Dasar Pemx Lab Imun

DASAR-DASAR PEMERIKSAAN LABORATORIUM IMUNOLOGI

PENDAHULUAN

SISTEM IMUN TUBUH DIBEDAKAN : BAWAAN, YANG MENIMBULKAN RESPON

IMUNOLOGIK NON SPESIFIK DIPEROLEH, YANG MENIMBULKAN

RESPON IMUNOLOGIK SPESIFIK

KOMPONEN YANG BERPERAN DIGOLONGKAN DALAM:

• KOMPONEN SEL ( RESPON SELULER) • MOLEKUL / LARUT ( RESPON HUMORAL )

MACAM PEMERIKSAAN

1. UJI RESPON IMUNOLOGIK NON SPESIFIK

2. UJI RESPON IMUNOLOGIK SPESIFIK

3. DETEKSI ANTIGEN

1. UJI RESPON IMUNOLOGIK NON SPESIFIK

1.RESPON IMUN NON SPESIFIK SELULERYang berperan: sel-sel efektor/pembunuh (digolongkan

fagosit): makrofag/monosit, PMN (segmen netrofil, eosinofil)

Fagosit (in vivo) interaksi dg komponen RI non spesifik maupun RI spesifik

Proses fagositosis 3 tahap: Pengenalan & peningkatan thd substansi asing Penelanan (ingestion) Pencernaan (digestion)

RINCI:

Kemotaksis, opsonisasi, endositosis, meliputi pinositosis/ up take

terhadap non partikel misal cairan & fagositosis terhadap partikel

pembunuhan intrasel, pencernaan

Gangguan proses fagositosis dpt terjadi pd salah satu atau beberapa tahap

1.1. Macam Fagosit

Fagosit Mononuklear:

Monosit/ makrofag

Fagosit polimorfonuklear:

segmen netrofil, kadang eosinofil

Monosit/Makrofag

Monosit (sirkulasi) & makrofag (jaringan) inaktif. Rangsangan aktif Rangsangan perubahan morfologik & fungsi Fagosit PMN, :

Memiliki enzim katalase, kurang memiliki protein kation & laktoferin

Peka terhadap lebih banyak macam faktor kemotaktik Lebih mampu menelan antigen/sel sasaran yang

dilapisi antibodi Berumur panjang

PMN Neutrofil

Granulosit terbanyak dalam sirkulasi Pertama kali datang berkumpul di daerah infeksi (30-60’)

krn rangsangan faktor kemotaktik Memegang peran penting pada reaksi inflamasi sel

inflamator Populasi terbanyak dalam RI non spesifik untuk

meniadakan mikroba Memasuki jaringan hanya bila diperlukan fagosit mononuklear:

Memiliki enzim mieloperoksidase, protein kation & laktoferin Peka thd faktor kemotaktik Lebih suka menangkap partikel (lateks, fungi) Berumur pendek (2-3 hari)

PMN Eosinofil

Berfungsi sebagai fagosit, kurang efisien dibanding

neutrofil

Jumlah hanya sedikit, meningkat pada alergi, invasi

parasit

Isi granula dapat dilepaskan oleh ‘signal’ tertentu &

molekul-molekul dapat membunuh secara ekstrasel

parasit yang ukurannya terlalu besar untuk difagositosis

MACAM PEMERIKSAAN R.I NON SPESIFIK(SELULER)

Uji kelainan kuantitatif: hitung jumlah leukosit & hitung jenis leukosit darah tepi (konvensional/automatisasi)contoh: Leukositosis pd infeksi kokus/piogenik dg

peningkatan neutrofil PMN & pergeseran ke kiri Monositosis pada std penyembuhan infeksi akut,

infeksi tuberkulosa, demam tifoid Leukopeni pd infeksi virus, tifoid, akibat obat tertentu Keadaan leukopeni kronis menyebabkan terjadinya

infeksi berulang Eosinofilia pada alergi, invasi parasit tertentu

MACAM PEMERIKSAAN R.I NON SPESIFIK(SELULER)……..con’t

Uji kelainan kualitatif:

Manifestasi klinik yang tampak pada gangguan fungsi fagositosis ialah infeksi berat tanpa disertai demam.

