HUBUNGAN ANTARA VISFATIN/FAKTOR PEMACU KOLONI SEL-PRE-

B/NICOTINAMIDE FOSFORIBOSILTRANSFERASE PADA INFLAMASI

JARINGAN ADIPOSE, RESISTENSI INSULIN, DAN LIPID PLASMA

Yi-Cheng Chang, Tien-Jyun Chang, Wei-Jei Lee, Lee-Ming Chuang

Abstrak

Visfatin/factor pemacu koloni sel pre-B (PBEF)/nicotinamide fosforibosiltransferase

(Nampt) telah diusulkan sebagai adipositokine yang menyerupai insulin yang

disekresi terutama dari jaringan adipose visceral (VAT) dan terkait dengan obesitas.

Namun, bukti terbaru menantang usul ini dan justru menunjukan bahwa

visfatin/PBEF/Nampt sebagai sitokin proinflamasi. Hubungan antara ekspresi gen

visfatin/PBEF/Nampt pada jaringan adipose dengan ekspresi gen proinflamasi dan

fenotip metabolic juga diperiksa. Level RNA messanger (mRNA) relative dari

visfatin/PBEF/Nampt, marker spesifik makrofag CD68, dan gen-gen proinflamasi

diukur berbarengan VAT abdominal dan jaringan adipose subkutan (SAT) dan dari

53 orang dewasa non diabetic dengan menggunakan real time PCR kuantitatif. Level

glukosa puasa, insulin, trigliserida, kolesterol, asam urat juga diukur; dan sensitivitas

insulin sistemik diukur dengan tes supresi insulin yang dimodifikasi. Tidak terdapat

perbedaan pada level mRNA visfatin/PBEF/Nampt antara VAT dan SAT, dan juga

tidak ada kaitannya dengan pengukuran obesitas. Level mRNA visfatin/PBEF/Nampt

secara kuat berkaitan dengan ekspresi gen proinflamasi termasuk CD68 dan gen

tumor nekrosis factor-α (TNF-α) di kedua SAT dan VAT. Ekspresi mRNA

visfatin/PBEF/Nampt SAT dan VAT secara positif terkait dengan konsentrasi

glukosa plasma steady-state (kondisi stabil) yang diukur dengan tes supresi insulin

yang dimodifikasi, suatu pengukuran langsung resistensi insulin sistemik

(r=0.42,P=.03 dan r=0.44, P=.03, beruturut-turut). Ekspresi mRNA

visfatin/PBEF/Nampt juga secara positif terkait dengan level trigliserida

(r=0.42,P=.002) dan kolesterol total (r=0.37, P=.009) puasa . Visfatin/PBEF/Nampt

tidak secara dominan disekresi dari VAT dan tidak terkait dengan obesitas. Temuan

kami menunjukan bahwa visfatin/PBEF/Nampt merupakan suatu marker proinflamasi

jaringan adipose yang terkait dengan resistensi insulin sistemik dan hiperlipidemia.

1. Pendahuluan

Penelitian terbaru tentang biologi adiposit telah mengungkap bahwa fungsi

jaringan adipose sebagai suatu organ endokrin yang mampu memproduksi dan

mensekresi beragam factor termasuk asam lemak bebas (FFAs), leptin, adiponektin,

tumor nekrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) dan inhibitor activator

plasminogen-1. Faktor-faktor ini secara nyata mempengaruhi homeostasis metabolic

seluruh tubuh dan berperan dalam pathogenesis resistensi insulin dan atherosclerosis.

Fukuhara et al akhir-akhir ini mengidentifikasi visfatin/PBEF/Nampt sebagai suatu

adipokinase terbaru yang utamanya diekspresikan dan dikeluarkan oleh jaringan

adipose visceral (VAT). Konsentrasi visfatin/PBEF/Nampt plasma dan ekspresi gen

pada VAT berkaitan kuat dengan obesitas. Visfatin/PBEF/Nampt berikatan dan

mengaktivasi reseptor insulin, memperlihatkan efek insulin-mimetik, dan

menurunkan konsentrasi glukosa plasma pada mencit. Penulis juga mengklaim bahwa

visfatin/PBEF/Nampt adalah suatu sitokin derivate adiposit yang disekresi lebih

sering dari VAT, yang terkait dengan obesitas, dan memperlihatkan efek insulin-

mimicking pada jaringan perifer.

