PERCOBAAN(Brine Shrimp Lethality Test)I. TUJUAN PRAKTIKUM1. Terampil dalam melakukan uji toksisitas akut dengan menggunakan metode BSLT2. Mengetahui cara perhitungan LC50 dengan metode BSLT3. Mampu melaksanakan pengujian toksisitas secara in vitro dengan menggunakan metode BSLT4. Mampu menetapkan LC50 sebagai parameter ketoksisan akut berdasarkan analisa probit.

II. TINJAUAN PUSTAKASenyawa yang diduga memiliki aktifitas anti kanker, harus di ujikan terlebih dahulu pada hewan percobaan. Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dengan menggunakan larva udang Artemia salina Leach sebagai hewan uji merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa antikanker baru yang berasal dari tanaman. Hasil uji toksisitas dengan metode ini telah terbukti memiliki korelasi dengan daya sitotoksis senyawa anti kanker. Selain itu, metode ini juga mudah dikerjakan, murah, cepat dan cukup akurat (Meyer, 1982). Lebih dari itu uji larva udang ini juga digunakan untuk praskrining terhadap senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antitumor. Dengan kata lain, uji ini mempunyai korelasi yang positif dengan potensinya sebagai antikanker (Anderson, 1991).Artemia salina Leach merupakan komponen dari invertebrata dari fauna pada ekosistem perairan laut. Udang renik ini mempunyai peranan yang penting dalam aliran energi dan rantai makanan. Spesies invertebrata ini umumnya digunakan sebagai organisme sentinel sejati berdasarkan pada penyebaran, fasilitas sampling, dan luasnya karakteristik ekologi dan sensifitasnya terhadap bahan kimia (Calleja M.C, Persoone G, 1992).Pengujian Lethalitas telah digunakan dengan sukses untuk isolasi biomonitor dari cytotoxic (Siqueira, M. J et. al., 1998), antimalaria (Perez, H, et.al., 1997), insektisida (Oberlies, N. H.,et.al., 1998), dan antifeedent (Labbe, C., et.al., 1993) campuran dari ektrak tumbuhan. Hasil dari skrening dari air, hydroalcoholic dan ekstrak alkohol dari beberapa tumbuhan obat penting yang digunakan dalam pengobatan tradisional untuk lethalitas merujuk pada larva Artemia salina yangdiperkenalkan.Suatu konsentrasi mematikan (Lethal Concentration) adalah analisa secara statistik yang menggunakan uji Whole Effluent Toxicity (WET) untuk menaksir lethalitas sampel effluen. Test akut digunakan di Wisconsin untuk menaksir kondisi "akhir dari pipa" (yaitu, effluent yang tidak dilemahkan, sebagai adanya dibebaskan pada lingkungan).Konsentrasi effluen dimana 50% dari organisme mati selama test (LC50) digunakan sebagai pemenuhan titik akhir (endpoint) untuk Test Whole Effluent Toxicity (WET) akut. Dalam rangka mengkalkulasi LC50, salah satu dari konsentrasi test harus menyebabkan > 50% kematian. LC50, yang lebih rendah berarti semakin beracun effluent tersebut. Sebagai contoh, LC50 > 100% berarti kekuatan penuh effluent tersebut tidak membunuh lebih dari separuh organisme. LC50 sama dengan 50% berarti separuh effluent mempunyai kekuatan membunuh 50% dari organisme tersebut. Uji toksisitas dimaksudkan untuk memaparkan adanya efek toksik dan atau menilai batas keamanan dalam kaitannya dengan penggunaan suatu senyawa. Pengukuran toksisitas dapat ditentukan secara kuantitatif yang menyatakan tingkat keamanan dan tingkat berbahaya zat tersebut (Cassaret dan Doulls, 1975). Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan salah satu metode skrining untuk menentukan ketoksikan suatu ekstrak ataupun senyawa. Kematian Artemia salina Leach digunakan sebaga i parameter untuk menunjukkan adanya kandunganzat aktif tanaman yang bersifat sitotoksik. Apabila harga LC50 _ 1000 g/mL ekstrak tersebut dapat dikatakan toksik. Bila kematian sebagai responnya, maka dosis penimbul kematian pada 50% populasi dengan spesies yang sama dalam waktu spesifik dan kondisi percobaan sesuai diistilahkan sebagai median lethal dose atau LD50. Obat yang diberikan sebagai konsentrasi diistilahkan sebagai Median Lethal Concetration atau LC50 (Cassaret dan Doulls, 1975). Menurut Meyer dkk. (1982) tingkat toksisitas dari ekstrak tanaman dapat ditentukan dengan melihat harga LC50-nya. Apabila harga LC50 lebih kecil dari 1000 g/ml dikatakan toksik, sebaliknya apabila harga LC50 lebih besar dari 1000 g/ml dikatakan tidak toksik. Tingkat toksisitas tersebut akan memberi makna terhadap potensi aktivitasnya sebagai antitumor. Semakin kecil harga LC50 semakin toksik suatu senyawa.KLASIFIKASI Artemia salina, Leacha. KlasifikasiArtemia salina Leach adalah udang tingkat rendah yang hidup sebagai zooplankton. Artemia pada tahun 1778 diber i nama cancer salinus,yang kemudian diubah menjadi Artemia salina pada tahun 1819 oleh Leach

