Karakterisasi Persyaratan Metabolik dalam Ragi Meiosis

abstrak

The diploid ragi Saccharomyces cerevisiae mengalami mitosis dalam medium yang kaya glukosa tetapi memasuki meiosis dalam medium sporulasi asetat . Transisi dari mitosis ke meiosis melibatkan adaptasi yang luar biasa dari mesin metabolisme dengan perubahan lingkungan untuk memenuhi energi dan biosintesis persyaratan baru . Studi biokimia menunjukkan bahwa lima jalur metabolik aktif pada berbagai tahap sporulasi : pembentukan glutamat , siklus asam trikarboksilat , siklus glioksilat , glukoneogenesis , dan glikogenolisis . Sebuah sintesis dinamis makromolekul , termasuk nukleotida , asam amino , dan lipid , juga diamati . Namun, persyaratan metabolisme sel-sel bersporulasi yang kurang dipahami . Dalam studi ini , kami menerapkan keseimbangan fluks analisis untuk mengungkap prinsip-prinsip optimal mengemudi pengoperasian jaringan metabolik selama seluruh periode sporulasi . Sebuah jaringan metabolik - meiosis khusus dibangun , dan distribusi fluks disimulasikan menggunakan sepuluh fungsi obyektif dikombinasikan dengan ekspresi berbasis waktu -kursus kendala reaksi . Dengan sistematis mengevaluasi korelasi antara fluks komputasi dan eksperimental pada jalur dan sintesis makromolekul , kebutuhan metabolisme sel ditentukan : sporulasi membutuhkan maksimalisasi produksi ATP dan makromolekul sintesis pada fase awal diikuti dengan maksimalisasi karbohidrat kerusakan dan meminimalkan produksi ATP dalam menengah dan tahap akhir . Model komputasi kami divalidasi oleh in silico penghapusan enzim yang dikenal menjadi penting untuk sporulasi . Akhirnya , model yang digunakan untuk memprediksi gen metabolisme baru yang dibutuhkan untuk sporulasi . Penelitian ini menunjukkan bahwa sel-sel ragi memiliki persyaratan metabolik yang berbeda pada berbagai fase meiosis , yang mungkin mencerminkan regulasi yang menyadari hasil optimal sporulasi . Model jaringan - meiosis spesifik kami menyediakan kerangka kerja untuk pemahaman mendalam tentang peran enzim dan reaksi , dan dapat membuka jalan baru untuk rekayasa jalur metabolisme untuk meningkatkan efisiensi sporulasi

Introduksi

Meiosis adalah program pembelahan sel sangat dilestarikan yang menghasilkan gamet haploid dari sel diploid orangtua . Meiosis sukses adalah dasar fundamental reproduksi seksual . Meiosis telah dipelajari secara ekstensif dalam beberapa sistem model , mulai dari ragi Saccharomyces cerevisiae untuk pemula mouse . Beberapa baris bukti menunjukkan adanya hubungan erat antara meiosis dan metabolisme [ 1 ] . Dalam ragi , meiosis dipromosikan oleh kekurangan gizi [ 2 ] , sedangkan pada mouse , sel-sel germinal laki-laki dan perempuan memasuki meiosis dalam menanggapi asam retinoat [ 3 ] , [ 4 ] . Dalam nematoda C. elegans dan lalat buah Drosophila melanogaster , ablasi germline mengarah ke pergantian mendalam dalam metabolisme lipid [ 5 ] , [ 6 ] . Kami fokus pada

meiosis ragi dalam penelitian ini untuk menjelaskan hubungan antara reproduksi dan metabolisme , yang dapat meningkatkan pemahaman kita tentang kontrol metabolik pada proses meiosis .

Ragi diploid mengalami mitosis dalam medium yang kaya glukosa . Ketika sel-sel yang dipindahkan ke media sporulasi asetat , saklar perkembangan dari mitosis ke meiosis terjadi untuk menghasilkan empat spora haploid [ 2 ] . Switch ini tergantung pada heterozigot kawin - jenis lokus perampasan sumber karbon dan nitrogen difermentasi serta [ 7 ] . Mesin ragi metabolisme harus membuat adaptasi yang luar biasa terhadap sinyal lingkungan dengan berurutan mengaktifkan atau menghambat sejumlah besar enzim dalam jalur yang berbeda . Adaptasi ini memastikan sel akan memenuhi energi dan persyaratan biosintesis selama sporulasi . Oleh karena itu, jaringan metabolik sangat penting dalam menentukan keberhasilan ragi meiosis .

