ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI SELULITIK DAN LIPOLITIK DARI 1MB AH PADAT DAN LIMBAH CAIR

1. Bakteri Selulitik

• Alat dan bahan.Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven, autoclaf, cawan petri, jarum ose, vorteks, mikro pipet, erlenmeyer, tabung reaksi, pH meter, Laminar flow, water bath shaker. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Agar CMC , akuades steril, alkohol 70%, kristal violet, aseton alkohol, safranin, Isolat PPKS.• Penyiapan mediaMedia yang dipersiapkan antara lain: Media Agar CMC dan Media cair CMC.Penyiapan medium CMC AgarPenyiapan medium dilakukan dengan menimbang bahan-bahan berikut dengan melarutkannya di dalam 200 ml akuades steril.CMC 1 g/1KH2PO4 0,2 g/1MgSO4 1 g/1Yeast ekstrak 0,4 g/1 • Agar 15 g/1Congo Red 0,5• Inokulasi bakteriSampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah kompos .Langkah yang akan dilakukan dalam isolasi sampel kompos yaitu: dengan membuat media yang menggunakan media agar CMC yang steril. Mengambil 0,1 mL (cair) sampel kompos lalu diencerkan hingga pengenceran 10.000 dan menanamkan ke dalam media dengan pour plate. Lalu diinkubasi selama 2 x 24 jam.

• Karakterisasi morfologi & biokimia isolat. (bentuk, tepi, elevasi, warna, bentuk sel, penataan sel dan gram.Isolat yang memiliki nilai aktivitas hidrolisis dikarakterisasi sifat morfologi dan biokimianya.Karakterisasi sifat morfologi mencakup bentuk sel, penataan sel, dan sifat gram. Pewarnaan gram menggunakan pewarna kristal violet dan safranin untuk menentukan sifat Gram. Pewarnaan gram dapat dilakukan dengan langkah-langkah berikut:Masing-masing isolat dari kultur murni bakteri yang telah berumur 24 jam dibuat sediaan mikroskopiknya, kemudian sediaan digenangi kabol kristal violet. Setelah dibiarkan 3 menit, kelebihan zat warna dibuang dan ditetesi lugol hingga menggenangi sediaan selaama 45-60 detik. Selanjutnya sediaan dimasukkan ke dalam staining jar berisi alkohol 96% , digoyang selama 1 menit lalu bilas dgn akuades dan keringkan dengan kertas hisap. Safranin dituangkan di atas sediaan yang telah kering dan dibiarkan selama 3 menit. Setelah itu di cuci dengan akuades dengan menggunakan botol semprot dan dikeringkan, di beri minyak imersi dan diamati di bawah mikroskop perbesaran 1000 x.

• Pengujian aktivitas

Isolat diinkubasi pada suhu 65°C selama 48 jam. Zona hidrolisis protein semi kuantitatif (nisbi) diukur dengan membandingkan diameter zona bening dengan diameter koloni bakteri

2. Bakteri Lipolitik• Alat dan bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu : cawan petri, tabung reaksi, Erlenmeyer, labu ukur, hot plate, oven, autoklav, laminar flow, water bath shaker. Bahan yang digunakan yaitu sampel mikroba lipolitik dan media cair lipolitik.• Penyiapan mediaMedia yang digunakan yaitu media produksi yaitu media lipolitik cair dengan komposisi per satu liter aquadest yaitu pepton 10 g, NaCl 5 g, CaC12.2H2O 0,1 G, dan tween 80 % 10 ml, dan media penyimpanan bakteri berupa media nutrient agar.

