96

BAB V

KUANTIFIKASI METILASI SITOSIN DNA GENOM PADA

JARINGAN DAUN, BUNGA, DAN BUAH KELAPA SAWIT ABNORMAL

ABSTRAK

Abnormalitas pada bunga kelapa sawit hasil kultur jaringan dibuktikan oleh beberapa peneliti berhubungan dengan hipometilasi, suatu fenomena epigenetik. Hipometilasi ini dideteksi pada jaringan kalus dan daun tanaman kelapa sawit sedangkan abnormalitas terjadi pada jaringan bunga. Metilasi sitosin berperan dalam meregulasi ekspresi gen spesifik jaringan. Penelitian bertujuan membuktikan status metilasi sitosin pada jaringan bunga, buah dan daun tanaman normal, menetapkan status metilasi pada tanaman abnormal dari ketiga jaringan, serta mempelajari kecenderungan metilasi DNA dengan tingkat abnormalitas buah. Bahan tanaman berasal dari klon MK 152 dengan tanaman berbuah normal, abnormal ringan (AbR) dan abnormal berat (AbB), serta abnormal sangat berat 1 (AbSB1) tidak berasal dari klon MK 152. Kuantifikasi DNA dengan teknik RP-HPLC (Reverse Phase High Performance Liquid Chromathography). Hasil penelitian pada tanaman normal menunjukkan status metilasi sitosin jaringan bunga lebih rendah dibandingkan jaringan daun dan buah (49.20 vs 53.90 vs 52.27%). Status metilasi sitosin tersebut berubah pada tanaman abnormal yaitu metilasi sitosin pada jaringan bunga cenderung sama dengan jaringan daun dan buah. Umumnya jaringan daun tanaman abnormal mengalami hipometilasi 1.31-4.7%, dan jaringan bunga mengalami hipermetilasi 0.69-2.66% dibandingkan dengan jaringan daun dan bunga tanaman normal. Namun tidak ada perubahan metilasi pada jaringan buah. Tingkat abnormalitas pada buah tidak berhubungan dengan bertambah atau berkurangnya metilasi sitosin. Perubahan status metilasi DNA genom pada jaringan daun dan bunga tidak berhubungan dengan abnormalitas bunga. Kata kunci : kelapa sawit, kultur jaringan, bunga abnormal, tingkat abnormalitas,

metilasi sitosin

PENDAHULUAN

Perbanyakan tanaman melalui kultur jaringan merupakan alternatif

perbanyakan yang lebih menjanjikan karena diperoleh tanaman yang seragam,

membutuhkan waktu relatif singkat, bebas patogen dan kelebihan lainnya.

Perbanyakan kelapa sawit melalui kultur jaringan untuk tujuan perbanyakan

dimulai tahun 1970, diharapkan melalui teknologi ini dapat memenuhi permintaan

bibit. Menurut Lubis (1992) tanaman kelapa sawit hasil perbanyakan dari kultur

97

jaringan menghasilkan jumlah tandan buah lebih banyak, berat tandan lebih

tinggi dan memerlukan waktu relatif cepat. Namun keberhasilan perbanyakan

kelapa sawit melalui kultur jaringan ini tidak seperti yang diharapkan. Corley

et al. (1986) melaporkan proporsi kelapa sawit yang berasal dari embrio somatik

memperlihatkan fenotip varian somaklonal yang mempengaruhi struktur bunga

pada kedua seks, oleh Hartley (1977) disebut sebagai bunga mantel.

Beberapa penelitian mengungkapkan bahwa kejadian buah mantel pada

kelapa sawit tidak berhubungan dengan variasi pada jumlah DNA nukleus (Rival

et al. 1997), bukan karena pengaturan transposon tetapi berhubungan dengan

perubahan dalam pola metilasi dari komponen genomik (Kubis et al. 2003), tidak

ada perubahan dalam sekuens DNA pada jaringan abnormal yang dideteksi

dengan teknik RAPD (Rival et al. 1998). Hasil-hasil tersebut menguatkan

hipotesis adanya epigenetik penyebab variasi somaklonal pada kelapa sawit.

Perubahan epigenetik adalah perubahan pada metilasi DNA genom, suatu

fenomena yang berhubungan dengan variasi somaklonal (Kaeppler & Phillips

1993a), tidak melibatkan perubahan dalam sekuens DNA (Bellucci et al. 2002).

Perubahan status metilasi DNA merupakan suatu respon terhadap stimuli

lingkungan. Contoh perlakuan dingin pada kecambah jagung berakibat pada

demetilasi global dari DNA genom akar (Steward et al. 2002), tembakau yang

diserang patogen menginduksi demetilasi dari gen tertentu (Wada et al. 2004),

konsentrasi auksin (NAA) dan sitokinin dalam media kultur mempunyai

pengaruh dramatis terhadap timbulnya bunga mantel pada tanaman kelapa sawit

(Eeuwens et al. 2002), berhubungan dengan hipometilasi (Jaligot et al. 2000).

Hasil-hasil tersebut mengidikasikan bahwa tidak stabil status metilasi DNA pada

tanaman, yang secara rutin akan berubah pada keadaan tertentu seperti stress

lingkungan (Wada 2005). Perubahan metilasi sitosin pada sekuens CG maupun

CNG pada tanaman kemungkinan berhubungan dengan perubahan transkripsi gen

yang berperan terhadap perubahan morfologi. Kemungkinan keadaan cekaman

selama kultur jaringan dengan konsentrasi auksin yang tinggi diduga

mempengaruhi kestabilan status metilasi sitosin di dalam genom kelapa sawit.

Perubahan metilasi sitosin berdampak terhadap tidak terekspresi gen-gen tertentu

karena hipermetilasi, atau terskpresinya gen-gen yang tidak diinginkan pada

98

jaringan tertentu karena hipometilasi. Hipometilasi dan hipermetilasi juga

mempengaruhi kestabilan genom melalui perubahan struktur kromatin. Beberapa

peneliti mendapatkan bahwa bunga mantel pada kelapa sawit berhubungan dengan

hipometilasi (Jaligot et al. 2000 ; Mathes et al. 2001; Kubis et al. 2003), peneliti

yang lain mengatakan karena hipermetilasi (Shah & Ahmed-Parveez 1995).