Perbedaan mencolok telah diamati dalam metabolisme antara mitosis dan meiosis . Dalam mitosis , glukosa dikonsumsi oleh fermentasi atau respirasi melalui asam trikarboksilat ( TCA ) siklus . Pada meiosis , asetat berfungsi sebagai sumber karbon dan lima jalur metabolik aktif pada tahapan yang berbeda : pembentukan glutamat , siklus TCA , siklus glioksilat , glukoneogenesis , dan glikogenolisis ( Gambar 1 ) [ 8 ] , [ 9 ] , [ 10 ] , [ 11 ] , [ 12 ] , [ 13 ] , [ 14 ] , [ 15 ] . Lambatnya asimilasi asetat selama meiosis dibandingkan dengan konsumsi yang cepat glukosa dalam mitosis diyakini memungkinkan adaptasi dari glikolisis ke glukoneogenesis dan menghindari penipisan ATP intraseluler [ 14 ] . Selama meiosis , asetat eksternal pertama-tama diubah menjadi asetil - CoA dan dimetabolisme oleh respirasi melalui siklus TCA untuk menghasilkan energi [ 9 ] , [ 10 ] , [ 14 ] . Glutamat pertama dihasilkan dari oksoglutarat prekursor , yang merupakan perantara dari siklus TCA [ 9 ] . Reaksi pembentukan glutamat menghilangkan ion amonium , inhibitor kuat ragi sporulasi [ 16 ] . Siklus glioksilat merangkap aktif dengan siklus TCA untuk mengisi intermediet TCA yang kelelahan karena produksi glutamat [ 9 ] . Glukoneogenesis melibatkan sintesis dari karbohidrat dalam bentuk glikogen dan trehalosa , yang menyumbang dua - pertiga dari peningkatan massa selama meiosis [ 11 ] . Khususnya , produksi glutamat dihentikan pada saat jalur glukoneogenesis menjadi berfungsi penuh [ 9 ] . Siklus glioksilat juga terjadi bersamaan dengan glukoneogenesis untuk memasok substrat [ 14 ] . Selama pematangan spora , asetat telah habis dari media [ 9 ] , [ 10 ] , [ 14 ] ; glikogen kemudian dikonsumsi melalui glikogenolisis untuk menyediakan energi [ 8 ] . Aktivasi berurutan jalur metabolisme dan interaksi antara sel-sel jalur pasokan ini dengan energi dan makromolekul yang dibutuhkan , yaitu , nukleotida , asam amino , dan lipid [ 9 ] , [ 10 ] , [ 13 ] , [ 15 ] .

Meskipun jalur baik ditandai dari studi biokimia , prinsip-prinsip yang optimal bertanggung jawab atas perubahan metabolik dramatis menyertai meiosis yang kurang dipahami . Tujuan seluler , yaitu , kebutuhan metabolisme sel , yang belum ditentukan . Kami membangun jaringan metabolik - meiosis tertentu dalam ragi dan menerapkan model pendekatan - flux berbasis analisis kendala keseimbangan ( FBA ) [ 17 ] - untuk mengkarakterisasi kebutuhan metabolisme sel bersporulasi . FBA memprediksi distribusi fluks dalam jaringan metabolik menggunakan pemrograman linear atau nonlinear dengan pengetahuan tentang stoikiometri reaksi , fungsi tujuan , dan kendala reaksi . Keuntungan dari FBA adalah bahwa itu circumvents kebutuhan untuk parameter kinetik enzim yang sulit untuk diukur , dapat dengan mudah ditingkatkan untuk menyelidiki jaringan genom - skala , dan