Namun, studi-studi selanjutnya gagal untuk mengkonfirmasi bahwa

visfatin/PBEF/Nampt diekspresikan terutama pada VAT. Studi-studi yang

menginvestigasi hubungan ekspresi gen visfatin/PBEF/Nampt pada jaringan adipose

dengan obesitas juga menghasilkan hasil yang tidak sesuai. Selain itu, perhatian

metodologi ditekankan seputar eksperimen yang menunjukan aksi insulin-mimicking

nya. Padahal, sejumlah bukti sekarang menunjukan bahwa visfatin/PBEF/Nampt

terlibat dalam inflamasi dan imunitas bawaan/sejak lahir (innate immunity).

Visfatin/PBEF/Nampt telah ditemukan dikeluarkan dominan dari makrofag dibanding

dari adiposit pada VAT. Ekspresi dari visfatin/PBEF/Nampt ditingkatkan pada

makrofag plak atherosclerosis tak stabil, pada jaringan synovial pasien dengan

arthritis rheumatoid, dan pada neutrofil pasien sepsis. Data yang rancu tersebut

menantang peran visfatin/PBEF/Nampt yang diusulkan dan memunculkan pertanyaan

terkait sumber visfatin/PBEF/Nampt, hubungannya dengan obesitas, dan fungsi

fisiologisnya.

Studi ini bertujuan untuk memeriksa apakah visfatin/PBEF/Nampt secara

dominan diekspresikan pada VAT dan terkait dengan obesitas. Kami selanjutnya

memeriksa hubungan ekspresi gen visfatin/PBEF/Nampt dengan marker spesifik

makrofag CD68 dan ekspresi gen proinflamasi pada jaringan adipose manusia.

Hubungan ekspresi gen visfatin/PBEF/Nampt pada jaringan adipose dengan

homeostasis glucose dan metabolism lipid juga diinvestigasi.

2. Metode dan subjek

2.1. Subjek

Lima puluh tiga subjek Taiwan nondiabetik (44 wanita dan 9 pria) berusia 19

sampai 59 tahun direkrut. Biopsi dilakukan pada VAT dan SAT abdominal pada

kondisi puasa dan selama operasi abdominal elektif baik karena myoma uteri

jinak atau karena pembedahan bariatric. Semua medikasi dihentikan sebelum

studi dilakukan. Level glukosa plasma, total kolesterol, kolesterol lipoprotein

densitas tinggi (HDL-C), trigliserida, dan asam urat puasa dianalisis dengan

automatic analyzer (Hitachi 7250 special;Hitachi, Tokyo, Jepang). Level insulin

serum ditentukan dengan mikropartikel enzim immunoassay dengan

menggunakan sistem AxSYM dari Abbott Diagnostics (Abbott Laboratories,

Dainabot, Tokyo, Jepang). Penilaian model homeostasis resistensi insulin

(HOMA-IR) dihitung dari produk konsentrasi insulin puasa (dalam mikronit per

liter) dan glukosa plasma (dalam milimoles per liter) dibagi dengan 22.5.

Penilaian model homeostasis fungsi sel-β (HOMA-β) dihitung dengan 20 X

insulin puasa (dalam mikrounit per milliliter)/glukosa plasma puasa (dalam

milimoles per liter) – 3.5]. Obesitas ditentukan dengan menentukan indeks masa

tubuh paling tidak 30 kg/m2. Informe consent didapat dari tiap pasien. Studi ini

disetujui oleh badan etika Rumah sakit universitas national Taiwan.

2.2 Tes supresi insulin yang dimodifikasi

Kami mengukur sensitivitas insulin pada 24 subjek (20 wanita dan 4 pria) dari

55 subjek studi dengan menggunakan tes supresi insulin yang dimodifikasi.

