PCR

1. Apa kepanjangan dari PCR? dan Jelaskan pengertiannya!

Reaksi Polimerasi berantai atau dikenal sebagai polymerase chain reaction (PCR) merupakan suatu proses enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara invivo. Metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA sebanyak ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106 - 107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap siklus n siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyakny DNA Target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan ampllifikasi urutan non - target.

Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan biologi molekuler. PCR digunaan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh virus, diagnosis dini penyakit seperti AIDS, profil genetik dalam forensik, aplikasi dalam biodiversitas,evolusi biologi, mutasi gen secara langsung, dan mengukur kuantifikasi ekspresi mRNA di daam sel atau jaringan.

Penemuan awal dari teknik PCR didasarkan pada tiga waterbath yang mempunyai suhu yang berbeda,. Gene Cycler pertama kali dipublikasika pada tahun 1986, akan tetapi DNA Polimerase awal yang digunakan masih belum termostabil, dan harus ditambahkan pada setiap siklusnya. Kelemahan lainnya yaitu pada suhu 370 C yang digunakan bias dan menyebabkan non –spesific primering atau pengenalan pada urutan yang tidak tepat, sehingga menghasilakn produk yang tidak dikehendaki.tag DNA polimerase yang diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) dikembangkan pada tahun 1988. Enzim ini tahan sampai pada suhu 1000C, dan aktivitas maksimalnya berlangsung pada suhu 92 – 950C. Dasar siklus PCR yang utama merupakan siklus berulang 30 – 35 siklus, meliputi :

Denaturasi ( 950C) selama 30 detik. Pada langkah ini, heliks ganda DNA terurai menjadi dua untai cetakan DNA tunggal.Annealing ( 55 - 600 C) selama 30 detik. Pada langkah ini terjadi proses pengenalan/penempelan primer cetakan DNA,suhu annealing ditentukan oleh susunan primer. Optimalisasi suhu annealing dimulai dengan menghitung melting temperature ( Tm ) dari ikatan primer dan cetakan DNA, sedangkan suhu annealing (TA) adalah 5 0 C lebih kecil dari Tm primer yang sebenarnya.Ekstensi ( 720 C ). Pada langkah ini terjadi proses polimerasi untuk pembentukan untai DNA baru Waktu yang dibutuhkan tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang digandakan sebagai produk amplifikasi.

Gambar 1. Siklus PCR

Peningkatan jumlah siklus PCR diatas 35 siklus tidak memberikan efek yang positif. Hal ini ditunjukkan pada gambar berikut :

2. Apa saja macam-macam PCR? dan apa perbedaannya!

Berdasarkan pasangan primer yang digunakan dalam teknik PCR, maka ada dua macam teknik PCR yaitu (1) metode yang menggunakan sepasang primer (primer yang ditempatkan di awal dan di akhir unit transkripsi) dimana primer-primer tersebut sangat spesifik urutannya untuk menyambungkan dirinya dengan segmen DNA; dan (2) metode yang menggunakan primer tunggal (primer yang ditempatkan di awal unit transkripsi atau di akhir unit transkripsi). Metode PCR dengan primer tunggal, meliputi : AP-PCR (Arbitrary Primed PCR), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), serta DAF (DNA Amplification Fingerprinting) yang meliputi proses amplifikasi dari DNA/VNTRs dan Retroposon. Persamaan dari ketiga teknik ini adalah adanya urutan acak dari primer, baik yang bekerja ke arah kanan maupun ke arah kiri dari sejumlah lokus. Perbedaan dari ketiga teknik tersebut terdapat pada panjang-pendeknya primer, dimana untuk AP-PCR sekitar 20 basa nukleotida, RAPD sekitar 10 basa nukleotida dan DAF sekitar 6-8 nukleotida. Hasil visualisasi dari AP-PCR dan RAPD relatif sama, sehingga orang lebih menyukai RAPD karena dengan ukuran primer yang lebih sedikit (~10 basa nukleotida) memberikan hasil yang tidak berbeda dengan AP-PCR yang memiliki ukuran primer lebih besar (~20 basa nukleotida). Metode PCR dengan menggunakan sepasang primer, meliputi : STSs (Sequence-Tagged Sites) dan SCARs (Sequence Characterized Amplified Regions), DALP (Direct Amplification of Length Polymorphism), SSRs (Simple Sequence Repeats), IFLP (Intron Fragment Length Polymorphism), ESTs (Expressed Sequence Tags), RAMP (Random Amplified Microsatellite Polymorphism) dan REMAP (Retroposon-Microsatellite Amplified Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) dan modifikasinya, SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism).

3. Jelaskan prinsip kerja Real Time PCR!

Real-Time PCR merupakan suatu perangkat platform instrumentasi, yang terdiri atas satu buah thermal cycler, satu buah komputer, lensa untuk eksitasi fluoresen dan pengumpul emisi, serta perangkat lunak untuk akuisisi dan analisis data. Setiap perusahaan memroduksi Real-Time PCR dengan standar perangkat platform yang sama, namun berbeda dalam hal kapasitas sampel, metode eksitasi, dan tingkat sensitivitas.

Prinsip kerja Real-Time PCR adalah mendeteksi dan menguantifikasi reporter fluoresen. Sinyal fluoresen akan meningkat seiring dengan bertambahnya produk PCR dalam reaksi. Dengan mencatat jumlah emisi fluoresen pada setiap siklus, reaksi selama fase eksponensial dapat dipantau. Peningkatan produk PCR yang signifikan pada fase eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi gen target. Makin tinggi tingkat ekspresi gen target maka deteksi emisi fluoresen makin cepat terjadi.

