DASAR TEORI

ISOLASI DNA

Sebelum membahas mengenai isolasi DNA, ada baiknya kita sekilas membahas DNA

itu sendiri. Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting

dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik

makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA dalam suatu sel

akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-

fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen dan intergen (Campbell dkk.

2004: 221). DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme

prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai

DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot

terletak dalam sitoplasma. Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan

Francis Crick. Mereka memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat

oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa

struktur DNA merupakan rantai ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari dua rantai

polinukelotida yang terpilin. Kedua rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai

berorientasi dari ujung 5’ ke 3’ sedangkan yang lain berorientasi ujung 3’ ke 5’. Ujung 5’

merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-fosfat dan ujung 3’ berakhir dengan gugus

OH. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan hidrogen yang memghubungkankedua basa

nitrogen. Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula

pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang kehilangan satu atomoksigen.

Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi

menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dan

sitosin. DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut

dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup. Fungsi-

fungsi tersebut adalah:

Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup,

Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan

molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi

DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri.

DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan

padamitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan sifat

berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan bebas dari protein

histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis. DNA juga dijumpai pada organisme

prokariotik. DNA prokariot mempunyai DNA ekstranuklear yang dinamakan plasmid.

Plasmid merupakan DNA yang tidak terlalu esensial bagi fungsikehidupan bakteri, tetapi

penting dalam pengaturan siklus hidup dan perumbuhan dalamlokasi hidupnya. Kebanyakan

plasmid adalah sirkular dan tersusun dari beberapa ribu pasangan basa. Plasmid mempunyai

titik ori (origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diritanpa pengaturan dari DNA

kromosom. Replikasi dimulai dari titik ori hingga semua plasmid tereplikasi.Isolasi DNA

merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu

sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran

berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yangmempunyai berat molekul besar akan

berada di bagian bawah tabung dan molekul ringanakan berada pada bagian atas tabung.Hasil

sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian

atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115). Presipitasi merupakan langkah

yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponendari campuran.Terdapat sejumlah

tujuan dari isolasi DNA, antara lain:

Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.

Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik

Hibridisasi Southern

Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.

Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA,

Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan

DNA secara in vitro melalui teknik PCR.

Setiap maksud penggunaan DNA yang beragam membutuhkan persyarakan

kualitasDNA yang berbeda. Kualitas DNA tersebut ditentukan oleh hal-hal berikut:

Kemurnian

Panjang DNA

Kemampuan untuk dipotong oleh sembarang enzim

Tidak mengalami modifikasi kimiawi selama proses isolasi berlangsung. Oleh sebab

itu, terdapat sejumlah teknik isolasi DNA, yang disesuaikan untuk berbagai maksud

penggunaan dan kualitas minimum yang ingin dicapai.

Isolasi DNA pada Tanaman

Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis tanaman, organ

tanaman, maupun jaringannya dapat dilakukan dengan berbagai cara. Namun pada intinya

terdapat tiga faktor utama yang sangat penting untuk dalam melakukan purifikasi danekstraksi

DNA secara maksimal. Pertama adalah cara dalam menghomogenkan jaringan tanaman

khususnya adalah dinding selnya. Kedua adalah komposisi dari larutan buffer yang

ditambahkan dalam penggerusan jaringan tanaman dan yang ketiga adalah penghilangan

enzim penghambat-polisakarida. Sebagai contoh dari isolasi DNA tanaman adalah isolasi

DNA tanaman pisang. Tahapan yang dilakukan untuk mendapatkan DNA tanaman pisang

adalah penggerusan atau homogenasi daun pisang dengan penambahan nitrogen cair.

Fungsinya adalah untuk mempermudah penggerusan dan menjaga agar DNA tidak mengalami

kerusakan. Hal ini dilakukan sampai didapatkan daun tanaman pisang yang telah hancur.