Singkatnya, setelah puasa semalaman, suatu kateter vena dipasang pada masing-

masing lengan subjek. Satu lengan digunakan untuk infusan octreotide (0.5 µg

min-1 diawali dengan bolus 25-µg), insulin (25 mU m2min-1) dan glukosa (240

mg m2min-1) selama 180 menit. Konsentrasi glukosa plasma steady state (SSPGs)

diukur 150 sampai 180 menit setelah infusan. Konsentrasi glukosa plasma steady

state memberikan pengukuran langsung kemampuan insulin untuk memediasi

penyingkiran glukosa yang diinfuskan.

2.3 Ekstraksi dan reverse transcription RNA jaringan adipose

Jaringan adipose segera ditempatkan dalam cairan nitrogen setelah reseksi dan

disimpan dalam suhu -80oC sampai akan diproses. RNA total diekstrak dengan

menggunakan REzol (Promega, Madison, WI) sesuai petunjuk pabrik. Reverse

transcription dikerjakan dengan menggunakan kit reverse transctiption

(Promega) dengan 1µg RNA total dan 0.5 µg hexamer acak dalam konsentrasi

akhir 25 µL yang mengandung 200 U enzim reverse transcriptase virus leukemia

murine Maloney, 20 nmol/L dNTP, dan 25 U rRNasin (Promega, Medison, WI)

selama 1 jam dalam suhu 37oC. Hasil reaksi (mixture) didilusikan sampai 100 µL

dengan air yang distilasi double (double-distilled water) sebelum amplifikasi

polymerase chain reaction (PCR).

2.4 Pengukuran level messenger RNA dengan menggunakan PCR real time

5-µL sample DNA komplementer yang didilusikan ditambahkan ke mixture

12.55 µL 2x TaqMan Master Mix Buffer dan 1.25 µL 20x mix probe/primer ,

assay yang mengandung primer spesifik gen yang belum dikembangkan (pre-

developed gene) dan probe-probe dalam volume akhir 25 µL (Applied

Biosystems, Foster City, CA). Primer-primer dan probe-probe yang digunakan

adalah Hs00154355_m1 untuk CD68, Hs00237184_m1 untuk

visfatin/PBEF/Nampt, Hs00174128_m1 untuk TNF-α, Hs000174097_m1 untuk

interleukin-1β (IL-1β), Hs00174131_m1 untuk IL-6, dan Hs0018168_m1 untuk

β-actin (Applied Biosystem).

PCR real time kuantitatif dianalisis dengan ABI PRISM 7000 Sequence

Detection System (TaqMan, Perkin-Elmer Applied Biosystem). Sinyal flouresens

dari masing-masing reaksi PCR dikumpulkan sebagai suatu nilai peak-

normalized yang diplotkan berkebalikan dengan nomer siklus. Reaksi dicirikan

dengan membandingkan nilai threshold cycle (Ct), yang merupakan angka yang

tak berunit (unitless) yang ditentukan sebagai nomer siklus dimana sinyal

flouresens sampel yang dinormalisasi melalui threshold yang ditetapkan diatas

baseline. Sampel-sampel dengan copy number DNA komplementari permulaan

yang tinggi memperlihatkan peningkatan flouresens lebih awal dalam proses

PCR, yang menyebabkan nomer Ct yang lebih rendah. Metode Ct komparatif

yang menyingkirkan perlunya kurva standar digunakan dan dihitung sebagai nilai

Ct gen target dikurangi (minus) nilai Ct β-actin. Ekspresi gen relative dalam

hubungannya terhadap β-actin dihitung dengan menggunakan formula 2-∆Ct.

2.5 Analisis statistic

Hasil diekspresikan sebagai rata-rata ± standar deviasi (SD). Data yang tak

terdistribusi secara normal termasuk BMI, lingkar pinggang, level trigliserida

plasma, glukosa, konsentrasi insulin, HOMA-IR, HOMA-β, dan level mRNA

relative ditransform secara logaritmik ke dalam distribusi normal sebelum

analisis. Perbedaan antara VAT dan SAT dinilai dengan menggunakan tes t

paired. Hubungan Pearson digunakan untuk menilai konsentrasi antara ekspresi

gen dan variable fenotipik metabolic. Analisis-analisis statistic dilakukan dengan

menggunakan STATA 10 (Stata, College station, TX) dan Graph Prism 5

(GraphPad Software, La Jolla, CA). Hipotesisi null ditolak bila nilai P adalah

<.05.