Pada tanaman tingkat tinggi, metilasi DNA umumnya pada sekuens

dinukleotida CG maupun trinukleotida CNG (Gruenbaum et al. 1981), berada

sepanjang kromosom (Kass et al. 1997). Metilasi DNA dapat mengontrol aktivitas

gen dalam jangkauan kecil dengan mempengaruhi promotor dan enhancer, atau

jangkauan luas melalui mekanisme global dengan mempengaruhi beberapa gen

dalam seluruh kromosom atau genom (Antequera & Bird 1988). Finnegan et al.

(2001) melaporkan bahwa demetilasi genom (penghilangan kelompok metil DNA

genom) secara luas berhubungan dengan proses regulasi perkembangan yang

ditempatkan pada jaringan spesifik. Perbedaan nyata tingkat metilasi sitosin

diperlihatkan antara tipe jaringan yang berbeda pada tanaman tomat

(Messeguer et al. 1991), padi (Xiong et al. 1999) dan mawar (Xu et al. 2004).

Menurut Boyes dan Bird (1991) dan Renckens et al. (1992) metilasi dan

demetilasi sitosin pada daerah promotor merupakan mekanisme penting

mengregulasi ekspresi gen pada sel dan jaringan spesifik. Umumnya penelitian-

penelitian tentang metilasi sitosin pada tanaman kelapa sawit berbuah mantel

menggunakan DNA yang berasal dari jaringan kalus (Jaligot et al. 2000 ; Jaligot

et al. 2002 ; Kubis et al. 2003) dan jaringan daun tanaman dewasa (Jaligot et al.

2000 ; Matthes et al. 2001; Jaligot et al. 2002 ; Jaligot et al. 2004).

Jaringan-jaringan tanaman yang digunakan dalam penelitian-penelitian

tersebut tidak berhubungan dengan perubahan morfologi atau jaringan abnormal

dari tanaman kelapa sawit. Abnormalitas pada tanaman kelapa sawit terjadi pada

organ bunga. Namun seberapa berat keabnormalan pada bunga dan bagaimana

status metilasi pada jaringan tersebut menjadi hal yang penting untuk diteliti.

Dengan demikian penelitian diarahkan untuk mengetahui status metilasi pada

jaringan bunga maupun buah yang berhubungan dengan abnormalitas sebagai

suatu fenomena epigenetik.

99

Menurut Bellucci et al. (2002) metode untuk mengetahui persentase

nukleotida yang termetilasi pada sekuens DNA adalah HPLC. Jaligot et al.

(2000) dan Kubis et al. (2003) menggunakan teknik ini membuktikan bahwa

metilasi global pada tanaman abnormal lebih rendah dari tanaman normalnya.

Shah dan Ahmed-Parveez (1995) menggunakan teknik High Pressure Liquid

Chromatography mendapatkan bahwa tingkat 5-metilsitosin lebih tinggi pada

klon tanaman yang abnormal dibandingkan dengan tanaman normal. Perbedaan

hasil ini menjadi menarik untuk diteliti pada tanaman kelapa sawit dalam

penelitian ini.

Penelitian bertujuan (1) menetapkan status metilasi DNA pada jaringan

daun, bunga dan buah, (2) menganalisis status metilasi pada ketiga jaringan dari

tanaman berbunga abnormal, serta hubungannya dengan tingkat abnormalitas

pada buah. Diharapkan hasil penelitian ini memberikan informasi tentang status

metilasi DNA pada jaringan tanaman abnormal dan pengaruhnya pada tingkat

abnormalitas.

BAHAN DAN METODE

Bahan Tanaman

Penelitian dilaksanakan di SEAMEO BIOTROP Bogor, Tajur dan di

Laboratorium Analisis Balai Besar Pasca Panen-Cimanggu Bogor dari bulan

Maret 2005 sampai Juni 2007. Bahan tanaman kelapa sawit merupakan koleksi

Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) berumur 11 tahun di

Ciampea-Bogor. Dari tujuh klon tanaman koleksi (Klon MK152, MK 176, MK

203, MK163, MK104, MK 212 dan Klon 209) hanya satu klon yang digunakan

dalam penelitian ini yaitu klon MK 152 karena mempunyai beberapa tanaman

dengan tipe buah berbeda yaitu tanaman berbuah normal (Nml), abnormal berat

(AbB) dan abnormal sangat berat 2 (AbSB2). Satu tanaman pinggiran dari klon

MK 152 berbuah abnormal sangat berat 1 (AbSB1) digunakan karena mempunyai

tipe abnormal yang spesifik, tidak ditemukan pada tujuh klon koleksi. Bahan

tanaman yang digunakan adalah bunga, buah dan daun. Bunga diambil dari tandan

buah yang masih terbungkus dalam dua lapis seludang (fase 2 penelitian

100

sebelumnya). Buah muda dengan ciri pangkal buah ke arah bagian tengah

berwarna putih kehijauan sedangkan bagian ujung berwarna ungu gelap.

Sedangkan daun diambil dari ubud yang masih muda, berwarna putih dengan

tulang daun lunak.