Larva udang artemiaKlasifikasi Artemia pada dunia hewan adalah sebagai berikut :Divisi : AnimalPhylum : ArthropodaKelas : CrustaceaeSubkelas : BranchiopodaOrdo : AnostracaFamilia: ArthemidaeGenus : ArtemiaSpecies : Artemia salina Leach( Mudjiman, 1995)

Tahap penetasan telur Artemia Salinab. Morfologi Artemia salina, LeachArtemia salina, Leach diperdagangkan dalam bentuk telur istirahat yang dinamakan kista. Kista ini bentuk bulatan-bulatan kecil berwarna kelabu kecoklatan dengan diameter berkisar 200-300 m (Mudjiman,1995). Kista berkualitas baik, apabila diinkubasi dalam air berkadar garam 5-70 permil akan menetas sekitar 18-24 jam. Artemia yang baru menetas disebut nauplius, berwarna orange, berbentuk bulat lonjong dengan panjang sekitar 400 mikron, lebar 170 mikron dan berat 0,002 mg. Nauplius berangsur angsur mengalami perkembangan dan perubahan morfologis dengan 15 kali pergantian kulit hingga menjadi dewasa. Pada setiap pergantian kulit dis ebut instar (Mujiman, 1995). Ada beberapa tahap penetasan Artemia yaitu tahap hidrasi, tahap pecah cangkang, dan tahap payung atau tahap pengeluaran. Tahap hidrasi terjadi penyerapan air sehingga kista yang diawetkan dalam bentuk kering tersebut akan menjadi bulat dan aktif bermetabolisme. Tahap selanjutnya adalah tahap pecah cangkang dan disusul dengan tahap payung yang terjadi beberapa saat sebelum nauplius keluar dari cangkang (Isnansetyo dan Kurniastuty, 1995). Artemia dewasa biasanya berukuran panjang 1-2 cm yang ditandai adanya tangkai mata yang jelas terlihat pada kedua sisi bagian kepala, antena sebagai alat sensori, saluran pencernaan yang terlihat jelas, dan 11 pasang thorakopoda. Pada Artemia jantan, antena berubah menjadi alat penjepit, sepasang penis terdapat dibagian belakang tubuh, sedangkan pada Artemia betina antena mengalami penyusutan. Sepasang indung telur atau ovarium terdapat di kedua sisi saluran pencernaan, dibelakang thorakopoda (Mujiman,1995).

Morfologi telur Artemia Salina(Mujiman, 1995)c. Lingkungan hidupArtemia salina hidup planktonik di perairan berkadar garam tinggi antara 15-30 permil, suhu yang dikehendaki berkisar antara 25C-30C, oksigen terlarut sekitar 3 mg/L dan pH antara 7,3-8,4. Artemia salina, Leach tidak dapat mempertahankan diri dari pemangsa musuh- musuhnya karena tidak mempunyai alat atau cara untuk membela diri, salah satu cara untuk menghindarkan diri dari pemangsa hewan lain dengan berpindah kekondisi alam berupa lingkungan hidup berkadar garam tinggi. Pada umumnya pemangsa tidak dapat hidup lagi pada kondisi itu (Mudjiman,1995). Makanan Artemia salina terdiri atas ganggang renik, bakteri dan cendawan. Dalam pemeliharaan makanan yang diberikan adalah katul padi, tepung terigu, tepung kedelai, dan ragi (Mudjiman,1995).d. Perkembangbiakan dan siklus hidupPerkembangbiakannya yaitu jenis biseksual dan jenis partenogenenetik Keduanya dapat terjadi ovovivipar atau ovipar. Pada ovovivipar keluar dari induknya sudah berupa anak yang dinamakan nauplius, sedangkan pada ovipar anak keluar dari induknya berupa telur, bercangkang tebal yang dinamakan siste. Perkembangbiakan jenis biseksual harus melalui proses perkawinan antara induk jantan dengan induk betina. Pada jenis parthenogenesis tidak ada perkawinan karena memang tidak pernah ada jantannya. Jadi, betina akan beranak dengan sendirinya tanpa perkawinan (Mudjiman,1995). Siklus hidup Artemia salina seperti pada gambar 3.