sangat cocok untuk karakterisasi dalam gangguan silico seperti gen atau KO reaksi [ 18 ] . FBA telah digunakan dengan sukses besar dalam mempelajari organisme atau metabolisme spesifik jaringan dengan aplikasi seperti jalur engineering [ 19 ] , [ 20 ] , [ 21 ] , [ 22 ] , [ 23 ] , [ 24 ] , [ 25 ] , [ 26 ] , [ 27 ] . Meskipun beberapa jaringan metabolik genom skala telah diterbitkan dan pendekatan FBA telah diterapkan untuk menyelidiki metabolisme ragi , penelitian ini terutama berfokus pada pertumbuhan mitosis sel terbatas pada glukosa [ 21 ] , [ 26 ] , [ 28 ] , [ 29 ] , [ 30 ] . Penelitian kami berfungsi sebagai upaya pertama untuk mengkarakterisasi jaringan metabolik - meiosis tertentu dalam ragi oleh FBA . Menggunakan ekspresi gen time-series sebagai kendala reaksi , kita mengidentifikasi kebutuhan metabolisme dinamis sel pada fase yang berbeda dari meiosis . Model jaringan kami menyediakan kerangka kerja untuk memprediksi enzim baru penting untuk meiosis ragi , beberapa di antaranya telah diverifikasi dalam literatur . Pada akhirnya , penelitian ini memaparkan prinsip-prinsip yang optimal mendorong operasi jaringan metabolisme ragi , yang memastikan berhasil menyelesaikan sporulasi .

hasil

Profil dinamis jaringan metabolik - meiosis spesifik ragi

Sebuah jaringan metabolik - meiosis spesifik direkonstruksi berdasarkan literatur dan database [ 28 ] , [ 29 ] , [ 31 ] , [ 32 ] , [ 33 ] , [ 34 ] , [ 35 ] , [ 36 ] , [ 37 ] , [ 38 ] , [ 39 ] , [ 40 ] , [ 41 ] , [ 42 ] , [ 43 ] , [ 44 ] , [ 45 ] , [ 46 ] , [ 47 ] , [ 48 ] , [ 49 ] , [ 50 ] , [ 51 ] , [ 52 ] , [ 53 ] , [ 54 ] . Jaringan ini dikuratori manual terdiri dari 31 metabolit dan 62 reaksi dikatalisis oleh enzim 69 ( Gambar 1 , Tabel S1 , Model S1 ) . Lima jalur dijelaskan ketika menggunakan asetat eksternal sebagai sumber karbon tunggal : pembentukan glutamat , siklus TCA , siklus glioksilat , glukoneogenesis , dan glikogenolisis . Makromolekul yang dihasilkan dari jalur ini termasuk nukleotida , asam amino , dan lipid . Jaringan - meiosis khusus ini lebih cocok untuk mempelajari ragi meiosis karena beberapa alasan : 1 ) itu termasuk reaksi dan enzim khusus untuk metabolisme asetat; 2 ) menggabungkan reaksi dan enzim yang hilang dalam rekonstruksi genom skala , dan 3 ) setiap reaksi memiliki hubungan enzim - reaksi dikenal . Sebuah perbandingan rinci antara jaringan - meiosis spesifik dan iMM904 [ 28 ] , jaringan ragi metabolisme genom skala , dapat dilihat pada Tabel S2 .

Namun, jalur metabolisme dan sintesis makromolekul tidak konstitutif aktif sepanjang meiosis . Sebaliknya , masing-masing memiliki profil dinamis yang unik didasarkan pada studi eksperimental [ 8 ] , [ 9 ] , [ 10 ] , [ 11 ] , [ 12 ] , [ 13 ] , [ 14 ] , [ 15 ] , [ 55 ] . Kami menganalisis di beberapa dataset biokimia paralel ( Tabel S3 ) . Karena metode eksperimental yang digunakan untuk mengukur jalur dan makromolekul berbeda , tidak mungkin untuk membandingkan secara langsung kegiatan mereka . Misalnya, aktivitas siklus TCA diperkirakan berdasarkan konsumsi oksigen , sedangkan aktivitas glikogenolisis ditentukan oleh kinetika enzim [ 8 ] , 13 . Oleh karena itu , setiap kegiatan jalur skala untuk rentang 0 dan 1 untuk mengamati dinamika seluruh meiosis . Selain itu, strain ragi yang berbeda yang digunakan dalam percobaan ini biokimia . Dengan demikian , data yang diperoleh

