dianalisis menggunakan program SPSS 11,5 for

Windows. Analisis varian (ANOVA) untuk mengetahui pengaruh perlakuan atau

kombinasi perlakuan terhadap parameter yang diukur, dengan taraf pengujian

5%. Uji posterior yang digunakan adalah Tukey. Uji Kruskal-Wallis dilakukan jika

data tidak memenuhi syarat ANOVA meskipun telah dilakukan transformasi

data. Profil protein biji sorgum yang telah diperoleh dianalisis menggunakan

cluster analysis program MPSV (Multivariate Statistical Package).

HASIL

Berat basah dan Berat kering

Berdasarkan hasil penelitian ini menunjukkan bahwa berat basah dari

ketiga varietas cenderung mengalami penurunan akibat perlakuan Cr(III) dan

Cr(VI). Penurunan berat basah pada varietas Numbu, Kawali, dan Keris M3

secara berurutan adalah 37,66%, 24,99%, dan 22,64%. Hampir seluruh

9

perlakuan Cr(III) dan Cr(VI) tidak memperlihatkan beda nyata terhadap kontrol.

Hanya Numbu perlakuan dikromat, Keris perlakuan K2CrO4 dan K2Cr2O7 yang

berbeda nyata dengan kontrol.

Perlakuan Cr(III) dan Cr(VI) juga menyebabkan penurunan berat kering

pada ketiga varietas sorgum. Penurunan berat kering pada varietas Numbu,

Kawali, dan Keris M3 secara berurutan adalah 35,95%, 32,50%, dan 27,95%.

Hampir seluruh perlakuan Cr(III) dan Cr(VI) tidak memperlihatkan beda nyata

terhadap kontrol. Hanya Numbu perlakuan K2CrO4 dan K2Cr2O7 yang berbeda

nyata dengan kontrol. Penurunan (P0,05) berat basah dan berat kering paling

tinggi terjadi pada varietas Numbu, tepatnya pada varietas Numbu perlakuan

Cr(VI) (Tabel 1).

Tabel 1. Berat basah dan berat kering biji Sorghum bicolor varietas Numbu,

Keris, dan Kawali pada kondisi cekaman Cr

Varietas Perlakuan Berat basah (g) Berat kering (g)

Numbu

Kontrol 15,53 ± 0,85a

9,95 ± 1,65ab

CrCl3 12,7 ± 1,21abcd

8,59 ± 0,90abc

KCr(SO4)2 11,76 ± 1,50abcde

7,73 ± 1,03abcd

K2CrO4 7,33 ± 1,48de

4,52 ± 0,60d

K2Cr2O7 6,93 ± 1,81e

4,65 ± 0,90d

Keris M3

Kontrol 14,83 ± 1,45a

10,49 ± 2,02a

CrCl3 14,66 ± 3,35a

7,42 ± 2,08abcd

KCr(SO4)2 14,60 ± 3,4a

7,34 ± 1,05abcd

K2CrO4 7,86 ± 1,92cde

6,90 ± 0,98bcd

K2Cr2O7 7,37 ± 0,88cde

6,66 ± 0,62bcd

Kawali

Kontrol 13,83 ± 1,55ab

8,45 ± 0,58abc

CrCl3 12,63 ± 1,25abcde

7,13 ± 0,99abcd

KCr(SO4)2 13,10 ± 1,85abc

6,25 ± 1,31cd

K2CrO4 8,26 ± 1,79bcde

5,50 ± 0,50cd

K2Cr2O7 8,80 ± 2,17bcde

5,47 ± 0,34cd

Catatan= Data ditampilkan dalam purata berat basah dan berat kering (±SD)(n=5) a,b,c,d,e menunjukkan beda signifikan (P≤0,05) antar perlakuan Cr pada ketiga varietas untuk tiap parameter.