Selanjutnya dilakukan penambahan buffer ekstrak yang berfungsi untuk melisiskan membran

sel dan membran fosfolipid bilayer, atau dalam praktikum kali ini hanya menggunakan

nitrogen cair karena memiliki fungsi yang sama dengan bufer ekstrak. Kemudian dilakukan

inkubasi sampel dalam water bath bersuhu 60 C selama 60 menit. Hal ini dilakukan untuk⁰

optimalisasi kerja buffer ekstrak. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi sampel dengan kecepatan

10000 rpm selama 10 menit dalam suhu 4 C. Hal ini dilakukan untuk memisahkan debris dan⁰

komponen sel lain yang menjadi pengotor dengan DNA. Hasilnya didapatkan bahwa

supernatan berwarna hijau sedangkan pelet berwarna putih kehijauan. Supernatan yang telah

diperoleh selanjutnya diambil dan ditambahkan dengan larutan Phenol : Chloroform :

Isolamyl Alkohol (PCI). Hal ini dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan.

Polimerase Chain Reaction (PCR), tujuannya adalah membuat tiruan DNA berlipat

ganda secara in vitro. Pada saat PCR terjadi peristiwa denaturasi, annealing, dan

extention. Pada saat denaturasi, rantai ganda DNA dibuka dengan memberi suhu yang

tinggi. Nilai temperaturnya berbanding lurus dengan jumlah ikatan G dan C (Guanin-

Cytosin). Tahap kedua adalah annealing, yaitu menempelkan primer pada DNA untuk

amplifikasi. Pada tahap ini dibutuhkan suhu yang lebih rendah agar primer bisa menempel

pada rantai DNA. Pada tahap extention, suhu yang diperlukan adalah 72oC. Setelah itu,

sampel dimasukkan pada mesin PCR dan dilakukan amplifikasi dengan kondisi sebagai

berikut.

Pre Heat 95º C : 5’

Denaturasi 95º C : 1’

Annealing 35º C : 1’

Extention 72º C : 2’

Extra Extention 72º C : 10’

Agarose gel elektroforesis adalah metode yang digunakan untuk memisahkan

DNA berdasarkan besar molekul. Pemisahan molekul terjadi melalui pergerakan asam

nukleat yang negatively charged yang menembus matriks agarose dalam tank

elektroforesis. Molekul dengan berat molekul lebih rendah akan bergerak lebih cepat.

Setelah pembuatan gel elektroforesis, DNA dapat segera dirunning tetapi sebelumnya

perlu diberi loading buffer (Bromophenol blue) untuk memberikan berat sampel dan

sebagai penanda sampai kapan elektroforesis bisa dihentikan.

Fenol merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid dan molekul

lain sepergi polisakarida sehingga diharapkan akan didapatkan supernatan yang berisi DNA

bebas kontaminan. Setelah pencampuran, homogenat tersebut divorteks untuk optimalisasi

homogenasi. Selanjutnya dilakukan sentrofugasi homogenat dengan PCI tersebut dengan

kecepatan 10000 rpm selama 10 menit dalam suhu 4 C. Hasil yang didapatkan adalah⁰

supernatan dan pelet yang berada pada tiga lapisan lapisan atas berwarna hijau jernih, lapisan

tengah berwarna hijau keruh dan pelet yang berwarna hijau tua. Kemudian diambil supernatan

pada lapisan paling atas dan ditambahkan larutan Chloroform : Isoamyl Alkohol untuk

presipitasi lanjutan. Kemudian kembali dilakukan vorteks dan sentrifugasi. Untuk

memperoleh DNA dari daun tanaman pisang, diperlukan bahan seperti nitrogen cair atau

buffer ekstrak (2%CTAB, 100 mM Tris-HCl (pH:8), 20 mM EDTA, 14M NaCl) steril,

Fenol : Chloroform : Isoamyl Alkohol (PCI) = 25: 24: 1; Chloroform : Isoamilalkohol (PCI) =

24 : 1, 7.5 M Ammonium acetate, Etanol Absolut, Etanol 70 %,TE Buffer pH 8. EDTA

merupakan agen pengkelat yang dapat mengikat ion-ion logam atau ion-ion bermuatan di-

positif seperti Ca2+ dan Mg2+ sehingga komponen-komponen di membran terluar sel akan

terurai dengan terikatnya molekul yang biasanya mengikat. Pada prosedur ekstraksi yang

telah dilakukan ini digunakan fenol-kloroform yang berfungsi sebagai pendenaturasi protein.