Metode Penelitian

Persiapan Bahan Tanaman

Bahan tanaman diambil dari lapangan meliputi bunga dan buah yang masih

tersusun pada spikelet sedangkan daun dalam bentuk ubud, kemudian bahan-

bahan tersebut dibungkus dengan koran diberi label dan dimasukan dalam plastik

secara terpisah. Bahan tanaman langsung dibawa ke laboratorium dan dimasukan

ke dalam lemari pendingin. Besok harinya persiapan bunga, buah dan daun untuk

kemudian digunakan sebagai bahan untuk isolasi DNA. Bunga dilepaskan dari

sipkelet dan daun pelindung terluar kemudian dimasukan ke dalam tabung volume

30 ml yang berisi bufer ekstrasi DNA dengan 1% merkaptoetanol dan disimpan di

suhu 4oC. Buah dilepaskan dari daun pelindung terluar, daun pelindung dan

perhiasan bunga, kemudian buah dibersihkan dengan tissue. Buah muda tersebut

dipotong tipis-tipis dari bagian mesokarp yang berwarna putih kehijauan tanpa

bagian tengah buah atau embrio, kemudian dimasukan ke dalam bufer ekstrasi

DNA seperti halnya sampel bunga. Sedangkan daun dibersihkan dengan tissue

dan digunting memanjang 3 cm dengan diameter 0.5 cm tanpa tulang daun

kemudian dimasukan juga dalam bufer. Semua tabung yang berisi sampel diberi

label sesuai bahan tanaman dan tingkat abnormal. Bahan tanaman disimpan

dalam bufer ekstrasi DNA supaya awet dan siap digunakan.

Isolasi DNA

Khusus untuk bunga dan buah, sebelum digerus disayat tipis memanjang

sesuai bentuk bunga atau buah untuk memudahkan penggerusan. Isolasi DNA

berdasarkan metode CTAB (Doyle & Doyle 1990) yang dimodifikasi. Sampel

bunga atau buah atau daun ditimbang 0.4 g kemudian dimasukan dalam lumpung

porselin dengan menambahkan nitrogen cair secukupnya sampai sampel

terendam. Pengerusan dilakukan beberapa detik setelah pemberiaan nitrogen cair.

101

Sebelum penambahan kedua kali nitrogen cair diberikan dahulu PVP (Polyvinyl-

Pyrrolidone, SIGMA) sebanyak 20 mg. Selama penggerusan sampel tidak boleh

kena udara tanpa ada nitrogen cair karena dapat menyebabkan pencokelatan yang

akan merusak DNA. Penggerusan dilakukan sampai sampel menjadi tepung

berwarna putih dan segera dimasukan ke dalam Eppendorf volume 2 ml yang

berisi 1 ml bufer ekstrasi (20 mM EDTA pH 8.0, 100mM HCl pH 8.0, 1.26 %

NaCl dan 2% CTAB) dengan 1 % merkaptoetanol. Kemudian divorteks sampai

terbentuk suspensi dan dipanaskan di dalam pengangas air (waterbath) suhu 65oC

selama 30 menit dengan catatan setiap 10 menit sampel dikeluarkan dan dikocok

manual. Setelah proses ekstrasi, sampel dibiarkan dingin pada suhu ruang dan

dilanjutkan dengan proses pemurniaan dengan kloroform : isoamilalkohol yang

dilakukan sebanyak dua kali. Satu kali volume kloroform : isoamil alkohol (24:1)

ditambahkan ke sampel dan divorteks sampai terbentuk suspensi, kemudian

disentrifus pada mikrosentrifus dengan kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit,

supernatan (fase bagian atas) di ambil dengan pipet dan dipindahkan ke Eppendorf

baru yang steril. Supernatan dimurnikan lagi dengan kloroform : isoamil alkohol

dengan cara yang sama. Supernatan dari hasil pemurniaan kedua ini dipresipitasi

dengan menambahkan 1 x volume iospropanol dingin dan dikocok dengan hati-

hati sampai terbentuk benang-benang DNA, kemudian disimpan pada suhu -20oC

satu jam. DNA yang diperoleh dari hasil pemurniaan masih terbungkus dengan

lendir atau kontaminan sehingga dilanjutkan dengan pemurniaan tahap kedua

menggunakan fenol.

Sampel DNA disentrifus pada mikrosentrifus dengan kecepatan 11.000 rpm

selama 10 menit kemudian supernatan dibuang sedangkan pelet dilarutkan dengan

bufer TE (Tris-EDTA). Larutan DNA dimurnikan lagi dengan 1 x volume fenol

: kloroform : isoamil alkohol (25:24:1) divorteks sampai terbentuk suspensi dan

disentrifus11.000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dengan pipet dan

dipindahkan ke Eppendorf baru volume 2 ml, selanjutnya dimurnikan lagi dengan

kloroform : isoamil alkohol (24 :1) dengan cara divorteks kemudian disentrifus

11.000 rpm selama 30 menit. Supernatan dipanen dengan memindahkannya ke

Eppendorf baru volume 2 ml dan ditambahkan 1/10 5 M Natrium asetat dan 2.5

volume alkohol absolut (etanol) digoyang dengan hati-hati sampai terbentuk

102

gumpalan transparan putih (DNA), kemudian disimpan pada suhu -20oC selama 1

jam. Sampel DNA tersebut disentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, kemudian

supernatan dibuang sedangkan pelet (DNA) dibilas dengan 500 µl 70% alkohol.

Tahap selanjutnya DNA dikering-anginkan atau divakum selama ±1 jam. DNA

yang telah kering dilarutkan dengan 100 µl bufer TE (Tris-EDTA) dan disimpan

pada -20oC (Lampiran 6).

Tahap pemurniaan ketiga yaitu menghilangkan kontaminan RNA dari

DNA. Enzim Ribonuklease A (AppliChem) dipersiapkan dengan konsentrasi 10

mg/ml dan untuk menghilangkan RNA ditambahkan 1µg/µl ke sampel DNA (atau

100 ul DNA dengan 10 ul RNase A) dibiarkan pada suhu 37oC selama 2 jam.

DNA yang telah murni disimpan pada suhu -20oC untuk digunakan selanjutnya.

Pengujian Kuantitas dan Kualitas DNA

DNA hasil purifikasi RNAse A diuji kualitas dan kuantitasnya dengan dua

cara yaitu melalui elektroforesis dan pencacahan dengan enzim EcoRI. Pada

teknik elektroforesis, 1µl DNA ditambah 4 µl ddH20 dan 1 µl loading dye

kemudian dirunning pada 1% gel agarose (AppliChem) pada tegangan 65 volt,

arus 100 ampere selama 50 menit, dan sebagai marker digunakan 100 ng/ µl DNA

unmethylated lambda (PROMEGA). Selanjutnya gel direndam dalam 1%

etiumbromida ± 1 jam dan divisualkan pada Gel logic 2000 Imaging System UV

dengan software kodak ID 2.6.