10

Kandungan Cr(VI) dalam biji S. bicolor

Tabel 2 menunjukkan bahwa kandungan Cr(VI) pada ketiga varietas

perlakuan kontrol berbeda nyata dengan seluruh biji sorgum perlakuan Cr(III)

dan Cr(VI). Biji sorgum varietas Numbu dan Kawali terdeteksi paling banyak

mengandung Cr(VI), sedangkan varietas Keris M3 terdeteksi paling rendah

mengandung Cr(VI). Perlakuan Cr(III) pada ketiga varietas terdeteksi adanya

Cr(VI), namun tidak berbeda nyata antar varietas (Tabel 2).

Tabel 2. Kandungan Cr(VI) (mg-1 berat kering sampel) pada biji sorgum varietas

Numbu, Keris, dan Kawali yang diberikan perlakuan Cr(III) dan Cr(VI).

Varietas Perlakuan Kandungan Cr(VI)

(mg-1 berat kering sampel)

Numbu

Kontrol Td

CrCl3 0,032 ± 0,012b

KCr(SO4)2 0,036 ± 0,012b

K2CrO4 0,069 ± 0,004a

K2Cr2O7 0,071 ± 0,005a

Keris M3

Kontrol Td

CrCl3 0,021 ± 0,006b

KCr(SO4)2 0,024 ± 0,009b

K2CrO4 0,029 ± 0,007b

K2Cr2O7 0,030 ± 0,008b

Kawali

Kontrol Td

CrCl3 0,030 ± 0,007b

KCr(SO4)2 0,030 ± 0,011b

K2CrO4 0,060 ± 0,007a

K2Cr2O7 0,060 ± 0,004a

Catatan= Data ditampilkan dalam purata kandungan Cr(±SD), Td (Tidak terdeteksi) a,b menunjukkan beda signifikan (P≤0,05) antar perlakuan Cr pada ketiga varietas

Aktivitas glutathion reduktase

Tabel 3 menunjukkan aktivitas glutation reduktase pada S. bicolor yang

dipengaruhi oleh adanya cekaman Cr. Aktivitas enzim glutatione reduktase

11

pada perlakuan Cr(III) dan Cr(VI) lebih tinggi dibandingkan kontrol. Aktivitas

enzim glutation reduktase paling tinggi terjadi pada perlakuan Cr(VI) varietas

Keris M3.

Tabel 3. Aktivitas Glutation reduktase biji sorgum varietas Numbu, Keris M3, dan Kawali pada kondisi cekaman Cr

Varietas Perlakuan

Aktivitas Glutation reduktase

(mol TNB/mg protein)

Numbu

Kontrol 8,60 ± 1,12g

CrCl3 19,34 ± 3,13def

KCr(SO4)2 20,31 ± 3,84def

K2CrO4 39,98 ± 3,93b

K2Cr2O7 36,08 ± 3,09bc

Keris M3

Kontrol 11,13 ± 1,71 efg

CrCl3 26,87 ± 4,78cd

KCr(SO4)2 22,25 ± 3,17d

K2CrO4 53,50 ± 3,53a

K2Cr2O7 52,61 ± 6,59a

Kawali

Kontrol 9,80 ± 0,97fg

CrCl3 23,05 ± 2,57cd

KCr(SO4)2 20,99 ± 3,23de

K2CrO4 46,47 ± 3,10ab

K2Cr2O7 43,58 ± 2,35ab

Catatan= Data ditampilkan dalam purata aktivitas enzim Glutation reduktase (±SD) a,b,c,d,e,f,g menunjukkan beda signifikan (P≤0,05) antar perlakuan Cr pada ketiga varietas.