3. Hasil

3.1 Perbedaan pada level mRNA visfatin/PBEF/Nampt antara VAT dan SAT

Kharakteristik partisipan studi berdasarkan status obesitas dan jenis kelamin

dirangkum pada table 1. Tidak terdapat perbedaan pada level mRNA

visfatin/PBEF/Nampt antara SAT dan VAT (P=.25, gbr. 1A). Level mRNA

visfatin/PBEF/Nampt VAT atau SAT tidak berbeda antara subjek non-obese dan

obese (P=.74, dan .84, gbr.1B). Hasil ini serupa pada subgroup wanita (data tidak

ditunjukan). Kami menemukan tidak ada perbedaan pada level mRNA

visfatin/PBEF/Nampt antara subjek pria dan wanita baik pada VAT (P=.31) atau

SAT (P=.72) (gbr. 1C).

3.2 Hubungan antara visfatin/PBEF/Nampt dan ekspresi gen pada jaringan adipose

manusia.

Level mRNA visfatin/PBEF/Nampt secara kuat terkait dengan marker spesifik

makrofag CD68 dan level mRNA TNF-α pada kedua SAT dan VAT (Gbr. 2A-D).

Namun, hubungan antara visfatin/PBEF/Nampt dan level mRNA IL-6 hanya sedikit

signifikan pada VAT (r=0.47, P=.05, Gbr.2E) dan tidak signifikan pada SAT

(r=0.32, P=.05, Gbr 2F). Hubungan antara visfatin/PBEF/Nampt dan level mRNA

IL-1β juga tidak signifikan baik pada VAT (r= 0.33, P = .20) maupun SAT (r =0.15,

P = .57). Hasil ini sama pada subgroup wanita kecuali untuk hubungan tak signifikan

antara visfatin/PBEF/Nampt dan ekspresi gen IL-6 pada VAT (data tidak

ditunjukan).

3.3 Hubungan antara level mRNA visfatin/PBEF/Nampt pada jaringan adipose

manusia dan fenotip metabolic

Hubungan antara level mRNA visfatin/PBEF/Nampt pada jaringan adipose

manusia dan fenotip metabolic dirangkum pada table 2. Kedua level mRNA

visfatin/PBEF/Nampt VAT dan SAT tidak terkait dengan pengukuran obesitas

termasuk BMI, lingkar pinggang (table 2). Level mRNA visfatin/PBEF/Nampt

secara positif berhubungan dengan SSPG yang diukur dengan tes supresi insulin

yang dimodifikasi, suatu pengukuran langsung resistensi insulin baik pada VAT (r=

0.42, P = .03, Tabel 2, Gbr. 3A) dan SAT (r = 0.44, P = .03, Table 2, Fig 3B). Level

mRNA visfatin/PBEF/Nampt secara positif juga berhubungan dengan level

trigliserida plasma (r = 0.42, P = .002, Table 2, Gbr. 3C) dan level kolesterol total

puasa (r = 0.37, P = .009, Table 2, Gbr. 3D). Hasil-hasil ini serupa pada subgroup

wanita (table tambahan table 1).

Tabel 1 Kharakteristik partisipan studi yang distratifikasi oleh status obesitas dan

jenis kelamin

Gbr. 1.A. Perbandingan level mRNA visfatin antara VAT dan SAT pada semua

subjek, B, perbandingan level mRNA visfatin antara VAT dan SAT subjek non-

obese dan obese, C, Perbandingan antara level mRNA visfatin VAT dan SAT antara

subjek laki-laki dan wanita. Data ditunjukan sebagai rata-rata±SD.

Gbr 2. Perbandingan antara level mRNA visfatin dan CD68 pada (A) VAT dan (B)

SAT. Hubungan antara level mRNA visfatin dan TNF-α pada (C) VAT dan (D)

SAT. Hubungan antara level mRNA visfatin dan IL-6 pada (E) VAT dan (F) SAT.