dengan menggunakan strain lainnya dikalibrasi untuk skala waktu SK1 , strain yang umum digunakan untuk mempelajari meiosis , sesuai dengan durasi saat pembentukan ascus mencapai keadaan stabil . Kegiatan jalur skala dan waktu sporulasi yang skala yang ditunjukkan pada Gambar 2 , kami menemukan aktivasi berurutan jalur dan sintesis makromolekul . Glutamat adalah metabolit utama yang dihasilkan selama empat jam pertama sporulasi [ 9 ] , [ 10 ] . Kegiatan puncak siklus TCA pada dua jam dan kemudian menurun [ 13 ] , [ 14 ] . Glukoneogenesis , termasuk sintesis glikogen dan trehalosa , naik kemudian dan mencapai tingkat tertinggi pada empat jam sporulasi [ 8 ] , [ 9 ] , [ 11 ] , [ 12 ] , [ 13 ] . Sebaliknya , glikogenolisis tidak memulai sampai empat jam dan merupakan satu-satunya jalur aktif selama tahap akhir meiosis [ 8 ] , [ 13 ] . Meskipun tidak ada data eksperimen yang tersedia untuk siklus glioksilat , aktivitasnya dapat diperkirakan dari pembentukan glutamat dan glukoneogenesis . Persediaan siklus glioksilat TCA intermediet siklus untuk pembentukan glutamat dan glukoneogenesis selama awal dan pertengahan fase meiosis , menunjukkan aktivitas berkorelasi dengan dua jalur ini [ 9 ] , [ 14 ] . DNA , RNA , dan protein disintesis awal selama empat jam pertama sporulasi [ 10 ] , [ 13 ] , sedangkan puncak lipid produksi di empat dan sepuluh jam , masing-masing [ 10 ] , [ 15 ] .

Kebutuhan metabolisme sel ragi selama sporulasi

Untuk menentukan kebutuhan metabolisme bersporulasi ragi , kami secara sistematis mengevaluasi sepuluh fungsi tujuan yang relevan dengan meiosis : produksi ATP , konsumsi ATP , produksi ATP bersih ( produksi dikurangi konsumsi ) , serapan asetat , sintesis glutamat , sintesis karbohidrat , karbohidrat kerusakan , sintesis nukleotida , amino sintesis asam , dan sintesis lipid . Tidak semua enzim disajikan pada waktu tertentu selama meiosis . Untuk mencerminkan profil dinamis jaringan metabolik , kami membatasi batas atas reaksi menggunakan waktu -kursus ribosom profil data pada SK1 bersporulasi sel [ 56 ] . Langkah-langkah ribosom profil ribosom dilindungi tingkat mRNA oleh sekuensing mendalam , yang perkiraan untuk kegiatan enzim . Data ekspresi gen mutlak digunakan untuk membuat kontinu , daripada batas reaksi diskrit . Sebanyak 18 titik waktu mencakup 12 jam sporulasi dianggap .

Sepuluh fungsi tujuan secara individual dimaksimalkan atau diminimalkan pada masing-masing 18 poin waktu, hal ini setara dengan mengevaluasi 360 model FBA . Solusi optimal dari fluks jaringan ditentukan untuk masing-masing model . Kami menghitung korelasi Pearson antara fluks diprediksi dan data biokimia (Tabel S4 ) pada delapan jalur dan sintesis makromolekul : pembentukan glutamat , siklus TCA , siklus glioksilat , glukoneogenesis , glikogenolisis , nukleotida , asam amino , dan lipid ( Tabel S1 , disingkat delapan jalur di sisa kertas ) . The Pearson korelasi mengukur hubungan linier antara data komputasi dan biokimia saat bersamaan mempertimbangkan beberapa jalur . Hal ini memungkinkan identifikasi fungsi tujuan yang paling relevan berdasarkan metrik kuantitatif . Karena kegiatan jalur dan sintesis makromolekul menunjukkan pola dinamis yang berbeda , kebutuhan metabolisme sel harus berubah . Memang , fungsi terbaik tujuan yang berbeda , yaitu , tujuan dengan koefisien korelasi maksimum pada setiap titik waktu , diidentifikasi selama periode sporulasi

diskusi

Ragi meiosis adalah proses reproduksi menghasilkan empat spora haploid dari satu sel diploid . Pergeseran dari mitosis untuk keadaan meiosis membutuhkan beberapa penyesuaian dalam sel . Memang , sel terus-menerus menyesuaikan mesin metabolisme mereka untuk memenuhi energi dan biosintesis persyaratan baru , dan ini tidak kurang benar dalam proses meiosis . Dekade penelitian biokimia telah mengidentifikasi sebagian enzim yang mengkatalisis reaksi metabolik . Namun, prinsip-prinsip yang optimal yang mendorong adaptasi dinamis jalur metabolisme yang kurang dipahami .