Profil protein Gambar 3 menunjukkan jumlah pita protein biji S. bicolor berdasarkan

berat molekulnya. Jumlah pita protein pada varietas Numbu mengalami

penurunan ketika diberi perlakuan Cr(III) dan Cr(VI). Pita protein dengan berat

molekul 10 kDa, 13 kDa, 47 kDa, 81 kDa, 91 kDa, dan 103 kDa yang terdapat

pada kontrol, tidak ditemukan pada perlakuan Cr. Perlakuan Cr memiliki pita

protein baru, meskipun terdapat beberapa pita protein yang hilang. Varietas

Kawali cenderung mengalami peningkatan jumlah pita protein ketika diberi

perlakuan Cr(III) dan Cr(VI). Perlakuan Cr(VI) banyak ditemukan pita protein

12

baru sehingga memiliki jumlah pita protein paling banyak. Jumlah pita protein

varietas Keris M3 meningkat pada perlakuan Cr(III), namun cenderung

menurun pada perlakuan Cr(VI).

Gambar 3. Jumlah pita protein biji S. bicolor varietas Numbu, Keris M3, dan Kawali pada kondisi cekaman Cr(III) dan Cr(VI)

Gambar 4 menunjukkan bahwa baik pada kontrol maupun perlakuan Cr

pada ketiga varietas terlihat memiliki pita protein yang berat molekulnya sama

dengan enzim glutathion reduktase. Enzim glutathion reduktase pada varietas

Numbu, Keris M3, dan Kawali secara berurutan memiliki berat molekul 57 kDa,

58 kDa, dan 60 kDa. Berdasarkan ketebalan pitanya, perlakuan Cr, baik Cr(III)

maupun Cr(VI) meningkatkan ketebalan pita protein enzim glutathion

reduktase. Pada varietas Numbu dan Kawali yang diberi perlakuan Cr(III), pita

protein glutathion reduktase lebih tebal dibandingkan Cr(VI), sedangkan pada

Keris M3, pita protein glutathion reduktase paling tebal terlihat pada perlakuan

K2Cr2O7. Semakin tebal pita protein menunjukkan bahwa intensitasnya tinggi

dan jumlah protein yang terkandung dalam pita protein tersebut juga tinggi.

13

Gambar 4. Profil protein biji sorghum (A. Numbu, B. Keris M3, dan C. Kawali)

14

Gambar 5. Dendogram Profil Protein Biji Varietas Numbu, Keris M3, dan Kawali perlakuan kontrol

Gambar 6. Dendogram Profil Protein Biji Varietas Numbu, Keris M3, dan Kawali dengan Perlakuan Cr(III)

Gambar 7. Dendogram Profil Protein Biji Varietas Numbu, Keris M3, dan Kawali dengan Perlakuan Cr(VI)

Ketiga dendogram profil protein menunjukkan persamaan karakterisasi

pita protein berdasarkan berat molekulnya. Perlakuan Cr mempengaruhi

ekspresi protein yang ditunjukkan dengan adanya perbedaan karakterisasi

antar varietas dan perlakuan. Perlakuan kontrol menunjukkan bahwa varietas

Keris M3 dan Numbu memiliki persamaan karakterisasi pita protein dengan

indeks similaritas 6,16, akan tetapi pada perlakuan Cr(III) dan Cr(VI), varietas

Numbu cenderung memiliki persamaan karakter pita protein dengan Kawali.

Indeks similaritas antara Numbu dan Kawali pada perlakuan Cr(III) dan Cr(VI)

sebesar 6,40.

15

Total protein

Pemberian Cr(III) dan Cr(VI) pada S. bicolor mengakibatkan terjadinya

peningkatan total protein pada perlakuan Cr(III) dan Cr(VI) dibandingkan

kontrol. Perlakuan Cr(VI) mengalami peningkatan total protein yang lebih besar

dibandingkan Cr(III). Peningkatan total protein paling tinggi terjadi pada

varietas Keris M3, sedangkan varietas Numbu mengalami peningkatan yang

terendah. Perlakuan Cr(III) dan Cr(VI) pada varietas Keris M3 memperlihatkan

beda nyata dengan kontrol, sedangkan pada perlakuan Cr(III) Numbu tidak

berbeda nyata dengan Kawali kontrol. Begitu pula dengan perlakuan Cr(III)

Kawali yang tidak berbeda nyata dengan Keris M3 perlakuan kontrol (Gambar

1).