Macam pemeriksaan: Uji hambatan migrasi leukosit Memisahkan leukosit dari eritrosit (darah heparin). Leukosit

dihisap ke dalam tabung kapiler, diinkubasikan dlm media biakan.

N: Leukosit akan bermigrasi ke luar tabung & membentuk kipas di ujung tabung

MACAM PEMERIKSAAN R.I NON SPESIFIK(SELULER)……..con’t

Uji penyaringan gangguan fagositosis (uji Nitroblue tetrazolium = NBT)

Dinilai penurunan reduksi NBT.

Individu N: bervariasi (< 25%)

Uji kemampuan leukosit untuk bereaksi dengan faktor kemotaksis

Uji fungsi membunuh mikroba dll

mikroba diinkubasikan dg PMN, dibiakan. Ada/tidaknya pertumbuhan mikroba memberi gambaran kemampuan PMN dlm membunuh mikroba tsb

MACAM PEMERIKSAAN R.I NON SPESIFIK(HUMORAL)

Penetapan kadar CRP (C-Reaktif Protein) CRP: protein fase akut yang akan kadarnya, dpt

sampai melebihi 100x normal yaitu pada keadaan infeksi/peradangan & kerusakan jaringan

Tinggi & lamanya peningkatan tergantung berat ringannya reaksi peradangan akut/kerusakan jaringan tsb

Penetapan kadar CRP memberi hasil lebih sensitif dibandingkan LED

Perbaikan/pengurangan keadaan peradangan dpt diketahui lebih cepat

MACAM PEMERIKSAAN R.I NON SPESIFIK(HUMORAL)….con’t…

Penetapan kadar komplemen

Penetapan kadar C3, C4, faktor B, properdin dapat

memberikan gambaran keadaan kadar komplemen

secara keseluruhan serta aktifasi jalur klasik (intrinsik)

atau alternatif (ekstrinsik)

2.UJI RESPONS IMUN SPESIFIK

Yang berperan: Limfosit T (seluler) & limfosit B (humoral).

Sederhana: Hitung jenis SADT perkiraan secara kasar limfosit & mengamati bentuk limfosit secara seksama dpt diperkirakan jenis limfosit (limfosit tersensitisasi tampak sbg limfosit bersitoplasma biru)

Cara lain: menghitung limfosit absolut & membedakan limfosit T & B berdasar kemampuan khas limfosit T membentuk ‘rosette’ dg eritrosit domba.

Cara handal: mendeteksi jenis limfosit dg mereaksikannya dg anti-imunoglobulin yg dilabel zat warna fluoresin kemudian dilihat di bawah mikroskop fluoresensi

RESPONS IMUN SPESIFIK (SELULER)

Limfosit T tersensitisasi transformasi, proliferasi, diferensiasi limfosit T efektor (sitotoksik), T helper (penolong), T supresor (penekan).

subsel limfosit T dibedakan dg mendeteksi reseptor antigen/petanda permukaan (surface marker)

Surface marker T helper adalah CD 4 (cluster of differentietion) & CD8 utk T sitotoksik maupun T supresor

Individu N limfosit T 75-85% total limfosit; CD4:CD8=±2:1

Uji kualitatif respons imun spesifik (seluler)

Uji transformasi limfosit

50-60% limfosit T mampu memberikan respons terhadap stimulasi dg mitogen yang dianggap menyerupai respons limfosit terhadap antigen

Uji sitotoksisitas

untuk mengukur kemampuan sitotoksisitas limfosit dalam menghancurkan sel sasaran

Uji produksi limfokin

Limfosit memproduksi bermacam-macam limfokin setelah dirangsang oleh antigen. Limfokin berguna untuk menghancurkan antigen sasaran