FBA dapat dimanfaatkan untuk memprediksi distribusi fluks dalam jaringan metabolik ketika fungsi tujuan yang diketahui . Karena persyaratan metabolik uncharacterized dalam ragi meiosis , kita menguji total sepuluh fungsi tujuan kemungkinan untuk mengungkap prinsip-prinsip yang optimal untuk berbagai tahapan meiosis . Meskipun FBA memprediksi distribusi fluks pada steady state , penggunaan data ekspresi waktu - kursus untuk batas reaksi memungkinkan kita untuk mengubah kendala , menghasilkan fluks dinamis selama seluruh periode ragi meiosis . Tingkat mRNA ribosom dilindungi diukur dengan sekuensing mendalam [ 56 ] adalah perkiraan aktivitas enzim , namun mereka unggul terhadap total tingkat mRNA diperkirakan dari eksperimen microarray [ 55 ] . Sebuah analisis yang sistematis tentang hubungan antara fluks di silico dan fluks vivo dilakukan menggunakan metrik - kuantitatif koefisien korelasi Pearson . Ini mengukur keseluruhan perjanjian antara nilai-nilai jalur komputasi dan eksperimental dan memungkinkan perbandingan langsung kinerja semua tujuan . Hasil kami dari jaringan - meiosis spesifik menunjukkan bahwa kebutuhan metabolisme sel berkembang selama sporulasi , dimulai dengan maksimalisasi produksi ATP diikuti oleh glutamat dan sintesis nukleotida maksimalisasi . Karbohidrat dalam bentuk glikogen yang kemudian dipecah untuk memasok energi . Pada akhirnya , di bawah kelangkaan nutrisi , sel mengurangi semua kegiatan jalur dengan membatasi produksi ATP , yang mengarah ke tahap dorman dari spora . Fungsi tujuan yang sama ditentukan dari jaringan genom skala : ATP maksimalisasi produksi di awal fase dan ATP minimalisasi produksi pada tahap akhir . Kebutuhan metabolisme konsisten diungkapkan oleh dua jaringan skala yang berbeda menunjukkan kekokohan solusi fluks optimal pada jalur . Fungsi-fungsi tujuan terbaik mencerminkan adaptasi seluler terhadap lingkungan asetat dengan beralih dari glikolisis untuk glukoneogenesis , menggunakan ATP secara efisien , dan memproduksi makromolekul untuk pembentukan spora .

Model jaringan meiosis spesifik divalidasi menggunakan gen diketahui diperlukan untuk sporulasi [ 57 ] dengan mempelajari efek KO gen tunggal . Model memperkirakan fenotip sporulasi - kekurangan dengan hypergeometric P - nilai yang signifikan dari 0,009 , menunjukkan bahwa jaringan khusus dan akurat menangkap reaksi aktif selama meiosis ragi . Model genom skala mencapai P - nilai yang sebanding tetapi dengan presisi rendah . Keuntungan dari jaringan genom

skala adalah bahwa mereka mengandung semua reaksi yang terjadi dalam sel, termasuk jalur yang mungkin menjadi aktif ketika proses meiosis berada di bawah gangguan internal atau eksternal . Namun, model genom skala telah hilang reaksi dan enzim . Misalnya, sepertiga dari reaksi di iMM904 tidak memiliki hubungan enzim , rata-rata ekspresi genome digunakan untuk membatasi fluks maksimum melalui reaksi-reaksi ini , yang dapat menghasilkan solusi fluks yang salah . Prediksi dari model genom skala akan menjadi lebih akurat dengan perbaikan lanjutan dari rekonstruksi , misalnya , menambahkan asosiasi - reaksi gen .

