Dampak dari asam oleat sebagai co-substrat glukosa pada efect " jangka pendek" dan "jangka panjang" efek

Crabtree pada Saccharomyces cerevisiae

Jillian Marc, David Feria-Gervasio, Jean-Roch Mouret,Stéphane E Guillouet

LATAR BELAKANGOptimasi dari industri biomassa diarahkan untuk proses yang memberikan hasil biomassa yang tinggi. Namun, beberapa ragi seperti Saccharomyces cerevisiae dapat mengalami efek Crabtree di bawah kelebihan glukosa. Hal ini dapat terjadi pada tangki skala besar dimana terdapat heterogenitas dalam konsentrasi glukosa. Oleh karena itu kelebihan glukosa dapat menyebabkan terjadinya produksi etanol yang dapat menghambat pembentukan biomassa. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa asam oleat sebagai co-substrat dalam chemostat terbatas glukosa dapat menunda dan memodulasi efek "jangka pendek" efek Crabtree pada Saccharomyces cerevisiae. Disini akan diteliti lebih lanjut mengenai pengaruh dari asam oleat sebagai modulator dari efek Crabtree.

METODE STRAIN DAN MEDIAoStrain Saccharomyces

cerevisiae CEN.PK 113-7D dan CA10/pCD63

oMedia YPD (10 g L-1 ekstrak ragi, 20 g L-1 bactopeptone, 20 g L-1 glukosa, 15 g L-1 agar)

KULTIVASI

o Kultur chemostat dengan S. cerevisiae CA10/pCD63

o Kultur accelerostat dengan S. cerevisiae CEN.PK 113-7D

o Kultur batch dengan S. cerevisiae CEN.PK 113-7D

o Kultur VHEP fed-batch dengan S. cerevisiae CEN.PK 113-7D

ANALISIS OFF-GASKomposisi gas inlet dan outlet dianalisis dengan spektrometri massa. Untuk chemostats dan A-stat, analisis dilakukan setiap 5 menit selama steady state, setiap 45 s selama akselerasi A-stat dan setiap 5 s selama pulse dinamis dengan PRIMA 600s (gas VG, Manchester, Inggris). Untuk batch dan fed-batch, analisis dilakukan setiap 5 menit dengan Proline Dycor (Instrument Proses Ametek, Berwyn, USA). Aerasi dimulai 1 jam setelah inokulasi.

PENENTUAN BIOMASSAPengukuran spektrofotometri pada 620 nm dilakukan dengan spektrofotometer Hitachi U-1100 atau Libra S4. Untuk penentuan berat kering sel, medium kultur dipanen dan disaring pada membran poliamid dengan ukuran pori 0,45 pM, yang kemudian dikeringkan sampai berat konstan pada 60°C dibawah tekanan parsial (200 mmHg, yaitu kira-kira 26,7 kPa). 500 μl medium kultur dicampur dengan 500 μl iso-propanol untuk menghilangkan asam oleat. Campuran divortex selama 1 menit dan disentrifugasi selama 3 menit pada 12.000×g. Butiran diresuspensi dalam 500 μl air untuk pengukuran spektrofotometri. Untuk penentuan berat kering sel, membran dicuci setelah penyaringan dengan heksana dan air untuk menghilangkan asam oleat.

PENENTUAN VIABILITAS SEL

Pewarnaan sel dengan metode metilen biru digunakan untuk menjelaskan penentuan viabilitas sel Dengan adanya oleat, suspensi sel disiapkan seperti suspensi sel untuk menjelaskan prosedur sebelum pewarnaan.

ANALISIS METABOLITSampling untuk analisis metabolit dilakukan dengan sampling kaldu langsung dari bioreaktor melalui membran poliamid steril dengan ukuran pori 0,45 pM. Permeat dapat dianalisis langsung (chemostats dan A-stat) atau dibekukan pada -20 ° C untuk analisis lebih lebih lanjut (batch dan fed-batch).Konsentrasi glukosa dianalisa dengan metode enzimatik dengan YSI Model analyzer 27 A (YSI Life Science, Yellow Springs, USA). Penentuan akurat glukosa, etanol, gliserol dan asam organik dari permeat dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Untuk chemostats dan A-stat, konsentrasi etanol dan asam asetat ditentukan dengan kromatografi gas.Penentuan konsentrasi asam oleat dilakukan dengan dua metode pada penyaringan supernatan yang diperoleh setelah iso-propanol dicuci dan disentrifugasi.