Gambar 8. Total protein terlarut pada biji sorgum varietas Numbu, Keris M3, dan Kawali yang diberikan perlakuan Cr(III) dan Cr(VI). Data ditampilkan dalam purata total protein ±SD. Notasi a,b,c,d,e,f,g

menunjukkan beda signifikan (P≤0,05) antar perlakuan Cr pada ketiga varietas.

PEMBAHASAN

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa Cr menyebabkan penurunan

berat basah dan berat kering biji sorgum pada ketiga varietas. Penurunan berat

akibat perlakuan Cr(VI) lebih besar dibandingkan perlakuan Cr(III). Hampir

seluruh perlakuan Cr(III) dan Cr(VI) tidak memperlihatkan beda nyata terhadap

kontrol. Hal ini diduga karena tingginya aktivitas enzim glutathion reduktase

dapat menghambat toksisitas Cr terhadap gangguan pertumbuhan biji

sorghum.

16

Persentase penurunan berat basah dan berat kering yang berbeda-beda

pada ketiga varietas tersebut terjadi akibat perlakuan Cr(III) dan Cr(VI)

disebabkan oleh perbedaan toksisitas Cr(III) dan Cr(VI) (Chandra et al. 2004).

Penurunan berat basah dan berat kering yang signifikan pada biji yang diberi

perlakuan Cr(VI) mengindikasikan bahwa Cr(VI) lebih toksik dibandingkan Cr(III)

(Mongkhonsin et al. 2011).

Cr yang terakumulasi di biji sorgum varietas Numbu dan Kawali lebih besar

dibandingkan dengan Keris M3. Meskipun akumulasi Cr(VI) pada varietas

Kawali tinggi, akan tetapi penurunan berat kering pada varietas ini rendah. Hal

ini terjadi diduga karena adanya aktivitas enzim glutathion reduktase yang

tinggi sehingga dapat menghambat Cr dalam menurunkan berat basah dan

berat keringnya. Berbeda dengan varietas Numbu yang memiliki akumulasi

Cr(VI) yang tinggi namun aktivitas enzim glutation reduktasenya rendah, maka

terjadi penurunan biomassa yang tinggi. Terdeteksinya Cr(VI) pada ketiga

varietas sorghum perlakuan Cr(III) diduga karena perlakuan Cr(III) telah

mengalami oksidasi menjadi Cr(VI) (Hashim et al. 2011).

Profil protein pada kontrol menunjukkan adanya enzim glutation

reduktase. Hal ini mengindikasikan bahwa enzim glutation reduktase

merupakan enzim konstitutif (Girindra, 1986) yang selalu dihasilkan oleh

sorgum meskipun tidak ada induksi cekaman. Perlakuan Cr mempengaruhi

profil protein yang ditunjukkan dengan adanya perbedaan karakterisasi antar

varietas dan perlakuan. Hal ini ditunjukkan pada perlakuan kontrol yang

menunjukkan bahwa Keris M3dan Numbu memiliki persamaan karakterisasi

pita protein, akan tetapi pada perlakuan Cr(III) dan Cr(VI), Numbu cenderung

memiliki persamaan karakter pita protein dengan Kawali. Persamaan karakter

pita protein antara Numbu dan Kawali mengindikasikan bahwa sorgum yang

diberi perlakuan Cr diduga akan menghasilkan jenis protein yang sama dan

digunakan dalam menghambat toksisitas Cr (Sandy et al. 2011).