Model jaringan meiosis spesifik adalah kunci untuk memanipulasi reaksi atau gen untuk menentukan kontribusi mereka terhadap metabolisme sel . Kami menghapus setiap gen dalam jaringan untuk mempelajari efek dari KO . Ini pada gangguan silico menunjukkan enzim tertentu yang penting untuk sporulasi , memungkinkan untuk prediksi novel gen sporulasi -kekurangan yang belum diidentifikasi oleh layar tinggi -throughput [ 57 ] , [ 58 ] , [ 59 ] , [ 60 ] . Kami telah menggunakan metrik - kuantitatif z -score - untuk memprioritaskan enzim diprediksi dan diverifikasi beberapa kandidat berdasarkan literatur [ 52 ] , [ 62 ] , [ 63 ] , [ 64 ] , [ 65 ] .

Singkatnya , penelitian ini memberikan pengetahuan tentang mekanisme metabolisme mendalam selama meiosis ragi . Selanjutnya , model jaringan - meiosis spesifik menawarkan kerangka teoritis untuk menyelidiki kontribusi dari enzim dan reaksi terhadap fenotip sporulasi . Model ini kuat sehubungan dengan tampil dalam percobaan silico pada setiap reaksi atau beberapa reaksi secara bersamaan , atau over- ekspresi , knockdown , atau KO dari setiap enzim atau kombinasi dari beberapa enzim . Analisis tersebut akan memberikan wawasan ke dalam mesin metabolisme ragi meiosis , dan dapat membuka jalan baru untuk jalur teknik untuk meningkatkan efisiensi sporulasi .

Bahan dan Metode

Pembangunan jaringan metabolik - meiosis tertentu dalam ragi

Kami secara manual membangun jaringan metabolik - meiosis tertentu dengan termasuk reaksi dikenal aktif selama meiosis ragi . Jaringan ini terdiri dari jalur yang terlibat dalam penyerapan asetat dari lingkungan eksternal , penggunaan acetate untuk sintesis karbohidrat , asam amino , nukleotida , dan lipid , dan , kemudian , pemecahan karbohidrat yang tersimpan [ 8 ] , [ 9 ] , [ 10 ] , [ 11 ] , [ 12 ] , [ 13 ] , [ 14 ] , [ 15 ] . Reaksi dan enzim terkait yang diperoleh dari database KEGG , Database Saccharomyces Genome , iMM904 , dan Yeast4.0 [ 28 ] , [ 29 ] , [ 31 ] , [ 32 ] . Reaksi yang terkotak baik dalam sitoplasma atau mitokondria , berdasarkan lokalisasi sub - seluler enzim ditentukan oleh bukti eksperimental [ 33 ] , [ 34 ] , [ 35 ] , [ 36 ] , [ 37 ] , [ 38 ] , [ 39 ] , [ 40 ] , [ 41 ] , [ 42 ] , [ 43 ] , [ 44 ] , [ 45 ] , [ 46 ] , [ 47 ] , [ 48 ] , [ 49 ] , [ 50 ] , [ 51 ] , [ 52 ] , [ 53 ] , [ 54 ] . Reaksi transportasi melintasi membran sel atau mitokondria termasuk dalam jaringan juga. Semua reaksi

searah , reaksi reversibel direpresentasikan sebagai dua reaksi searah . Kofaktor dan produk akhir tidak termasuk sebagai metabolit dalam jaringan : ATP , ADP , AMP , GTP , GDP , UTP , UDP , NAD , NADH , NADP , NADPH , FAD , FADH2 , CO2 , NH4 , H2O , glutamat , glikogen , trehalosa , nukleotida , asam amino , dan lipid . Jaringan metabolik - meiosis spesifik yang dihasilkan terdiri dari 31 metabolit unik dan 62 reaksi biokimia yang unik dikatalisasi oleh enzim 69 unik ( Tabel S1 , Model S1 ) . Jaringan dalam Sistem Biologi Format Markup Language tersedia di database BioModels ( http://www.ebi.ac.uk/biomodels/ , MODEL1303140001 ) .

Kami juga menyelidiki genom skala metabolisme jaringan - iMM904 , yang berisi 1.228 metabolit dan 1.577 reaksi dikatalisis oleh enzim unik 904 [ 28 ] . Untuk mensimulasikan kondisi meiosis menggunakan iMM904 , kami mengizinkan impor asetat dan oksigen dari lingkungan eksternal tetapi menghilangkan asupan glukosa dan amonium