Tabel 2 Hubungan ekspresi mRNA visfatin VAT dan SAT dengan fenotip metabolic

Hubungan koefisiensi (r) dan nilai P diperlihatkan. Data ditampilkan sebagai rata-

rata±SD. *P<.05

4. Diskusi

Fukuhara et al awalnya mengidentifikasi visfatin/PBEF/Nampt sebagai suatu

adipositokin baru yang diekpresikan pada level yang lebih tinggi pada VAT

dibanding SAT dan secara kuat berkaitan dengan obesitas pada manusia. Namun,

tidak ada perbedaan pada ekspresi gen visfatin/PBEF/Nampt antara SAT dan VAT

yang ditemukan pada studi ini, yang mana sesuai dengan kebanyakan laporan-laporan

sebelumnya. Selain itu, ekspresi visfatin/PBEF/Nampt tidak terkait dengan

pengukuran obesitas baik pada SAT atau VAT. Sesuai dengan temuan kami, Berndt

et al menemukan tidak ada hubungan antara ekspresi visfatin/PBEF/Nampt dan BMI

pada wanita. Hanya hubungan yang lemah antara ekspresi visfatin/PBEF/Nampt VAT

dan BMI (r2 = 0.09) diobservasi pada laki-laki. Namun, Pagano et al melaporkan

hubungan yang sebaliknya antara ekspresi visfatin/PBEF/Nampt SAT gluteal dan

BMI, tidak ada hubungan antara ekspresi visfatin/PBEF/Nampt SAT abdominal dan

BMI, dan suatu hubungan positif antara ekspresi visfatin/PBEF/Nampt VAT

abdominal dan BMI. Varma et al melaporkan bahwa ekspresi visfatin/PBEF/Nampt

VAT secara positif berkaitan dengan BMI, padahal ekspresi visfatin/PBEF/Nampt

SAT secara negative berkaitan dengan BMI. Kontroversi ini mungkin dijelaskan

sebagian oleh populasi studi yang relative kecil dan sumber sample yang

heterogenous. Oleh karena itu, bukti terbaru tidak mendukung pernyataan bahwa

visfatin/PBEF/Nampt secara utama diekpresikan pada VAT. Hubungan ekspresi gen

visfatin/PBEF/Nampt dengan obesitas masih controversial.

Temuan utama studi ini adalah hubungan yang kuat antara

visfatin/PBEF/Nampt dan ekspresi gen spesifik makrofag CD68 dan TNF-α pada

jaringan adipose manusia. Mendukung temuan ini, Varma et al memperlihatkan

bahwa ekspresi visfatin/PBEF/Nampt pada fraksi stroma vascular lebih tinggi

dibanding pada fraksi jaringan adipose. Penelitian terakhir juga memperlihatkan

bahwa visfatin/PBEF/Nampt dikeluarkan utamanya dari makrofag daripada dari

adiposity pada VAT. Visfatin/PBEF/Nampt meningkatkan ekspresi gen inflamasi

(TNF-α, interleukin-8, IL-6) pada monosit. Inhibisi farmakologis

visfatin/PBEF/Nampt mengurangi sekresi sitokin inflamasi seperti TNF-α, IL-6, dan

IL-1β baik pada in vivo maupun in vitro. Temuan-temuan ini menunjukan bahwa

visfatin/PBEF/Nampt merupakan suatu marker proinflamasi dari kumpulan makrofag

pada jaringan adipose manusia.

Gbr 3. Hubungan antara level mRNA visfatin dengan SSPG selama tes supresi

insulin yang dimodifikasi pada VAT (A) dan SAT (B). Hubungan antara level mRNA

visfatin VAT dengan level trigliserida puasa (C) dan level kolesterol total (D).