Peningkatan total protein pada perlakuan Cr(III) dan Cr (VI)

mengindikasikan bahwa protein-protein seperti enzim glutation reduktase

dihasilkan dalam jumlah yang besar dibandingkan kontrol. Peningkatan total

protein paling tinggi terjadi pada varietas Keris M3, sedangkan varietas Numbu

cenderung mengalami peningkatan paling rendah.

Peningkatan aktivitas glutation reduktase pada perlakuan Cr(III) dan Cr(VI)

menunjukkan adanya respons sorgum terhadap stres oksidatif yang

disebabkan oleh toksisitas Cr (Winarsi, 2007). Tingginya aktivitas glutation

17

reduktase pada perlakuan Cr(VI) dibandingkan Cr(III) dan kontrol, diduga

karena toksisitas Cr(VI) pada ketiga varietas tersebut tinggi. Peningkatan

aktivitas glutathion reduktase dapat melindungi komponen kloroplas terhadap

oksidasi H2O2. Enzim glutathion reduktase dapat mengubah H2O2 melalui siklus

askorbat-glutation menjadi H2O (Jiang et al. 2010). Sorghum merespon adanya

logam berat di lingkungan dengan berbagai cara, salah satunya dengan

mensintesis protein fitokelatin dan mengaktifkan enzim glutation reduktase.

Enzim glutation reduktase merupakan protein spesifik yang disintesis tanaman

untuk mereduksi Cr(VI) menjadi Cr(III), sehingga logam Cr menjadi tidak

berbahaya (Malmir, 2011).

KESIMPULAN

Kromium mempengaruhi pola pita protein biji sorghum varietas Numbu,

Keris M3, dan Kawali. Kromium baik dalam bentuk Cr(III) maupun Cr(VI)

meningkatkan jumlah pita protein pada biji sorghum varietas Keris M3 dan

Kawali, tetapi menurunkan jumlah pita protein pada varietas Numbu. Enzim

glutathion reduktase pada biji sorgum varietas Numbu, Keris M3, dan Kawali

terdeteksi pada profil protein dengan berat molekul berturut-turut 57 kDa, 58

kDa, dan 60 kDa. Intensitas pita enzim glutation reduktase meningkat oleh

perlakuan kromium. Aktivitas enzim glutathion reduktase dan total protein

terlarut pada ketiga varietas biji sorghum meningkat secara signifikan sebagai

akibat dari perlakuan kromium. Tingginya total protein terlarut dan aktivitas

enzim glutathion reduktase dan rendahnya kandungan Cr(VI) pada Keris M3

mengindikasikan penghambatan toksisitas Cr terhadap biji S. bicolor.

DAFTAR PUSTAKA

Agustina K, Sopandie D, Trikoesoemaningtyas, dan Wirnas D. 2010. Uji daya adaptasi sorgum pada lahan kering masam terhadap toksisitas alumunium dan defisien fosfor Sorghum bicolor (L.) Moench). Prosiding Pekan Serealia Nasional.

Anonim. 1992. Alpha method 3500-CR: standard methods for the examination of water and wastewater. 18th ed. American public health asociation.

Barcelos CA, Maeda RN, Betancur GJ, dan Pereira J. 2011. Ethanol production from sorghum grains (Sorghum bicolor L. Moench): Evaluation of the enzimatic hydrolysis and the hydrolysate fermentability. Brazilian Journal of Chemical Engineering 28(04):597-604.

Bartlett RJ. 1991. Chromium cycling in soil and water: links, gaps, and methods. Environmental Health Perspectives 92:17-24.

18

Bielicka A, Bojanowska I, Wisniewski A. 2005. Two faces of chromium- pollutant and bioelement. Polish Journal of Environmental Studies 14:5-10.

Bollag DM, dan Edelstein SJ. 1991. Protein Methods. Departement of Biochemistry. Switzerland: University of Geneva, Geneva.

Bondareva L, Teisserenc R, Pakharkova N, Shubin A, Dantec TL, Renon L, dan Svoboda I. 2014. Assessment of the Bioavailability of Cu, Pb, and Zn through Petunia axillaris in Contaminated Soils. International Journal of Ecology. 14(1):176-189.

Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of dye binding. Analytical Bichemistry 72:248-254

Brock TD, Mandigan MT, Martinko JM, Parker J. 1992. Biology of Microorganisms. Prentice Hall. New Jersey: Englewood Cliffs.

Chandra P dan Kamla K. 2004. Chromium accumulation and toxicity in aquatic vascular plants. Journal Botanical Review 70:313-327

Debritto DB, Kumar PBJ, Gracelin DH, dan Jency SS. 2011. Drought stress and its impact on protein in three species of Vitex. Journal of Stress Physiology & Biochemistry. 7(3):152-158

Dial HL. 2012. Plant guide for sorghum (Sorghum bicolor L.). USDA-Natural Resources Conservation Service. Tucson: Tucson Plant Materials Center.

Edwards EA, Enard C, Creissen GP, dan Mullineaux P. 1994. Synthesis and properties of glutathione reductase in stressed pea. Planta 192: 137−143.

Gheju M, Balcu I, Ciopec M. 2009. Analysis of hexavalent chromium uptake by plants in polluted soils. Journal of Analytical Chemistry 20: 127-131.

Girindra, A. 1986. Biokimia 1. Jakarta: Gramedia. Hartel RF. 1986. Sources of exposure and biological effects of chromium. IARC

Monographs 71, pp 63-77. Hashim MA, Mukhopadhyay S, Sahu JH, Sengupta B. 2011. Remediation

technologies for heavy metal contaminated groundwater. Journal of Environmental Management 92:2355-2388.

Hirata K, Naoki T, Kazuhisa M. 2005. Biosynthetic Regulation of Phytochelatins, Heavy Metal-Binding Peptides. Journal of Bioscience and bioengineering 100:293-311.

Inouhe, M. 2005. Phytochelatins. Brazilian Journal Plant Physiology 17:65-78. Jemal L, Didierjean R, Ghrir MH, Ghorbal GB. 1998. Characterization of

cadmium binding peptides from pepper (Capsium annuum). Plant Science 137:143-154

Jiang HW, Liu MJ, Chen IC, Huang CH, Chao LY, Hsieh HL. 2010. A glutathione S-

transferase regulated by light and hormones participates in the

19

modulation of Arabidopsis seedling development. Plant Physiology 154:

1646–1658

Jimenez A, Hernandez JA, del Rio LA, and Sevilla F. 1997. Evidence for the presence of the ascorbate-glutathione cycle in mitochondria and peroxisomes of pea leaves. Plant Physiology 114:275−284.

Kohen R, Nyska A. 2002. Oxidation of biological systems: oxidative stress phenomena, antioxidants, redox reactions,and methods for their quantification. The Society of Toxicologic Pathology 30:620-650.

Laemmli UK. 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685

Liu J, Chang QD, Xue HZ, Yi NZ, Cheng H. 2009. Subcellular distribution of chromium in accumulating plant Leersia hexandra Swartz. Journal Plant Soil 322:187-195

Malmir HA. 2011. Comparison of antioxidant enzyme activities in leaves, stems and roots of Sorghum (Sorghum bicolor L.) exposed to chromium (VI). African Joural of Plant Science 5(8): 436-444

Manara A. 2012. Plant responses to heavy metal toxicity. Dalam Furini A (ed), Plants and Heavy Metals. Verona: SpringerBriefs p 27-53.

Mangabeira P, Mushrifah I, Escaig F. Almeida, AF, Laffray D, Severo MI, Oliveira AH. dan Galle P. 2005. Accumulation and distribution of chromium in tomato plants: Studies using SIMS and electro probe X-ray microanalysis. Department of Biology, Universidade Estadual de Santa Cruz: Brazil.