Siklus Hidup Artemia salina Leach (Mudjiman,1995)e. Penetasan telur Artemia salina LeachTelur yang siap menetas berwarna coklat keabu-abuan. Untuk media penetasan dapat digunakan air laut biasa (kadar garam 30 permil). Tapi untuk mencapai hasil penetasan yang lebih baik, kita perlu menggunakan air berkadar garam 5 permil. Ini dapat dibuat dengan mengencerkan air laut dengan air tawar. Sebelum ditetaskan telur-telur tersebut perlu dicuci terlebih dahulu, yakni dengan direndam di dalam air tawar selama 1 jam, baru kemudian dimasukane. Penetasan telur Artemia salina LeachTelur yang siap menetas berwarna coklat keabu-abuan. Untuk media penetasan dapat digunakan air laut biasa (kadar garam 30 permil). Tapi untuk mencapai hasil penetasan yang lebih baik, kita perlu menggunakan air berkadar garam 5 permil. Ini dapat dibuat dengan mengencerkan air laut dengan air tawar. Sebelum ditetaskan telur-telur tersebut perlu dicuci terlebih dahulu, yakni dengan direndam di dalam air tawar selama 1 jam, baru kemudian dimasukan dalam wadah penetasan. Suhu air yang baik selama proses penetasan adalah antara 25-30 C. Sedangkan kadar oksigennya harus lebih dari 2 mg/L. Untuk merangsang proses penetasannya media penetasan tersebut perlu disinari dengan lampu yang dipasang di samping wadah. Dalam waktu 24-36 jam setelah pemasukan telur, biasanya telur-telur itu sudah menetas menjadi anak Artemia yang dinamakan nauplius (Mudjiman,1995).f. Penggunaan Artemia salina Leach dalam penelitianSuatu metode uji hayati yang tepat dan murah untuk skrining dalam menentukan toksisitas suatu ekstrak tanaman aktif dengan menggunakan hewan uji Artemia salina Leach. Artemia sebe lumnya telah digunakan dalam bermacammacam uji hayati seperti uji pestisida, polutan, mikotoksin, anestetik, komponen seperti morfin, kekarsinogenikan dan toksikan dalam air laut. Uji dengan organisme ini sesuai untuk aktifitas farmakologi dalam ekstrak tanaman yang bersifat toksik. Penelitian menggunakan Artemia salina memiliki beberapa keuntungan antara lain cepat, mudah, murah dan sederhana. Penelitian dengan larva Artemia salina Leach telah digunakan oleh Pusat Kanker Purdue, Universitas Purdue di Lafayette untuk senyawa aktif tanaman secara umum dan tidak spesifik untuk zat anti kanker. Namun demikian hubungan yang signifikan dari sampel yang bersifat toksik terhadap larva Artemia salina Leach ternyata juga mempunyai aktifitas sitotoksik. Berdasarkan hal tersebut maka larva Artemia salina Leach dapat digunakan untuk uji toksisitas (Meyer et al., cit Wahyuni,S.,2002).III. METODE KERJAa. ALAT Vial Kotak penetasan larva Pipet mikro Hair dryer Pipet tetesb. BAHAN Air laut Air suling Telur udang Artemia salina Leach Larutan dimetilsulfoksida Methanol Ekstrak obat Xc. CARA KERJA1. Ambil ekstrak obat X pada kosentrasi 1000 mikrogram/ml sebanyak 0,5 ml masukkan kedalam vial.2. Ekstrak yang terdapat didalam vial diuapkan dengan menggunakan hair dryer. 3. Setelah menguap, tambahkan larutan Dimetilsulfoksida sebanyak 50 mikroliter lalu tambahkan air laut sedikit saja.4. Masukkan 10 ekor larva udang ke dalam vial dan adkan dengan menggunakan air laut hingga tanda batas kalibrasi.5. Amati larva yang mati setelah 24 jam.6. Hitung nilai LC50