• Inokulasi bakteriIsolate bakteri yang akan diinokulsikan berasal dari batang sawit lapuk dan tanah pinggir kolam ranut. Mengambil 1 mL (cair)/l gram (padat) sampel lalu diencerkan hingga pengenceran 10.000 dan menanamkan ke dalam media dengan pour plate. Lalu diinkubasi selama 2 x 24 jam. Di media penumbuhan ini akan diamati 2 x 24 jam pertumbuhan bakteri lipolitiknya.• Pemisahan dan pemurnian isolat bakteriPemisahan dan pemurnian isolat bakteri dilakukan dengan metoda goresan (streak method). Masing-masing cawan petri pada tiap pengenceram diambil koloni-koloni bakteri yang menampakkan morfologi dan warna yang berbeda. Selanjutnya masing-masing koloni bakteri tersebut digoreskan pada permukaan media lipolitik steril pada masing-masing cawan petri yang telah disiapkan. Selanjutnya cawan-cawan petri tersebut diinkubasikan pada suhu kamar selama 2 x 24 jam dan diamati pertumbuhannya• Karakterisasi morfologi dan biokimia isolateBeberapa isolate yang memiliki nilai hidrolisis lipid dikarakterisasi sifat morfologi dan biokimianya. Karakterisasi morfologi mencakup bentuk sel, penetaan sel dan sifat gram. Pewarnaan gram menggunakan pewarna Kristal violet dan safranin untuk mementukan sifat gram dari bakteri lipolitik tersebut.Morfologi koloni bakteri

Pengamatan morfologi koloni bakteri menurut Barrow (2002) dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui bentuk, ukuran, tekstur, dan warna koloni bakteri dengan cara mencatat bentuk, ukuran, tekstur, dan warna sesuai acuan identifikasi. Pada tahap ini pertama ambil sedikit sampel bakteri dengan menggunakan ose yang sudah disterilkan terlebih dahulu pada isolat bakteri yang paling berpotensi yang ditemukan dan diletakkan pada obyek glass setelah itu difiksasi diatas api bunsen hingga kering kemudian ditutup dengan cover glass dan diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 400 kali.

Sebelum kegiatan pengamatan untuk mengetahui morfologi bakteri pertama diawali dengan pewarnaan Gram menurut prosedur Saanin (1984) caranya dengan mengambil satu ose dari setiap jenis koloni dari media isolasi, dan dibuat ulasan di atas objek glass. Pengecatan gram dengan menggunakan pewarna gram A (larutan ammonium oksalat Kristal violet) dibiarkan selama 2 menit dan sisa zat warna dibuang dengan menggunakan air mengalir, gram B (larutan iodium lugol) dibiarkan selama 1 menit kemudian sisa larutan iodium lugol dicuci dengan menggunakan air mengalir, gram C (larutan asam aseton alkohol) dibiarkan selama 10-20 detik kemudian dicuci di bawah air mengalir, dan gram D (larutan safranin) dibiarkan selama 30 detik kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan dengan menggunakan kertas saring. Sebelum diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 400x, preparat terlebih dahulu ditetesi dengan minyak emersi sebanyak 1 -2 tetes. Hasil pewarnaan diamati dibawah mikroskop. Sel yang telah melalui pengecatan gram jikabersifat gram positifmaka sel berwarnabiru gelap atau ungu dan bila gram negatif berwarna merah muda.

Pengujian aktivitas bakteri lipolitikUji aktivutas bakteri lipolitik dilakukan untuk mengetahui bakteri yang berpontensi paling kuat dalam menghidrolisis lemak. Koloni bakteri yang tumbuh terisolasi dengan memiliki karakter pengurai dapat ditunjukkan oleh terbentuknya zona bening di sekitar pertumbuhannya. Potensi hidrolisis dari setiap isolat dapat dihitung berdasarkan nisbah diameter zona bening terhadap diameter koloni bakteri yang tumbuh. Semakin besar zona bening yang terbentuk maka bakteri tersebut memiliki potensi paling tinggi dalam mendegradasi bahan organik (Suarsini, 2006).

Indeks Lipolitik dapat diukur dengan cara berikut:IL = X1-X2 / X2

Keterangan:IL = Indeks Lipolitik X1 = Rata-rata diameter zona bening X2 = Rata-rata diameter koloni (G. Lim, dkk, 1987)