Sedangkan DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena molekul ini tidak larut didalam pelarut

organik seperti fenol-kloroform. Selanjutnya dilakukan presipitasi DNA dengan

menggunakan etanol. Hal ini berfungsi sebagai penghilang fenol-kloroform. Sebab apabila

fenol-kloroform masih berada didalam sampel maka dikhawatirkan akan menghambat kerja

enzim-enzim restriksi atau enzim lain yang digunakan untuk analisis molekuler. Hasil yang

didapatkan dari presipitasi CI akan terbentuk kembali supernatan dan pelet pada eppendorf,

kemudian dilakukan pengambilan supernatan. Supernatan ditambahkan dengan amonium

nitrat dan etanol absolut untuk presipitasi lanjutan dan menghilangkan kontaminan. Hasilnya

diketahui terbentuk filamen-filamen DNA dalam larutan jernih tersebut. Kemudian dilakukan

inkubasi selama satu malam untuk optimalisasi presipitasi. CTAB memiliki fungsi yang sama

seperti SDS, yaitu berfungsi sebagai pelarut lipid dari membran sel. SDS adalah sejenis

deterjen yang mampu mengemulsi lipid. Setelah inkubasi selama semalam dengan etanol

absolut dan amonium nitrat dan diketahui filamen DNA selanjutnya dilakukan sentrifugasi

kembali untuk mendapatkan pelet DNA. Setelah supernatan dibuang, selanjutnya

ditambahkan etanol 70% untuk presipitasi lanjutan. Kemudian dilakukan sentrifugasi sampai

didapatkan pelet DNA. Pelet DNA yang didapatkan kemudian dikering anginkan. Gambar di

bawah merupakan cara isolasi DNA pada bibit gandum.

Isolasi DNA pada Darah

Isolasi DNA tak hanya bisa dilakukan untuk tanaman atau buah-buahan saja, tapi juga

bisa dari darah, berikut cara kerjanya :

Tahap-tahap utama dalam isolasi DNA darah adalah:

♥ Menghancurkan membran sel.

♥ Disosiasi protein sel.

♥ Pemisahan DNA dari komponen terlarut lainnya.Darah merupakan jaringan ikat

khusus yang mempunyai elemen-elemen berupa seldarah, trombosit, dan substansi

interseluler cair, yaitu plasma darah.

ELEKTROFORESIS

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan

pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat

digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA

yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu

medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya

maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak

molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula

pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait

dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan :

Ḟe = qĒ

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan

listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi,

danmemurnikan fragmen DNA.

Jenis Elektroforesis

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagaifase

diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion

kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem

pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut,

luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH,

viskositas, dan adsorpsi vitas zat terlarut.

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.

Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA,RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan

listrik . Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya

oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada

ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis,

namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum

digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing

DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Gel

yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya

dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat

berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan

gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang

memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan

ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar

dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang

sudah dimurnikan. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur

(well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya.

Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub

listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju

elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang

dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya

berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida

digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein

didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein

tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif. Setelah proses elektroforesis selesai,

dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat.

Etidium bromida, perak , atau pewarnan "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan

untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah

"diwarnai" dengan etidium bromida), gel difotodi bawah sinar ultraviolet. Jika molekul

sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat. Pita-pita (band) pada

lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur

merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita- pita yang berjarak sama dari sumur

gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel

selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-

molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran

molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul

dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel

dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel

untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap

logaritma ukuran molekul.

Perangkat elektroforensis gel

Hasil elektroforesis gel terhadap hasil PCR

menggunakan primer mikrosatelit. Berkas

(band) mendatar merupakan sekumpulan

DNA yang setiap kolomnya bergerak dengan

kecepatan berbeda. Semakin pendek DNA

semakin cepat bergerak.

DAFTAR PUSTAKA

http://biologi.blogsome.com/2009/11/02/isolasi-dna/

http://www.macnature.com/2010/02/isolasi-dna-referensiterpercaya.html

http://www.biotech.wisc.edu/Outreach/posterhandoutcollection/dnaextractionhandout.jpg

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.gif   http://

isolasidna.blogspot.com/

http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis_gel

http://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekular  

http://www.enotes.com/forensic-science/dna-isolation-methods

http://www.ehow.com/how-does_5246239_dna-electrophoresis-method.html

http://www.methodbook.net/dna/agarogel.html

http://id.shvoong.com/medicine-and-health/medicine-history/2086857-isolasi-dna-pcr-dan-

agarose/#ixzz2DEoeH999