Kualitas sampel DNA dapat diketahui dengan mencacahnya

menggunakan ensim EcoRI. Sampel DNA 500 ng (100 ng/ul) ditambahkan

dengan 1 U EcoRI (FERMENTAS) dalam satu kali kuat bufer restriksi (Tabel 5).

Tabel 5. Bahan-bahan untuk satu kali reaksi restriksi ensim EcoRI

103

Umumnya untuk mempermudah pekerjaan dengan jumlah sampel DNA yang

banyak maka dibuat master miks sesuai dengan jumlah sampel. Contoh jika 10

sampel maka dibuat master miks untuk 11 reaksi (master miks sebelum

ditambahkan ke sampel DNA dispin lebih dahulu), kemudian diambil 20 µl dari

master miks dimasukan ke tabung volume 500 µl yang telah berisi 5 ul DNA,

kemudian diinkubasi 37oC selama 2 jam. Sepuluh mikroliter sampel DNA yang

telah dicacah dengan ensim EcoRI ditambahkan dengan 2 µl loading dye dan

dirunning pada 1.4% gel agarosa (AppliChem) pada tegangan listrik 70 volt, arus

100 ampere selama 1 jam 30 menit, kemudian gel agarosa direndam dalam 1%

etiumbromida selama 1 jam dan divisualisasi pada gel logic 2000 imaging system

UV dengan software kodak ID 2.6.

Kuantifikasi Metil-Sitosin DNA Genom dengan Teknik RP-HPLC

DNA yang telah murni dipreparasi untuk mendapatkan nukleosida

menggunakan metode Kubis et al. (2003). Sampel DNA dilarutkan dengan

ddH2O steril (50 ng/µl) volume 100 µl dipanaskan dalam air mendidih selama 2

menit kemudian didinginkan segera pada es. Sampel DNA yang telah didenaturasi

ditambahkan dengan 5 µl 10 mM ZnSO4 dan 2 µl Nuklease S1 (1U/ul) (SIGMA),

dicampur secara manual dan dispin 30 detik kecepatan 5000 rpm, selanjutnya

diinkubasi pada suhu 37oC dalam pengangas air selama 16 jam. Sampel

nukloetida ditambahkan dengan 10 µl 0.5M Tris-HCl pH 8.3 dan 1.5 µl ensim

alkaline fosfatase (1U/ µl ), dicampur secara manual kemudian diinkubasi 37oC

dalam pengangas air selama 2 jam (Lampiran 7). Sampel nukleosida disentrifus

11.000 rpm pada suhu ruang selama 10 menit kemudian supernatan diambil

dengan hati-hati untuk menghindari terikutnya kontaminan yang mengendap.

Tahap selanjutnya sampel nukleosida diukur dengan teknik RP-HPLC.

Dua puluh mikroliter sampel nukleosida disuntik ke kolum superkosil C-18

pada Waters automatic HPLC yang dilengkapi dengan detektor UV panjang

gelombang 254 nm. Elusi dilakukan dalam fase gerak 0.05 M NH4H2PO4, 8%

metanol pH 4.2 dengan kecepatan aliran 1 ml/ menit pada suhu ruang. Nukleosida

tunggal standar yang digunakan adalah 5’metil-sitidin (SIGMA) dan sitidin

(SIGMA) dengan konsentrasi masing-masing 100 ppm. Puncak nukleosida

104

tunggal standar dipakai selanjutnya untuk kuantifikasi kandungan sitidin dan

metilsitidin dengan rumus :

Luas Area Sampel X Konsentrasi Standar Luas Area Standar

Persentase kandungan 5’metil-sitidin dari DNA genom kelapa sawit (5mC)

dihitung dengan rumus : ( 5’mC/ [5’mC + 5’C] ) x 100 % ( Bochardt et al. 1992 ;

Kubis et al. (2003).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kuantitas dan Kualitas DNA

Kualitas dan kuantitas DNA sangat penting dalam melakukan suatu

penelitian molekuler sehingga diperlukan metode isolasi dan pemurniaan DNA

yang tepat. DNA yang murni menunjukkan bahwa semua kontaminan dari sel

telah bersih melalui serangkaian perlakuan dengan metode CTAB. Bahan-bahan

yang digunakan dalam metode tersebut meliputi CTAB, NaCl, EDTA dan Tris-

HCl, kemudian pemurniaan dengan kloroform-isoamilalkohol dan fenol-

kloroform-isoamilalkohol serta melalui tahap perlakuan fisik diharapkan

diperoleh asam nukleat yang murni karena telah bersih dari debris sel dan

kontaminan sel yang lain. Selain itu, digunakan PVP dan merkaptoetanol sebagai

antioksidan supaya asam nukleat tidak teroksidasi selama proses ekstrasi.

Gambar 25. Penampilan DNA hasil elektroforesis dari jaringan

daun, bunga dan buah. M (marker DNA), N (normal), AB (abnormal berat), SB1 (abnormal sangat berat 1), SB2 (abnormal sangat berat 2)

105

Gambar 26. Penampilan sampel DNA yang tidak dicacah dan dicacah

dengan ensim EcoRI dari jaringan daun, bunga dan buah. Kolom pertama menunjukkan DNA yang belum dicacah sedangkan kolom kedua menunjuk DNA telah dicacah pada tiap tingkat abnormalitas berbeda. N (normal), AB (abnormal berat), SB1 (abnormal sangat berat 1), SB2 (abnormal sangat berat 2)