SEMUA UJI KUALITATIF (UJI FUNGSI) MERUPAKAN UJI IN

VITRO YANG DAPAT MEMBERIKAN HASIL YANG SANGAT

BERVARIASI, MAKA INTERPRETASI HARUS DILAKUKAN

HATI-HATI KARENA TIDAK SELALU MENCERMINKAN

KEADAAN IN VIVO SECARA TEPAT

RESPONS IMUN SPESIFIK (HUMORAL)

Limfosit B akan mengalami perubahan menjadi sel plasma untuk memproduksi antibodi/imunoglobulin

Individu N limfosit B 10-15% total limfosit

Hasil pemeriksaan imunoglobulin (kualitatif/kuantitatif) memberikan gambaran kelainan fungsi limfosit B dalam memproduksi antibodi

Selain limfosit T dan limfosit B dikenal pula populasi sel ‘Null’ atau limfosit non T non B, yaitu:

Sel N.K. (Natural Killer) berperan dalam respons imun seluler non spesifik, khususnya terhadap virus dan sel ganas

Sel K (Killer) memiliki kemampuan sitotoksisitas seluler dg bantuan antibodi ~ ADCC (= Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity

Uji Imunoglobulin

Elektroforesis protein

Utk memeriksa fraksi protein Mrpk pergerakan fase padat thd fase cair dalam

medium listrik menggunakan media penyangga antara lain ‘paper’ selulosa, asetat, agarose

Protein t.d molekul/partikel dg ukuran serta muatan listrik yang berbeda-beda bila diletakkan dalam medan listrik akan bergerak dg kecepatan berbeda. Maka dpt diperoleh pemisahan molekul/partikel scr lengkap

Imunoelektroforesis Gabungan elektroforesis dengan imunodifusi dan

reaksi antigen-antibodi dalam medium gel Fraksi-fraksi protein yg telah terpisah dg cara

elektroforesis selanjutnya direaksikan dg antiserum yang mengandung antibodi spesifik presipitat dari masing-masing fraksi yg berwujud lengkungan-lengkungan.

Tebal, panjang & bentuk lengkungan dinilai dg membandingkan kontrol

Bahan pemeriksaan: serum, urin, cairan biologis lain dipakai

Dapat dipakai utk mendeteksi antigen tertentu & perubahan kualitatif imunoglobulin

Gambaran hasil elektroforesis kelainan imunoproliferatif:

Gamopati poliklonal:

Stimulasi antigenik kronik produksi imunoglobulin (protein heterogen) akibat proliferasi sel plasma yang berasal dari berbagai clone.

Gambaran: kurve puncak tumpul, dasar lebar Gamopati monoklonal:

Produksi imunoglobulin (protein homogen) akibat proliferasi sel plasma tidak terkendali yang berasal dari satu clone. Biasanya terjadi pada keganasan.

Gambaran: Kurve puncak runcing, tinggi, dasar sempit (M-spike)

3. DETEKSI ANTIGEN

Imunoasai: Teknik pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas/kadar antibodi atau antigen dalam cairan tubuh/serum seseorang.

Serologi: Ilmu yang mempelajari reaksi antigen dan antibodi in vitro

Antigen: Molekul kimia (P, KH, L) yg terdpt pd badan virus, bakteri

dsb yg mempunyai sifat merangsang pembentukan antibodi serta dpt mengikat antibodi secara selektif pada bagian struktural dari antigen tsb yg disebut ‘determinant antigen’ /epitop.

Kebanyakan antigen memiliki beberapa epitop

DETEKSI ANTIGEN

Pengertian Antigen Serologi: Menurut bentuk fisik kerjanya dibedakan menjadi:

“precipitating” dan “aglutinating” antigen Menurut penggunaan & hubungannya dg antibodi :

Antigen homolog: Antigen yang mula-mula digunakan untuk imunisasi (memacu pembentukan antibodi) kemudian direaksikan dengan antibodinya

Antigen heterolog: Antigen yang digunakan bukan antigen yang sama dengan yang dipakai untuk imunisasi, tetapi dapat bereaksi silang dengan suatu antibodi produksi antigen lain.