HASIL DAN PEMBAHASAN DAMPAK ASAM OLEAT TIDAK SPESIFIK UNTUK STRAIN CEN.PK 113-7D

ASAM OLEAT BERDAMPAK PADA CRITICAL DILUTION RATE (Dc)

EFEK ASAM OLEAT REVERSIBEL SEBAGIAN

DAMPAK ASAM OLEAT EFEKTIF UNTUK BEBERAPA JAM SELAMA FERMENTASI VHEP DIBAWAH TEKANAN OLEAT

IMPLIKASI UNTUK SKALA PROSES PRODUKSI BIOMASSA

Penggunaan asam oleat oleh industri dalam proses tersebut dapat menyebabkan pengelolaan yang lebih baik dalam masalah heterogenitas ketika terjadi efek Crabtree yang tidak diinginkan. Selain itu, kami menunjukkan bahwa dampak oleat tidak tergantung strain tetapi reversibel. Oleh karena itu, persiapan starter ragi dengan oleat sebagai co-substrat glukosa dapat digunakan dalam berbagai aplikasi, menerapkan efek Crabtree atau tidak.

KESIMPULANDari hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan asam oleat sebagai co-substrat glukosa dapat mengurangi terjadinya efek "jangka pendek" serta "jangka panjang“ efek crabtree. Dampak ini tidak tergantung strain dan reversible. Dengan demikian, aplikasi industri strategi biokimia dapat dipertimbangkan untuk mengatasi masalah heterogenitas dalam tangki skala besar atau untuk mempersiapkan starter ragi untuk berbagai aplikasi.

KULTIVASI CHEMOSTAT DENGAN S. cerevisiae CA10/pCD63Tingkat pengenceran yang ditetapkan sebesar

0,18h-1 untuk S. cerevisiae CA10/pCD63 untuk menjaga sel-sel di bawah metabolisme oksidatif murni. Bioreaktor diberi tambahan media mineral dengan glukosa pada 38 g L-1 untuk chemostat glukosa dan 39 g L-1 untuk chemostat oleat-glukosa. Chemostat oleat-glukosa ini juga ditambah dengan 720 g L-1 larutan asam oleat pada tingkat pengenceran 0,0041h-1.  Setelah pembentukan steady state, enam sampel independen diambil selama periode 40 jam untuk karakterisasinya. Kemudian pulse glukosa dilakukan dengan menyuntikkan larutan glukosa yang volumenya diketahui 600 g L-1 untuk mendapatkan konsentrasi dalam reaktor 10 g L-1. Pompa influen dan efluen berjalan terus menerus selama percobaan. Percobaan ini dilakukan dua kali untuk setiap kondisi dalam dua chemostat independen.

KULTIVASI ACCELEROSTAT DENGAN S. cerevisiae CEN.PK 113-7D

Kultur accelerostat dilakukan dengan strain CEN.PK 113-7D dalam kondisi yang sama seperti untuk kultur chemostat, dengan konsentrasi glukosa 37 g L-1 untuk A-stat glukosa dan 38 g L-1 untuk A-stat oleat-glukosa.

KULTIVASI BATCH DENGAN S. cerevisiae CEN.PK 113-7D

Kultur batch dilakukan dalam 5 L bioreaktor B DCU B.Braun dengan volume kerja 3 L, dikelola dengan software MFCS/win 2.0. Suhu diatur pada 30°C dan pH pada 5.0 dengan penambahan 1 M NaOH. Aliran udara dan laju pengadukan disesuaikan untuk menjaga kondisi sepenuhnya aerobik. Inokulasi dilakukan dengan S. cerevisiae CEN.PK 113-7D sel dipanen pada steady state dalam chemostat terbatas glukosa pada D=0,16h-1 untuk BGCG, atau dalam chemostat terbatas glukosa pada D=0,16h-1 dengan oleat sebagai co-substrat pada D=0,0073h-

1 untuk BGCGO dan BGOCGO

KULTIVASI VHEP FED-BATCH DENGAN S. cerevisiae CEN.PK 113-7D

Kultur fed-batch dilakukan dalam 5 L bioreaktor B DCU B.Braun dengan volume kerja 3 L, dikelola dengan software MFCS/win 2.0. Suhu diatur pada 30°C dan pH pada 4.0 dengan penambahan 14% (v/v) larutan NH3. Inokulasi dilakukan pada piring YPD dari S. cerevisiae CEN.PK 113-7D.