Penelitian untuk mengkuantifikasi nukleosida memerlukan DNA yang

murni sehingga dapat dicacah oleh ensim eksonuklease (Nuklease S1) menjadi

nukleotida tunggal. Pemurniaan dengan RNAse untuk mendegradasi RNA supaya

diperoleh molekul DNA yang tidak terkontaminasi oleh RNA. Pendeteksian

kuantitas dan kemurniaan DNA yang telah diisolasi dilakukan melalui

elektroforesis yang divisualisasi dengan sinar UV. Sedangkan Kuantitas DNA

diperkirakan berdasarkan konsentrasi marker DNA. Nampak konsentrasi DNA

sampel daun, bunga dan buah berada pada konsentrasi 100 ng/ul seperti halnya

marker DNA (Gambar 25). Ciri DNA yang murni atau tidak terdapat kontaminan

adalah DNA dapat bermigrasi melalui pori-pori agarosa dalam bufer dengan arus

listrik tertentu, tidak tertinggal pada sumur dan berada pada posisi sama dengan

marker DNA (M), serta dapat dicacah oleh ensim nuklease. Pengujian kemurniaan

(kualitas) DNA juga dapat dideteksi dengan mencacah DNA dengan ensim

restriksi EcoRI. Nampak bahwa sampel DNA dari jaringan daun, bunga dan buah

dapat dicacah oleh ensim EcoRI (Gambar 26) melalui penampilan smer DNA atau

fragmen DNA menyebar kontinyu dari ukuran besar sampai kecil,

mengindikasikan bahwa tidak ada kontaminan yang menghalangi aktivitas ensim

EcoRI.

106

Status Metilasi Sitosin Pada Beberapa Jaringan Tanaman Berbunga Normal

Kelapa sawit hasil perbanyakan kultur jaringan pada tingkat plantlet sampai

umur reproduktif tidak memperlihatkan abnormalitas pada semua jaringan

tanaman. Abnormalitas dapat diamati pada fase reproduktif yaitu saat tanaman

menghasilkan bunga. Hasil penelitian sebelumnya didapatkan bahwa terdapat lima

karakteristik buah dari tanaman hasil kultur jaringan yaitu normal, abnormal

ringan (AbR), abnormal berat (AbB), abnormal sangat berat 1 (AbSB1) dan

abnormal sangat berat 2 (AbSB2). Selain itu diperoleh bahwa abnormalitas

pada tingkat buah adalah perkembangan lanjut dari abnormal pada tingkat bunga.

Bunga mantel merupakan istilah untuk bunga yang mengalami penambahan

karpel tambahan. Dalam penelitian ini bunga mantel disebut sebagai bunga

abnormal. Banyak penelitian membuktikan bahwa bunga abnormal tersebut

sebagai akibat penurunan metilasi DNA genom pada basa sitosin (C). Hasil

penelitian dengan teknik HPLC memperlihatkan pola kurva yang tidak signifikan

antara kandungan 5-metilsitidin (5-mC) dengan sitidin (C) pada DNA genom tiap

tanaman (Lampiran 8), demikian juga antara jaringan daun, bunga dan buah.

Berbagai penelitian mengungkapkan ekspresi gen pada jaringan spesifik

diregulasi oleh kejadian metilasi DNA. Hasil penelitian menunjukan bahwa ada

perbedaan pola metilasi antara jaringan daun, bunga dan buah pada tanaman

berbuah normal. DNA dari jaringan daun mempunyai tingkat metilasi sitosin

(53.90 %) lebih tinggi dibandingkan dengan jaringan bunga dan buah (Gambar

Gambar 27. Pola kandungan metil sitosin (5-mC) pada tanaman berbunga

normal pada jaringan daun, bunga dan buah

53.9049.20 52.27

0

10

20

30

40

50

60

5-m

C (%

)

Daun Bunga BuahTipe Jaringan Tanaman Normal

107

27 & Lampiran 9). Hasil penelitian Jaligot et al. (2000) memperlihatkan tingkat

metilasi pada daun tanaman normal kelapa sawit 22%. Tingkat metilasi sitosin

yang tinggi dalam penelitian ini kemungkinan karena perbedaan ensim

eksonuklease dan kolum HPLC yang digunakan. Kemungkinan lain adalah

penggunaan zat pengatur tumbuh pada saat kultur jaringan. Hasil penelitian Lo

Shiavo et al. (1989) pada wortel menunjukkan bahwa ada korelasi positif antara

auksin yang ditambahkan dengan meningkatnya metilasi sitosin lebih dari 70%.

Pada tanaman normal, status metilasi sitosin jaringan bunga (49.20%) lebih

rendah dibandingkan jaringan daun (53.90%) yaitu terjadi penurunan persentase

metilasi sekitar 4.7% (Gambar 27) atau adanya hipometilasi pada jaringan

bunga betina. Hal ini mengindikasikan pelepasan kelompok metil dari sitosin

berhubungan dengan ekpresi gen-gen yang meregulasi perkembangan bunga

tersebut. Seperti yang dikemukakan oleh Finnegan et al. (2001) bahwa demetilasi

genom secara luas mempunyai efek pleiotropik terhadap regulasi proses

perkembangan yang ditempatkan pada jaringan spesifik atau tahap perkembangan

pada tanaman. Sebagian besar hipotesis mengatakan bahwa pola metilasi yang

terbentuk selama perkembangan akan mengalami demetilasi pada jaringan

spesifik dimana kelompok metil dilepaskan dari tempat kritis dari suatu gen yang

telah dijadwalkan terekspresi pada tipe sel tersebut. Seperti yang dikemukakan

oleh Gardner et al. (1991) bahwa pada perkembangan awal sel embrio, sebagian

besar gen termetilasi kemudian diferensiasi sel membentuk jaringan spesifik

terjadi penghilangan kelompok metil pada basa sitosin (demetilasi) menyebabkan

gen-gen terkespresi pada jaringan tersebut. Metilasi sitosin pada nukleotida CG

dan CNG ditemukan dalam frekuensi sepanjang kromosom dan bertindak untuk

meregulasi ekspresi gen yang terjadi pada level gen atau secara regional yang

mempengaruhi daerah kromosom (Bird 1986).