Antigen heterofil: Antigen alami yang tersebar luas dan dapat bereaksi silang dengan banyak macam antibodi karena memiliki epitop-epitop yang identik

DETEKSI ANTIGEN…con’t…

Antibodi Berikatan dg antigen pd “antigen binding site” Dapat mengikat komplemen Antibodi spesifik: Antibodi yg hanya dapat berikatan

dg antigen yg merangsang produksinya Antibodi non spesifik: Antibodi yg dapat berikatan

dg antigen lain dari yang merangsang produksinya yang memiliki satu atau lebih epitop yang serupa

DETEKSI ANTIGEN…con’t…

Antibodi poliklonal: Setiap antigen dpt memacu banyak clones sel plasma dan masing-masing clone dapat memproduksi 1 macam bentuk antibodi.

Respons tsb: respons sel plasma poliklonal (masing2 antibodi akan berikatan dg epitop2 yg sesuai ≈ antigen memiliki bbrp epitop)

Antibodi monoklonal: Antibodi yang berasal hanya dari satu “clone” sel plasma, merupakan antibodi homogen yang spesifik tunggal.

KONSEP DASAR IMUNOASAI

Reaksi antigen dan antibodi membentuk ikatan kompleks (Ab:Ag)

Ab + Ag Ab:Ag

Reaksi bolak balik, kompleks akan berdisosiasi:

Ab:Ag Ab + Ag

Pd saat tertentu terjadi keseimbangan bag berdisosiasi dg yg berasosiasi (equilibrium):

Ab + Ag ↔ Ab:Ag Bukan hanya antibodi yg dpt ditentukan menggunakan

antigen yg diketahui tetapi sebaliknya ≈ reverse serology, mis: Reverse Passive Hemagglutination test

KONSEP DASAR IMUNOASAI…con’t…

Afinitas antibodi: kekuatan interaksi antara antibodi dg epitop tunggal (monovalen)

Aviditas antibodi: kekuatan interaksi antibodi heterogen dg antigen multivalen.

Aviditas mrpk refleksi dari afinitas dalam jumlah binding sites

Ikatan Ag-Ab dipengaruhi bbrp faktor: Ikatan hidrogen Daya elektrostatik Ikatan van der Waals Ikatan hidrofobik

Daya Coulombic/elektrostatik:

Daya tarik menarik antara gugusan molekul antigen dengan antibodi yang mempunyai muatan listrik berlawanan. Makin dekat jarak antigen antibodi makin cepat keduanya berikatan

Daya Van der Waals:

Ikatan karena adanya kesesuaian antara antibodi dengan permukaan “determinant antigen” (epitop).

Ikatan antigen dengan antibodi merupakan ikatan reversibel & mudah berdisosiasi



Ukuran kuantitas Antibodi: Kualitatif; Menyatakan ada/tidaknya antibodi dalam bahan yg

diperiksa dg melihat adanya perubahan dari bahan yg diperiksa.

Contoh: uji VDRL mikro, perubahan warna pd penentuan HBs antigen secara ELISA

Semikuantitatif: Kadar antibodi atau bahan lain dalam bahan yang diperiksa ditentukan dengan cara pengenceran bahan pemeriksaan secara progresif. Kuantitas dinyatakan dlm bentuk titer. Titer adalah harga kebalikan dr pengenceran bahan pemeriksaan yg masih memberi reaksi (+).