IV. HASIL DAN PEMBAHASANa. HASIL PENGAMATANKELKONSENTRASILARUTAN INDUKKONSENTRASILARUTANSAMPELJUMLAH LARVAJUMLAHLARVA MATI% KEMATIAN&RAT-RATANILAI PROBITLOGKONSETRASI

1.10000 g/ml1000 g/ml1098890 %80 %80 %83 %5,9543

210000 g/ml1000 g/ml1099890 %90 %80 %86,6 %6,1753

31000 g/ml100 g/ml1054550 %40 %50 %46,6 %4,9502

41000 g/ml100 g/ml1043440 %30 %40 %36 ,6 %4,6682

5100 g/ml10 g/ml1021120 %10 %10 %13,3 %3,8741

6100 g/ml10 g/ml1010110 %0 %10 %6,6 %3,5241

Hasil Perhitungan Pengamatan kelompok

Persamaan Linier :y = 1.325x + 2.138Jadi, y = 1.325x + 2.1385 = 1.325x + 2.1385 - 2.138 = 1.325xX = 2.16Log X = 2.16Antilog X = 144.543 ug/ml

b. PEMBAHASAN

Kanker adalah segolongan penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel yang tidak terkendali dan kemampuan sel-sel tersebut untuk menyerang jaringan biologis lainnya, baik dengan pertumbuhan langsung di jaringan yang bersebelahan (invasi) maupun dengan migrasi sel ke tempat yang jauh (metastasis).Salah satu metode yang digunakan untuk menguji senyawa yang memiliki bioaktivitas sebagai antikanker dari senyawa yang diisolasi adalah Brine shrimp lethality test (BSLT), dimana tujuan dari penggunaan metode ini adalah sebagai uji pendahuluan yang dapat mendukung penemuan senyawa-senyawa antikanker. Senyawa yang diduga memiliki aktivitas anti kanker, harus diujikan terlebih dahulu pada hewan percobaan. Penelitian ini menerapkan metode Brine ShrimpLethality Test (BST) dengan menggunakan larva udang Artemia salina leach sebagai hewan uji. Metode ini merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa anti kanker baru yang berasal dari tanaman.Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) adalah salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Metode ini dapat digunakan sebagai bioassay-guided fractionation dari bahan alam, karena mudah, cepat, murah dan cukup reproducible.Uji toksisitas dengan metode BSLT ini merupakan uji toksisitas akut dimana efek toksik dari suatu senyawa ditentukan dalam waktu singkat, yaitu rentang waktu selama 24 jam setelah pemberian dosis uji. Prosedurnya dengan menentukan nilai LC50 dari aktivitas komponen aktif tanaman terhadap larva Artemia salina Leach. Suatu ekstrak dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika harga LC < 1000 g/ ml. Adapun siklus hidup dari Artemia salina Leach, dimulai dari kista atau telur, kemudian menjadi embrio, embrio ini masih akan melekat pada kulit kista, setelah menjadi embrio dia akan menjadi nauplii, nauplii inilah yang berenang bebas dan memulai hidupnya, dan dalam fase ini mulai mencari makanan untuk dirinya sendiri. Setelah itu menjadi Artemia dewasa, setelah dewasa Artemia jantan dan Artemia betina bertemu dan mengalami perkembang biakan, dan lahirlah kembali kista ataupun telur. Alasan digunakannya larva udang dalam percobaan ini adalah karena larva udang merupakan general biossay sehingga semua zat dapat menembus masuk menembus dinding sel larva tersebut. Biossay adalah suatu pengujian tentang toksisitas pada suatu produk dalam rangka pencarian produk alam yang potensial yang biasanya menggunakan makhluk hidup sebagai sampel. LC50 adalah konsentrasi dari suatu senyawa kimia di udara atau dalam air yang dapat menyebabkan 50% kematian pada suatu populasi hewan uji atau makhluk hidup tertentu. Penggunaan LC50 dimaksudkan untuk pengujian ketoksikan dengan perlakuan terhadap hewan uji secara berkelompok yaitu pada saat hewan uji dipaparkan suatu bahan kimia melalui udara maka hewan uji tersebut akan menghirupnya atau percobaan toksisitas dengan media air. Nilai LC50 dapat digunakan untuk menentukan tingkat efek toksik suatu senyawa sehingga dapat juga untuk memprediksi potensinya sebagai antikanker.Dalam percobaan kali ini digunakan 3 variasi konsentrasi yang berbeda masing-masing konsentrasi 1000,100 dan 10 g/ml untuk membandingkan toksisitas dan efek toksik yang ditimbulkan masing-masing konsentrasi tersebut. Setelah itu, untuk melihat pada konsentrasi berapakah larva udang mengalami LC50. Dan air laut sebagai kontrol dimaksudkan untuk melihat apakah respon kematian dari sampel dan bukan dari laut. Dalam penentuan nilai LC50 ini dapat dilakukan dengan 3 cara/metode, yaitu :1. Perhitungan probit2. analisis Reed-Munch3. analisis FarmakopeDalam perhitungan dengan metode analisis probit, diperlukan tabel probit dan rumus regresi liniear untuk menentukan nilai a, b dan r. Kemudian dimasukkan dalam rumus X50 = (b-a)/b dan kemudian dapat ditentukan nilai LC50. EPA Probit merupakan salah satu metode analisis statistik yang digunakan untuk menghitung besarnya LC50 dengan menggunakan analisis probit. Analisis tersebut diperkenalkan oleh Finney tahun 1971. Metode regresi linear digunakan untuk mendapatkan grafik garis lurus apabila probit kematian ditransformasikan pada log konsentrasi. Konsentrasi yang dapat mengakibatkan kematian 50% populasi hewan diperoleh dengan menarik garis dari 50% probit kematianAdapun hasil perhitungan dengan menggunakan metode ini menunjukkan hasil bahwa LC50 adalah 144.543 ug/ml. sehingga yang menyebabkan kematian setangan dari hewan percobaan adalah pada konsentrasi 144.543 ug/ml yang mana sesuai dengan pemngamatan bahwa pada konsentrasi 100 ug/ml persentase kematian sebesar 46,6 %. Ekstrak yang diujikan ini ternyata mampu mematikan setengah dari hewan percobaan saat konsentrasi yang dibutuhkan kurang dari sama dengan 1000 sehingga ekstrak dapat dikatakan aktif sebagai anti kanker.