Tingkat metilasi pada jaringan buah (52.27%) signifikan meningkat 3.07%

dibandingkan dengan jaringan bunga atau terjadi penurunan 1.63 % dibandingkan

dengan jaringan daun (Gambar 27 & Lampiran 9). Kemungkinan yang terjadi

adalah ekspresi gen yang berhubungan dengan perkembangan bunga telah

mengalami switch off sedangkan regulasi perkembangan ovari tidak melibatkan

banyak gen. Hal ini karena DNA diambil dari mesokarp buah fase muda yang

108

merupakan ovari tanpa terikut embrio atau sitoplasma. Jaringan mesokarp buah

adalah perkembangan lanjut dari karpel bunga sebagai akibat penyerbukan dan

pembuahan seksual. Seperti yang dikemukakan oleh Bouman (1984) bahwa pada

sebagian besar bunga, ovari matang selama perkembangan bunga dan ovul

terbentuk sempurna terutama dengan penyerbukan dan siap untuk difertilisasi.

Sebaliknya kematangan ovari pada beberapa bunga dan diferensiasi ovul distimuli

oleh penyerbukan.

Beberapa penelitian membuktikan bahwa perubahan metilasi berhubungan

dengan tipe jaringan tertentu. Xiong et al. (1999) pada tanaman padi hibrida

dengan teknik MSAP (Methylation Sensitive Amplified Polymorphic)

memperlihatkan sitosin termetilasi lebih tinggi pada DNA jaringan kecambah

dibandingkan dengan daun. Dibuktikan oleh Xu et al. (2004) pada tanaman

mawar hibrida bahwa sitosin dari DNA jaringan pucuk (shoot) lebih banyak

termetilasi melalui sedikitnya pita MSAP yang dihasilkan dibandingkan dengan

jaringan daun. Hasil dalam penelitian ini membuktikan juga bahwa status metilasi

pada jaringan daun berbeda dengan jaringan bunga. Hasil-hasil ini

mengindikasikan bahwa perkembangan atau pembentukan jaringan tertentu

diregulasi oleh metilasi DNA. Seperti yang dikemukakan oleh Finnegan et al.

(1998) bahwa terjadi perubahan pola metilasi terutama selama differensiasi organ

dan sepanjang proses penuaan suatu jaringan.

Pola Metilasi Sitosin pada Beberapa Jaringan Tanaman Abnormal

dengan Beberapa Tingkat Abnormalitas Buah

Status Metilasi Pada Jaringan Daun

Kelapa sawit hasil perbanyakan dari kultur jaringan memperlihatkan

keragaman dalam tingkat keabnormalan buah. Banyak penelitian mengungkapkan

bahwa buah abnormal pada kelapa sawit merupakan akibat proses kultur jaringan

(Corley 1986; Fatmawati et al. 1997; Tregear et al. 2002). Kaeppler dan Phillips

(1993b) mengatakan bahwa perubahan metilasi terjadi dalam frekuensi yang

cukup tinggi merupakan sumber penting variasi yang diinduksi kultur jaringan.

Dikatakan juga bahwa variasi metilasi muncul lebih sering dibandingkan dengan

variasi pada sekuens DNA.

109

Gambar 28.Pola kandungan metil sitosin (5-mC) beberapa tingkat abnormalitas pada beberapa tipe jaringan tanaman. (a) jaringan daun, (b) jaringan bunga, (c) jaringan buah.. AbB (Abnormal berat), AbSB2 (Abnormal sangat berat 2) dan AbSB1 (Abnormal sangat berat 1)

53.949.89 51.34 52.59

010203040506070

5-m

C (%

)

Normal AbB AbSB2 AbSB1Tingkat Abnormalitas

52.27 51.78 52.86 52.70

010

20304050

6070

5-m

C (%

)

Normal AbB AbSB2 AbSB1Tingkat Abnormalitas

49.2051.86 51.41 49.89

0

10

20

30

40

50

60

70

5-m

C (%

)

Normal AbB AbSB2 AbSB1Tingkat Abnormalitas

b

c

a

110

Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat sedikit keragaman tingkat

metilasi sitosin DNA genom dengan tingkat abnormalitas dan tipe jaringan

tanaman. Metilasi sitosin pada jaringan daun dari semua tanaman abnormal lebih

rendah 1.31-4.01% dibandingkan dengan tanaman normal (Gambar 28a &

Lampiran 9). Ini menunjukkan bahwa terjadi hipometilasi ( penurunan metilasi

sitosin) pada tanaman abnormal meskipun dengan persentase yang relatif kecil.

Jaligot et al. (2000) juga mendapatkan bahwa metilasi sitosin menurun

4.5 % pada kalus pertumbuhan cepat (FGC) yang menghasilkan 100% tanaman

berbunga mantel dibandingkan dengan kalus nodular kompak (NCC) yang

menghasilkan 5% mantel, sedangkan metilasi sitosin dari jaringan daun tanaman

dewasa yang abnormal mengalami penurunan 0.5-2.5% dibandingkan dengan

tanaman normalnya. Didapatkan adanya hipometilasi 1.6% (20.6% vs 22.2%)

pada DNA daun dari tanaman berbunga mantel berat

(http://www.actahort.org/books/530l/530_52.html), demikian juga jaringan kalus

memperlihatkan hipometilasi 4.6% pada kalus FGC dibandingkan dengan NCC.

Kubis et al. (2003) dengan menggunakan DNA dari jaringan daun mendapatkan

bahwa kandungan metilasi sitosin pada tanaman abnormal sedikit lebih rendah

dibandingkan dengan tetua. Matthes et al. (2001) menggunakan DNA dari

jaringan daun dengan teknik methylation-sensitive AFLP membuktikan bahwa

sedikit penurunan kejadian metilasi pada situs CCGG yang terjadi selama kultur

jaringan kelapa sawit. Hasil-hasil penelitian yang diuraikan tersebut membuktikan

bahwa adanya hipometilasi pada tanaman abnormal yang diidentifikasi pada

jaringan kalus dan daun. Namun Shah dan Ahmed-Parveez (1995) mendapatkan

hasil yang berbeda yaitu adanya fenomena hipermetilasi pada tanaman kelapa

sawit berbunga mantel dibandingkan dengan tanaman berbunga normal.