Keuntungan dari real-time PCR meliputi:

1) Kemampuan untuk memantau kemajuan Reaksi PCR yang terjadi secara real time2) Kemampuannya tepat untuk mengukur jumlah amplikon pada setiap siklus , yang

memungkinkan akurasi kuantifikasi dari jumlah bahan awal dalam sampel3) Peningkatan rentang dinamis deteksi4) Amplifikasi dan deteksi terjadi dalam satu tabung , menghilangkan pasca - PCR

manipulasi

Gambar 2. Contoh Hasil Prinsip Kerja Real Time PCR4. Jelaskan prinsip kerja Reverse Transkriptase PCR!

Reverse Transcription PCR (RT-PCR) adalah salah satu dari banyak varian teknik

PCR. Teknik ini biasanya digunakan dalam bidang biologi molekuler untuk mendeteksi

tingkat ekspresi RNA. Sering terjadi kesalah pahaman di antara pelajar dan peneliti

dengan definisi RT-PCR ini yang menganggap bahwa RT-PCR adalah Real-Time PCR

(qPCR). Padahal kedua jenis teknik PCR ini sangatlah berbeda. Sementara RT-PCR

digunakan untuk mendeteksi secara kualitatif ekspresi gen melalui penciptaan

komplementer transkrip DNA (cDNA) dari RNA, qPCR digunakan untuk mengukur

secara kuantitatif amplifikasi DNA menggunakan probe ber-fluoresense. RT-PCR pun

berbeda dengan teknik PCR biasa walaupun keduanya sama-sama menghasilkan jutaan

salinan DNA melalui amplifikasi. RT-PCR digunakan untuk mengkloning gen yang

diekspresikan oleh transkripsi RNA target menuju DNA komplemen (cDNA)

menggunakan reverse transcriptase. Kemudian, cDNA baru diamplifikasi menggunakan

PCR biasa.

Sejak diperkenalkan tahun 1977, Northern blot  telah digunakan secara ekstensif

untuk kuantifikasi RNA meskipun dengan berbagai kelemahannya seperti :

Memakan waktu banyak,

Memerlukan sejumlah besar RNA untuk deteksi, dan

Secara kuantitatif tidak akurat untuk RNA dengan konsentrasi rendah

Namun, penemuan reverse transcriptase selama studi replikasi virus dalam acuan

material genetika telah mengarahkan para peneliti dalam pengembangan RT-PCR yang

kemudian menggantikan teknik Northern blot sebagai metode pilihan untuk deteksi RNA

dan kuantifikasi. Teknik RT-PCR telah meningkat menjadi patokan teknologi untuk

deteksi dan/atau perbandingan tingkat RNA untuk beberapa alasan:

Tidak memerlukan proses PCR awal,

Dapat mengukur berbagai rentang kelimpahan RNA (>107 flip/lipatan), dan

Menyediakan data kualitatif dan kuantitatif.

Dalam RT-PCR, template RNA pertama dikonversi ke dalam DNA komplementer

(cDNA) menggunakan suatu reverse transcriptase. cDNA kemudian digunakan sebagai

template untuk amplifikasi secara eksponensial menggunakan PCR biasa. RT-PCR saat

ini merupakan metode/teknik yang paling sensitif dalam deteksi RNA yang tersedia.

Penggunaan RT-PCR untuk deteksi RNA transkrip telah merevolusi studi mengenai

ekspresi gen dalam beberapa pemikiran sebagai berikut :

o Secara teoritis memungkinkan untuk mendeteksi transkrip setiap gen secara praktis

o Memungkinkan amplifikasi dan eliminasi sampel yang diinginkan untuk kebutuhan

akan kelimpahan materi

o Menyediakan toleransi untuk degradasi RNA selama RNA yang mencakup primer

utuh

Gambar 3. Alur Teknik RT – PCR

5. Jelaskan prinsip kerja ELISA!

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang

terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau

antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang

medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk

antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada

suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-

spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh

antibodi lain yang  spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA).

Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk

kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau

dapat dideteksi  secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim

melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen

lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap

pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi

sinyal yang visibel, yang menunjukkan  kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA

yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode-metode terbaru

mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitif.

Aplikasi ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk menentukan konsentrasi  antibodi  dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi adanya antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA  juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.

Beberapa Tipe ELISA

A. Indirect ELISA

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk menentukan konsentrasi antibodi dalam serum adalah:

1) Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar  yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.

2) Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter.  Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

3) Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

4) Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

5) Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan

substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.

6) Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.7) Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal

kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.8) Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/

elektrokimia lainnya.

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

Gambar 4. Mekanisme indirect ELISA

B. Sandwich ELISA Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

1) Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’2) Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir3) Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate4) Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat5) Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan  antigen6) Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan

dengan antibodi primer7) Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang8) Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/

berfluoresensi/ elektrokimia9) Diukur absorbansinya  untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan

lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

Gambar 5. Prinsip kerja sandwich ELISA

C. ELISA kompetitifTahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaitu:

1) Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya2) Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah

dilapisi antigen3) Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam

sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi

4) Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim

5) Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

Gambar 6. Prinsip kerja ELISA kompetitif

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut:

Gambar 7. Prinsip Kerja Elisa Secara Umum