Mongkhonsin B, Nakbanpote W, Nakai I, Hokura A, Jearanaikoon N. 2011. Distributrion and speciation of chromium accumulated in Gynura pseudochina (L.). Journal Environmental and Experimental Botany 74:56-64.

Nayer M. dan Reza H. 2007. Effects of drought stress on soluble proteins in two Maize varieties. Turki Journal Biology 32:23-30

Oliveira M. 2012. Chromium as an Environmental Pollutant: Insights on Induced Plant Toxicity. Journal of Botany 2012:193-201.

Panda SK dan Choudhury. 2005. Chromium stress in plants. Brazilian Journal Plant Physiology 17(1):95-102.

Panda SK dan Patra HK. 1997. Physiology of Chromium Toxicity in Plants- A Review. Plant Physiology Biochemistry 24:10-17.

Revathi K, Haribabu TE, Sudha PN. 2011. Phytoremediation of Chromium contaminated soil using sorghum plant: International Journal of Environmental Sciences 2(2):417-428.

Rodriguez E. Lozano, L.E. Hernandez, P. Bonay dan R.O. Carpena-Ruiz. 1996. Distribution of cadmium in shoot and root tissues of Maize and Pea plants: Physiological Disturbances. Oxford University Press: USA.

20

Sandy NJ, Nurhidayati T, Purwani KI. 2011. Profil protein tanaman kiambang (Salvinia molesta) yang dikulturkan pada media modifikasi air lumpur Sidoarjo. Fakultas Matematika Ilmu Pengetahuan Alam ITB.

Shanker AK, Cervantesb C, Loza-Taverac H, Avudainayagam S. 2005. Chromium toxicity in plants. Environmental International 31:739-753.

Sunkar R. 2010. Plant Stress Tolerance. USA: Humana Press 639: 273-291. Testa B, Mesolella M, Testa D. 1995. Glutathione in the upper respiratory

tract. Annals of Otology Rhinology Laryngology 104:117-119. Thatoi H, Das S, Mishra J, Rath BP. 2014. Bacterial chromate reductase, a

potensial enzyme for bioremediation of hexavalent chromium. Journal Environmental Management 146:383–399.

Vajpayee P, Tripathi RD, Rai UN, Ali MB, dan Sigh SN. 2000. Chromium (VI) accumulation reduces chlorophyll biosynthetis, nitrate reductase activity and protein content in Nymphaea alba L. Chemosphere 41:1075-1082.

Violante VC, L. Perelomov, AG. Caporale, dan M. Pigna. 2010. Mobility and bioavailability of heavy metals and metalloids in soil environments. Journal of Soil Science and Plant Nutrition 10(03)268–292.

Winarsi, H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Kanisiusmedia: Jakarta Yadav SK. 2010. Heavy metals toxicity in plants: an overview on the role of

glutathione and phytochelatins in heavy metal stress tolerance of plants. Journal of Botany 76:167-179.

Yousuf PY, Hakeem KU, Chandna R, dan Ahmad P. 2012. Role of glutathione reductase in plant abiotic stress. Journal of Molecular Ecology 2012:149-158.

Yu XZ, Gu JD, Xing LQ. 2008. Differences in uptake and translocation of hexavalent and trivalent chromium by two species of willows. Journal Toxicology 17:747-755.

Zayed AM, Lytle CM, Qian JH, dan Terry N. 1998. Chromium accumulation, translocation and chemical speciation in vegetable crops. Planta 206:293-299.

Zhang X, Liu J, Wang D, Zhu Y, Hu C, Sun J. 2009. Bioaccumulation and chemical form of chromium in Leersia hexandra Swartz. Bulletin of Environmental Contamination Toxicology 82:358-362.

Zhou J, Keli Y, Zhonggui Z, Wusheng J, Donghua L. 2009. Antioxidant response

system and chlorophyll fluorescence in chromium (VI) treated Zea mays

(L.) seedling. Journal Series Botany 51:23-33.