Penelitian-penelitian untuk mengungkapkan adanya perubahan status

metilasi DNA pada tanaman berbunga mantel memberikan hasil yang berbeda,

dengan pembuktiaan adanya fenomena hipermetilasi dan hipometilasi meskipun

menggunakan DNA dari jaringan kalus dan daun dari tanaman berbunga mantel

(abnormal). Hasil-hasil ini mengindikasikan bahwa fenomena metilasi sebagai

penyebab tanaman mantel tidak stabil, diduga bergantung pada zat pengatur

tumbuh yang digunakan khususnya konsentrasi auksin dan sitokinin (Eeuwens et

111

al. 2002), lamanya waktu kultur (Corley et al. 1986; Paranjothy et al. 1993), serta

tahap spesifik dari perkembangan awal plantlet (Zluvova et al. 2001). Kinetin

telah menunjukkan penyebab ekstensif hipometilasi DNA pada proliferasi kultur

eksplan akar wortel (Arnholdt-Schmitt et al. 1991), dan auksin (NAA)

mempunyai pengaruh berlawanan yaitu sebagai penyebab hipermetilasi

(LoSchiavo et al. 1989). Seperti yang dikemukakan oleh Phillips et al. (1994)

bahwa pada kultur jaringan tanaman dapat terjadi hipermetilasi atau hipometilasi

bergantung pada lingkungan tumbuhnya.

Status Metilasi Pada Jaringan Bunga

Status metilasi sitosin jaringan bunga mengalami perubahan pada tanaman

yang abnormal dibandingkan dengan normalnya, terutama pada AbB dan AbSB2

meskipun ketiga tanaman ini berasal dari klon yang sama. Terjadi peningkatan

metilasi sitosin 0.69-2.66% atau adanya fenomena hipermetilasi pada jaringan

tanaman berbunga abnormal (Gambar 28b & Lampiran 9) dibandingkan dengan

normal. Sitosin termetilasi berhubungan dengan penekanan ekspresi gen pada

jaringan spesifik. Metilasi (hipermetilasi) dan demetilasi (hipometilasi) sitosin

pada daerah promotor merupakan mekanisme penting meregulasi ekspresi gen

pada sel dan jaringan spesifik (Boyes & Bird 1991 ; Renckens et al. 1992).

Perubahan metilasi di dalam DNA genom secara tidak alami menyebabkan

ketidakstabilan genom. Hipometilasi memberi pengertiaan terlepasnya metil dari

basa sitosin dan apabila terjadi pada daerah promotor maka gen-gen akan

terekspresi, yang secara alami tidak seharusnya terekspresi. Hipermetilasi

memberi pengertian terikatnya metil pada basa sitosin dan apabila terjadi pada

daerah promotor maka gen tersebut tidak terekspresi. Perubahan metilasi pada

DNA genom juga berdampak global pada perubahan struktur kromosom yang

melibatkan banyak gen.

Penelitian ini mendapat suatu fenomena yang menarik bahwa hipometilasi

pada jaringan daun tidak menunjukkan keabnormalan pada jaringan tersebut.

Demikian juga hipermetilasi pada jaringan bunga tidak berdampak pada

perubahan organ lain dari bunga atau perubahan morfologi tanaman lainnya.

Kenyataan hanya staminodes/stamen pada bunga betina dan bunga jantan dari

tanaman yang sama terinduksi menjadi karpel. Bahkan hipermetilasi yang hanya

112

0.69% pada AbSB2 menunjuk pada morfologi bunga abnormal yang sama dengan

hipermetilasi 2.66% pada AbB. Hal ini menunjukkan bahwa perubahan status

metilasi sitosin tidak berhubungan dengan abnormalitas pada bunga atau pada

gen-gen yang meregulasi pembentukan organ bunga.

Razin dan Cedar (1994) mengatakan bahwa metilasi sitosin berperan

krusial dalam mengontrol perkembangan pada tanaman, dan kekacuan pola

metilasi sering berperan terhadap perkembangan abnormal. Ditemukan kelapa

sawit berbunga abnormal mempunyai penampilan batang lebih besar, tanaman

lebih tinggi, pelepah daun lebih lebar serta lambat berbunga dibandingkan dengan

tanaman normal. Diduga perubahan metilasi pada tanaman kelapa sawit berbuah

mantel mempengaruhi proses fisiologi tanaman tersebut. Kakutani et al. (1995)

mendapatkan reduksi metilasi sitosin 30 % pada mutan ddm1 Arabidopsis

thaliana memperlihatkan perubahan pada bentuk daun, meningkatnya jumlah

daun dan terlambatnya waktu pembungaan. Tanaman Arabidopsis yang

ditransformasi dengan antisense cDNA metiltransferase mengalami reduksi

metilasi sitosin diatas 90% memperlihatkan sejumlah fenotip dan perkembangan

abnormal meliputi menurunnya dominansi apikal, ukuran tanaman lebih kecil,

ukuran dan bentuk daun berubah, fertilitas menurun dan berubah waktu

pembungaan (Finnegan et al. 1996).

Perubahan metilasi sitosin pada tanaman kelapa sawit sangat rendah

dibandingkan dengan kedua kasus Arabidopsis di atas namun perkembangan

abnormal yang sama antara kedua tanaman ini adalah lambat berbunga. Nampak

bahwa kelapa sawit yang mengalami hipometilasi pada daun (1-4%) dan

hipermetilasi pada bunga (0.69-2.66%) dari tanaman berbunga abnormal

memperlihatkan perkembangan abnormal, diduga terjadi perubahan fisiologi yang

berhubungan dengan metabolik-metabolik tertentu pada lintasan biokimia yang

diregulasi oleh S-adenosilmetionine (SAM). SAM berperan sebagai donor metil

pada DNA, sebagai donor aminopropil untuk biosintesis poliamin dan sebagai

prekursor untuk biosintesis etilen.

