37

BAB V

KESIMPULAN, SARAN DAN RINGKASAN

V.1. Kesimpulan

Metode pewarnaan imunohistokimia dengan antibodi anti PGP 9.5 paling

optimal didapatkan pada irisan tipis, dengan antigen retrieval suhu rendah dan

pengenceran antibodi 1:2000 yang diinkubasi selama 1 malam pada suhu 21°C.

V.2. Saran

1. Perlu konsistensi teknik dalam melakukan pewarnaan ini.

2. Perlu dipertimbangkan penggunaan avidin dan biotin untuk kualitas hasil

yang lebih baik.

3. Penggunaan perangkat lunak meningkatkan kesahihan penghitungan

serabut saraf intraepidermal secara stereologi.

38

V.3. Ringkasan

V.3.A. Latar Belakang

Serabut saraf intraepidermal merupakan cabang akhir saraf sensorik yang

berada dalam jaringan kulit. Serabut ini merupakan salah satu parameter diagnosis

neuropati. Neuropati dinilai dengan adanya penurunan densitas serabut saraf

intraepidermal. Data tersebut didapatkan melalui irisan jaringan sampel kulit.

Oleh karenanya serabut saraf intraepidermal harus dapat divisualisasi dengan

pewarnaan ini untuk mengenali penanda yang diekspresikan oleh serabut tersebut

salah satunya protein gene product 9.5 (PGP 9.5). Berbagai penelitian telah

memvisualisasi serabut tersebut dengan antibodi anti PGP 9.5. Akan tetapi

penelitian tersebut berbeda metode pewarnaan imunohistokimianya.

Deteksi serabut saraf intraepidermal dapat menggunakan jaringan blok

parafin dengan irisan tipis (< 20 µm). Keunggulan irisan tipis adalah penetrasi

antibodi yang digunakan lebih cepat dan baik serta tidak memerlukan alat potong

dan mikroskop khusus. Penggunaan label HRP pada imunohistokimia memiliki

keunggulan menghasilkan gambaran struktur jaringan yang lebih lama diamati

dibandingkan label fluoresen.

Untuk mendapatkan hasil visualisasi serabut saraf intraepidermal yang

dapat dikuantifikasi maka teknik pewarnaannya harus tepat. Pada penelitian ini

akan dilakukan pengoptimuman pewarnaan imunohistokimia dengan antibodi anti

PGP 9.5 (Abcam ab8189) untuk mendeteksi serabut saraf intraepidermal di

laboratorium sederhana dengan menggunakan jaringan dari blok parafin.

39

V.3.B. Landasan Teori

Pada saraf tepi ini terdapat serabut saraf yang bermyelin dan tidak

bermyelin (Birch, 2011; Topp dan Boyd, 2011). Serabut tidak bermyelin

merupakan serabut aferen terdapat pada kulit (serabut saraf intraepidermal atau

ujung saraf bebas) (Liu et al., 2014) yang berasal dari dermis dan menjulur ke

epidermis (Mescher, 2011). Serabut saraf ini mengekspresikan penanda protein

gene product 9.5 (PGP 9.5) (Fuertes et al., 2013). Sehingga penanda ini dapat

digunakan untuk memvisualisasikan serabut saraf intraepidermal dengan metode

imunohistokimia (Fuertes et al., 2013). Untuk menghasilkan pemeriksaan

imunohistokimia yang baik maka diperlukan pengoptimumam metode.

Pengoptimuman ini dapat dilakukan mulai dari ketebalan irisan jaringan, proses

antigen retrieval serta pengenceran, suhu dan lama inkubasi antibodi primer PGP

9.5. (Fuertes et al., 2013; Provitera et al., 2015).

V.3.C. Cara Penelitian

Penelitian ini menggunakan hewan coba mencit strain Balb/cJ jantan, usia

8 minggu, berat badan (BB) 25 - 40g, sebanyak 2 ekor. Mencit dinekropsi

menggunakan skin punch biopsy diameter 5 mm pada kaki kanan mulai dari

bagian posterior jari kaki. Hasil biopsi ditanam dalam gel agarose 5% dan

diinkubasi 1 malam dalam fiksatif paraformaldehid 4%, lalu dibuat blok parafin.

Pemotongan blok parafin dengan ketebalan 4 dan 15 µm secara serial dengan

perhitungan fraksi 1/20.

40

Hasil potongan sampel kemudian dilakukan pengoptimuman pewarnaan

imunohistokimia dengan antibodi primer PGP 9.5. Pengoptimuman ini dilakukan

beberapa tahap, dengan berbagai modifikasi pada antibodi primer : Pengenceran :

1:500, 1:1000 dan 1:2000, suhu inkubasi : 21°C dan 24°C, lama inkubasi : 1

malam (Overnight), 2 malam dan 3 malam. Ketebalan irisan kulit kaki mencit 4

µm dan 15 µm. Antigen retrieval Penggunaan Antigen retrieval atau tidak. Suhu

Antigen retrieval : Suhu tinggi dan suhu rendah. Pengamatan dilakukan dengan

menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 1000x dan perangkat lunak

optilab. Data yang diperoleh berupa gambaran serabut saraf intraepidermal.

Analisis hasil pewarnaan imunohistokimia dilakukan secara kualitatif.

V.3.D. Hasil

Pengoptimuman pewarnaan imunohistokimia menggunakan antibodi anti

PGP 9.5 didapati hasil yang tidak konsisten. Pengenceran antibodi primer yang

paling baik dengan warna seimbang adalah 1:2000, lama inkubasi overnight pada

suhu 21°C. Ketebalan irisan jaringan 4 µm merupakan yang paling mungkin

dilakukan karena ketebalan 15 µm berisiko lepas atau melipatnya jaringan setelah

antigen retrieval, dan paling baik dilakukan antigen retrieval pada suhu rendah.

V.3.E. Kesimpulan

Metode pewarnaan imunohistokimia dengan antibodi anti PGP 9.5 paling

optimal dilakukan pada irisan tipis, dengan antigen retrieval suhu rendah dan

pengenceran antibodi 1:2000 yang diinkubasi selama 1 malam pada suhu 21°C.