Kami menemukan hubungan signfikan dari level mRNA

visfatin/PBEF/Nampt pada SAT dan VAT dengan resistensi insulin sistemik. Sesuai

dengan temuan kami, level visfatin/PBEF/Nampt yang bersirkulasi ditemukan

meningkat pada pasien dengan diabetes mellitus tipe 2, wanita-wanita dengan

sindrom ovarii polikistik atau diabetes gestasional, dan pasien-pasien dengan sindrom

metabolic. Resistensi insulin diketahui sebagai suatu keadaan inflamasi derajat ringan

yang terkait dengan infiltrasi makrofag pada jaringan adipose. Oleh karena itu,

hubungan positif visfatin/PBEF/Nampt dengan resistensi insulin dapat dimediasi

melalui peningkatan inflamasi jaringan adipose.

Oleh karena itu, kami menemukan hubungan positif antara level mRNA

visfatin/PBEF/Nampt VAT dan level trigliserida plasma dan level kolesterol total.

Sesuai dengan temuan kami, konsentrasi visfatin/PBEF/Nampt yang bersirkulasi

ditemukan secara positif terkait dengan level trigliserida plasma pada anak-anak

obese dan laki-laki muda sehat dan dengan level LDL-C pada pasien-pasien dengan

syndrome metabolic. Mekanisme molecular yang mendasari hubungan ini saat ini

tidak diketahui. Dimungkinkan bahwa ekspresi visfatin/PBEF/Nampt menginduksi

inflamasi jaringan adipose, yang meningkatkan lipolisis pada jaringan adipose dan

aliran(Flux) FFA ke hepar. Di hepar, peningkatan flux FFA memacu produksi

lipoprotein densitas sangat rendah, yang mempertinggi trigliserida plasma dan total

kolesterol. Alasan kenapa hubungan antara level mRNA visfatin/PBEF/Nampt dan

peningkatan level lipid diobservasi hanya pada VAT masih belum jelas. Namun,

VAT telah diperlihatkan jauh lebih aktif secara lipolitik dibanding SAT; dan FFA

yang dikeluarkan dari VAT secara langsung dihantarkan ke vena porta. Pada studi

epidemiologi, VAT berkaitan lebih kuat dengan metabolism lipoprotein abnormal

dibanding SAT. Data-data ini menyediakan kemungkinan penjelasan hubungan lebih

dekat dari level mRNA visfatin/PBEF/Nampt VAT dengan hiperlipidemia.

Studi ini memiliki beberapa keterbatasan. Pertama, ini adalah studi

observasional cross-sectional. Studi fungsional lebih lanjut diperlukan untuk

memperjelas mekanisme yang mendasari. Kedua, populasi studi direkrut dari pasien-

pasien yang menjalani operasi myoma uteri jinak atau pembedahan bariatric dan

terutama terdiri dari subjek obese. Sehingga, hasilnya tidak dapat secara langsung di-

ektrapolasi ke populasi umum. Ketiga, kami tidak mengukur konsentrasi

visfatin/PBEF/nampt plasma atau sitokin-sitokin proinflamasi lainnya; dan hubungan

mereka dengan ekspresi gen visfatin/PBEF/Nampt pada jaringan adipose dan fenotip

metabolic tidak dapat dieksplorasi selanjutnya. Terakhir, kami tidak secara langsung

mengukur ekspresi gen visfatin/PBEF/Nampt pada fraksi adiposelular dan stroma

vascular jaringan adipose manusia. Oleh karenanya, bukti langsung terkait sumber

ekspresi visfatin/PBEF/Nampt pada jaringan adipose tidak didapatkan.

Ringkasnya, studi ini memperlihatkan bahwa visfatin/PBEF/Nampt tidak

diekspresikan secara dominan pada VAT dan tidak terkait dengan obesitas. Ekspresi

gen visfatin/PBEF/nampt secara kuat dan positif terkait dengan ekspresi CD68, suatu

marker spesifik makrofag dan ekspresi gen proinflamasi pada jaringan adipose

manusia. Ekspresi gen visfatin/PBEF/Nampt pada jaringan adipose terkait dengan

resistensi insulin sistemik yang meningkat dan peningkatan level trigliseride plasma

dan kolesterol total. Temuan-temuan ini menunjukan visfatin/PBEF/nampt

merupakan suatu marker proinflamasi jaringan adipose yang terkait dengan resistensi

insulin dan hiperlipidemia.