Status metilasi jaringan bunga lebih rendah 4.7% dibandingkan dengan

jaringan daun pada tanaman normal, dihubungkan dengan gen-gen yang

terekspresi spesifik untuk jaringan tersebut melalui terlepasnya kelompok metil

113

dari sitosin. Namun terjadi peningkatan metilasi 0.07-1.97% pada jaringan bunga

tanaman abnormal terutama AbB dan AbSB2 (berasal dari klon MK 152)

dibandingkan dengan jaringan daun (Lampiran 9). Sedangkan pada AbSB1

(bukan dari klon MK 152) menunjukkan penurunan 2.7%. Hasil ini juga

memperlihatkan adanya perbedaan pola metilasi dari klon berbeda namun

menunjukkan karakteristik abnormal bunga yang sama.

Hasil penelitian ini memberikan gambaran bahwa setiap perubahan metilasi

sitosin pada suatu jaringan yang distimulasi oleh lingkungan tidak selalu

berhubungan dengan aktif atau inaktif ekspresi gen-gen pada jaringan tersebut.

Metilasi pada sitosin dapat terjadi pada daerah yang berhubungan dengan daerah

promotor suatu gen tetapi juga pada daerah heterokromatin yang tidak

ditranskripsi. Seperti yang dikemukakan oleh Bird (1986) bahwa metilasi sitosin

pada nukelotida CG dan CNG meregulasi ekspresi gen pada tingkat gen atau

secara regional mempengaruhi daerah kromosom. Fungsi metilasi regional

tersebut berfungsi menginaktif heterokromatin dan elemen pada atau dekat

heterokromatin, sehingga frekuensi metilasi pada daerah heterokromatin lebih

besar dibandingkan dengan daerah eukromatin. Kemungkinan perubahan metilasi

terjadi pada daerah heterokromatin atau pada daerah suatu gen yang tidak

berhubungan dengan organ bunga kelapa sawit.

Jaligot et al. (2004) membuktikan bahwa situs CG kurang dipengaruhi

dengan menurunnya metilasi DNA global yang sebelumnya dihubungkan dengan

fenomena bunga mantel. Hal yang sama dibuktikan juga oleh Jaligot et al. (2002)

dengan teknik methylation-sensitive RFLP menggunakan DNA jaringan daun

dan rangkaian bunga dari tanaman abnormal yang sama, dan Matthes et al.

(2001) menggunakan jaringan daun dengan teknik MSAP (Methylation-Sensitive

Amplyfied Polymorphic). Menurut Jaligot et al. (2004) penentuan metilasi DNA

genom tidak cukup untuk membedakan antara jaringan normal dan abnormal

sehingga perlu sekuens target spesifik yang pola metilasinya berhubungan dengan

abnormalitas bunga (bunga mantel). Namun Phillips et al. (1994) mengatakan

bahwa perubahan pola metilasi pada tanaman kultur jaringan tidak terbatas pada

macam sekuens DNA spesifik. Seperti dikemukakan oleh Matthes et al. (2001)

bahwa status metilasi dapat dideteksi pada sekuens spesifik namun tidak diperoleh

114

polimorfis tunggal yang konsisten berbeda antara klon normal dan abnormal pada

tanaman kelapa sawit.

Menurut Ng dan Bird (1999) metilasi sendiri sering tidak cukup untuk

menghalangi transkripsi, tetapi perubahan bentuk kromatin pada sekuens

termetilasi sebagai penyebab inaktif transkripsi. Hipometilasi DNA menginduksi

aktivasi transposon dalam genom yang dapat menyebabkan perubahan struktur

kromosom dan perubahan ekspresi gen. Selain itu dalam pembelahan sel, daerah

heterokromatin yang sangat kompak pengepakannya terlambat memisah pada

anafase dalam siklus sel yang dipercepat selama kultur jaringan sebagai penyebab

patahnya kromosom, diikuti dengan pengaturan kembali.

Status Metilasi Pada Jaringan Buah

Ada suatu kecenderungan kemiripan kandungan metilasi sitosin DNA dari

jaringan buah (mesokarp) pada buah normal maupun abnormal (51.78-52.86 %)

(Gambar 28c & Lampiran 9). Hasil ini menunjukkan bahwa keabnormalan pada

tingkat buah adalah perkembangan lanjut dari keabnormalan pada tingkat bunga.

Penyerbukan menstimuli pembesaran ovari dan ovari berkembang sejalan dengan

perkembangan embrio.

Hasil penelitian pada morfologi buah, didapatkan morfologi buah AbSB1

dan AbSB2 sangat berbeda dengan buah normal dan AbB. Karakteristik buah

AbB yaitu karpel tambahan terpisah satu dengan yang lain dan juga terpisah dari

karpel utama sampai seperdua dari bagian buah kemudian bersatu dengan karpel

utama. Ciri buah AbSB1 yaitu karpel tambahan saling terpisah dan juga terpisah

dari karpel utama sampai pangkal buah, sedangkan AbSB2 karpel tambahan

sangat jelas terpisah tetapi menyatu dengan karpel utama dengan mesokarp

berkayu. Hasil penelitian kandungan metilasi sitosin pada buah nampak tidak

berhubungan dengan tingkat keabnormalan tersebut atau semakin abnormalnya

buah tidak sejalan dengan semakin menurun atau meningkatnya metilasi DNA.

Demikian juga karakteristik keadaan mesokarp pada buah AbSB tidak

berhubungan dengan perubahan metilasi DNA pada jaringan tanaman tersebut.

115

SIMPULAN

(1) Pada tanaman normal, status metilasi sitosin DNA genom spesifik dengan

jaringan. Sitosin termetilasi pada jaringan bunga lebih rendah (49.20%)

dibandingkan dengan jaringan daun dan buah (53.90% dan 52.27%).

(2) Pada tanaman berbunga abnormal, terjadi hipometilasi pada jaringan daun

(1.31-4.01%) dan hipermetilasi pada jaringan bunga (0.69-2.66% ) jika

dibandingkan dengan jaringan pada tanaman normal. Namun tidak ada

perubahan metilasi pada jaringan buah.

(3) Perubahan status metilasi yang terjadi pada jaringan daun dan bunga tidak

berhubungan dengan abnormalitas pada jaringan bunga.

(4) Tingkat abnormal pada bunga dan buah tidak berhubungan dengan

bertambah atau berkurangnya metilasi DNA genom.