V. KESIMPULAN1. Uji BSLT digunakan sebagai uji permulaan untuk mengetahui aktivitas dari suatu zat atau senyawa yang terkandung dalam suatu ekstrak atau suatu isolat murni.2. Pada perbenihan larva udang Artemia salina digunakan air laut buatan yang dibuat dengan menggunakan garam yang tidak mengandung iodium karena bila menggunakan garam yang mengandung iodium maka larva udang akan tumbuh lebih besar dan akan mengaburkan data dari BSLT yang didapat.3. Pada pengujian BSLT dibuat larutan dengan konsentrsi yang berbeda-beda mulau dari 1000,100,dan 10g/ml. Ini bertujuan untuk melihat pengaruh konsentrasi dari ektrak terhadap aktivitasnya(LC50)4. Pada pecobaan dilakukan pengeringan untuk mengeringkan pelarur yang digunakan agar tidak mengaburkan data yang didapat. Apakah larva udang yang mati karena aktivitas dari ekstrak atau palarutnya.5. Pada hasil percobaan didapat LC50 sebesar 144.543 g/ml . 6. Dapat diketahui bahwa ektrak obat X memilki potensi anti kanker karena LC50 nya 1000 g/mL.

VI. DAFTAR PUSTAKA Anonim. 2012. Penuntun Farmakologi dan Toksikologi III. UMI: Makassar. Corwin, Elizabeth J, 2009. Buku Saku Patofisiologi. Penerbit Buku Kedokteran EGC : Jakarta. Gunawan, Sulistia Gan, 2007. Farmakologi dan Terapi Edisi 5. Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran UI. Jakarta. Griffits, E. J. F. , J. H. Miller, D. T. Suzuki., R. G. Lewontin, W. M. Gelbart. 1993. An Introduction to Genetic Analysis 5th ed. W. H. Preeman and Company. New York. Kee, Joyce L. 1996. Farmakologi Pendekatan Proses Keperawatan. EGC: Jakarta. Mangan, Y. 2003. Cara Bijak Menaklukkan Kanker. Agromedia Pustaka Jakarta.