Kuantitatif: Ditentukan dg menggunakan bbrp sera baku yg telah diketahui kadar bahan yg akan ditentukan, misal antibodi & dibuat kurva baku

MACAM-MACAM IMUNOASAI

IMUNOASAI TAK BERLABEL Faktor dasar yang mempengaruhi:

Sifat antigen Elektrolit & PH Waktu & suhu Perbandingan Ag & Ab (hasil reaksi bisa dilihat apabila terjadi

zona ekuivalen. Jk Ag>Ab prozone. Jk Ag<Ab postzone) Mekanisme daya tahan tak spesifik (misal: produk sampingan

flora normal masuk dlm cairan tubuh/serum, bahan mikrobisidal yg normal terdpt pada cairan tubuh, interferon yg dikeluarkan oleh limfosit T pd infeksi virus, dll)

JENIS IMUNOASAI TAK BERLABEL

Uji Presipitasi

Ag yg larut bereaksi dg Ab-nya akan terjadi presipitasi Uji presipitasi lempeng (slide), contoh: Uji VDRL mikro Uji presipitasi tabung (tube test), contoh: Uji VDRL makro Uji presipitasi tabung kapiler, contoh: penentuan CRP Uji presipitasi cincin, contoh: Penentuan Ab thd albumin telur Uji Difusi agar (Gel diffusion test), contoh: Penentuan bbrp Ag

atau Ab (Difusi tunggal, jarang dipakai), Penentuan Ab thd jamur (Difusi ganda sederhana), Difusi ganda majemuk

Imunoelektroforesis Imunodifusi radial (RID), contoh: Penentuan kadar Ig kelas

tertentu (IgM, IgG, IgA), penentuan HBs antiugen, Ab thd parasit. Counterimmunoelectrophoresis, contoh: Deteksi HBs Ag atau Ab Elektroimunodifusi (EID), contoh: Penentuan Ig

JENIS IMUNOASAI TAK BERLABEL…con’t…

Uji Aglutinasi

Reaksi antara Ab dg Ag seluler atau Ag pd permuk sel. (Aglutinatnya mrpk agregasi dari banyak sel) Uji aglutinasi lempeng (slide), contoh: Uji Widal Lempeng Uji aglutinasi tabung, contoh: Uji Widal, uji Weil Felix, identifikasi

bakteri, uji aglutinasi fungi, dll Uji hambatan aglutinasi, contoh: Uji konfirmasi RPHA untuk

penentuan HBsAg Aglutinasi tak langsung

• Aglutinasi pasif, contoh: Uji kehamilan, uji aglutinasi lateks• Ab inkomplet, contoh: Uji Rose-Waaler utk deteksi faktor

Rematoid


Uji Hemaglutinasi

: Uji aglutinasi sel darah merah (domba) Uji Hemaglutinasi Slide & tabung Uji Hemaglutinasi langsung Uji Hemaglutinasi pasif Uji Hambatan Hemaglutinasi Uji Hambatan Hemadsorbsi Uji Hemagregasi Uji Hemaglutinasi campuran


Lisis Imun & Fiksasi Komplemen Uji fiksasi komplemen, contoh: Uji Wasserman,

deteksi antibodi terhadap virus, fungi, parasit, dll Uji Hambatan Fiksasi Komplemen


Uji Netralisasi:Berbagai pengenceran serum dicampur dengan sejumlah tertentu toksin atau suspensi kuman. Campuran tsb kemudian dibiarkan bereaksi kemudian diuji reaktivitas toksinnya atau viabilitas kumannya.ANTITOKSIN + TOKSIN NETRALISASI TOKSIN Netralisasi toksin:

• Uji proteksi hewan (Penentuan toksin antidifteri, antitetanus)• Uji Antistreptolisin O

Netralisasi Virus:• Uji in vivo• Uji in Ovo• Pock Reduction Test• Uji perbenihan jaringan• Plaque Reduction Test• Uji hambatan metabolik

IMUNOASAI BERLABEL

ASAI BERLABEL FLUOROSENS ASAI BERLABEL RADIOISOTOP

Radioimunoasai (RIA) radiolabelisasi dilakukan pada antigen

Imunoradiometrik asai (IRMA) radiolabelisasi dilakukan pada antibodi

LUMINESCENT IMUNOASAI (LIA)Label: bahan luminescent

ASAI BERLABEL ENSIM (EIA) EIA homogen EIA Heterogen = ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT

ASSAY (ELISA)

RADIOIMUNOASAI (RIA)

Prinsip DasarRIA didasarkan pada reaksi antara suatu antibodi dalam berbagai konsentrasi antigen. Digunakan label radioisotopik untuk membedakan fraksi antigen yang terikat pada antibodi dengan fraksi antigen yang bebas.Bila sisa antigen yang diberi label & tidak terikat pada antibodi dipisahkan dari campuran, mk jumlah antigen berlabel yg terikat pada antibodi ditentukan dengan radiation counter atau gamma counter

RIA kompetitif, dipakai untuk penentuan bahan tertentu di dalam serum penderita

IgM Captured RIA, dipakai untuk menentukan Ig M terhadap antigen

RADIOIMUNOASAI (RIA)…con’t…

Aplikasi Klinis;

Penentuan bahan dalam kadar kecil di dalam serum (AFP, CRP, hormon)

Ig M captuted RIA dipakai untuk penentuan Ig M spesifik terhadap virus poliomyelitis

Keuntungan: Timbulnya background staining dapat diabaikan (sensitivitas

terpenuhi) Disintegrasi radioaktif tak dipengaruhi oleh perubahan

fisikokimiawi (PH, konsentrasi, suhu, dll)

Kerugian: waktu paruh 125I relatif pendek

ELISA

Pemberian label enzim pada Antigen; ELISA kompetitif untuk penentuan antigen ELISA titrasi untuk penentuan antigen Solid Phase Anti-Ig M ELISA untuk penentuan antibodi (Ig M)

Pemberian Label Enzim pada Antibodi; Double antibody sandwich ELISA untuk penentuan antigen Inhibition ELISA untuk penentuan antigen

ELISA Kompetitif

Prinsip Dasar

Antigen yang diberi label dicampur dengan bahan pemeriksaan yg juga mengandung antigen yg sama dan akan ditentukan, sehingga terjadi kompetisi dalam mengikat sejumlah yang terbatas antibodi spesifik yang terikat pada fase padat.

Aktivitas enzim yang terikat berbanding terbalik dg kadar antigen yg terdapat dlm bahan pemeriksaan

Aplikasi klinis: Penentuan berbagai hormon secara kuantitatif

(T3,T4,TSH,insulin, kortisol) Penentuan protein tertentu (CRP, AFP) Penentuan kadar berbagai obat seperti digoxin

DOUBLE ANTIBODY SANDWICH ELISA

Prinsip Dasar

Bahan pemeriksaan yang mengandung antigen direaksikan dengan antibodi spesifik pertama yang terikat pada fase padat. Selanjutnya ditambahkan antibodi spesifik kedua yang berlabel enzim. Akhirnya ditambahkan substrat dari enzim tersebut.

Aktivitas enzim yang terikat berbanding lurus dengan kadar antigen dalam bahan pemeriksaan.

Aplikasi Klinis; Penentuan IgE total HBsAg Hormon

QUIZ

Apa saja yg bisa dilakukan untuk menguji adanya gangguan dalam respons imun non spesifik humoral?

Apa saja yg bisa dilakukan untuk menguji respons imun spesifik seluler?

Kekuatan yang mengikat antigen-antibodi dipengaruhi oleh apa saja?

UJI INTERAKSI ANTIGEN ANTIBODI

1. Reaksi presipitasi

- utk antibodi/antigen terlarut terbentuk presipitat

- jml antigen & antibodi hrs seimbang

2. Reaksi aglutinasi

- utk antibodi/antigen btk partikel terbentuk aglutinasi

- jml antigen & antibodi hrs seimbang

- m/ : Widal, gol darah, tes kehamilan

3. Interaksi antigen antibodi tingkat molekuler

RIA (radio immunoassay)

ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay)

Dasar Pemx Lab Imun

Documents

Transcript of Dasar Pemx Lab Imun