BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN - repository.ump.ac.idrepository.ump.ac.id/1728/5/FITRI KURNIAWATI, BAB...

22

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Perijinan Ethical Clearance

Perijinan ini diajukan kepada komisi Etik Penelitian Kedokteran FKIK dan

dilakukan di Fakultas Kedokteran Universitas Jendral Soedirman. Telaah

etik ini mengacu pada kaidah etik yang tertera pada Deklarasi Helsinki

tahun 2008. Hasil perijinan menyatakan bahwa penelitian ini telah

memenuhi kaidah etik dan prosedur-prosedurnya telah disetujui. Hasil

perijinan dapat dilihat pada Lampiran 1.

B. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika,

Progran Studi Pendidikan Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah

Purwokerto. Determinasi ini bertujuan untuk mengetahui kebenaran

identitas tanaman yang akan digunakan pada penelitian. Determinasi ini

dilakukan berdasarkan karakteristik tanaman sehingga dapat menghindari

kesalahan dalam pengumpulan bahan. Pedoman yang digunakan adalah

buku Flora of Java (Backer dan Bakhuizen Van Den Brink volume I

tahun 1963. Hasil determinasi tanaman binahong adalah sebagai berikut:

Gambar 3. Hasil determinasi tanaman (lampiran 2)

22

TOKSISITAS AKUT EKSTRAK…, FITRI KURNIAWATI, FAKULTAS FARMASI UMP, 2014

23

C. Pembuatan Simplisia

Pembuatan serbuk simplisia dimulai dengan pengumpulan daun

binahong di daerah Purwokerto. Daun binahong yang telah diperoleh

sebanyak 3 kg dibersihkan dari kotoran kemudian dicuci dengan air

mengalir untuk menghilangkan sisa kotoran yang masih menempel.

Daun binahong yang telah dicuci kemudian ditiriskan untuk

menghilangkan air yang masih tersisa pada daun, kemudian dikeringkan

menggunakan lemari pengering selama 3 hari. Pada saat pengeringan daun

ditata agar tidak bertumpuk sehingga pengeringan berlangsung cepat dan

merata. Pengeringan ini bertujuan untuk menghilangkan kandungan air

dalam daun sehingga didapat simplisia yang tidak mudah rusak dan

terhindar dari tumbuhnya jamur dan bakteri. Daun binahong yang telah

kering diserbukan dengan mesin penyerbuk yang bertujuan meningkatkan

efektifitas penyarian dimana penyarian akan bertambah baik bila luas

permukaan serbuk semakin luas (Depkes RI, 1986) dan serbuk yang

didapat sebanyak 250,82 gram, kemudian serbuk ini diayak dengan

menggunakan ayakan 20/40, sehingga diperoleh serbuk halus sebanyak

177,93 gram. Pengayakan bertujuan untuk menyeragamkan ukuran serbuk

sehingga sari yang didapat efektif.

C. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Binahong.

Ekstrak daun binahong dibuat dengan menggunakan metode

maserasi dengan penyari etanol 70%. Pemilihan etanol sebagai pelarut

adalah karena etanol merupakan pelarut yang memiliki kepolaran yang

mirip dengan air sehingga dapat menarik zat aktif yang terdapat dalam

daun binahong. Pemilihan etanol dengan konsentrasi 70% karena dalam

larutan tersebut mengandung 50% etanol dan 30% air, sehingga zat aktif

yang terdapat dalam daun binahong yang larut dalam air maupun larut

dalam etanol dapat terekstraksi secara bersamaan. Maserasi adalah metode

penyarian simplisia yang paling sederhana yang dilakukan dengan

merendam serbuk simplisia dengan cairan penyari. Cairan penyari akan

masuk ke dinding sel, kemudian ke rongga sel yang megandung zat aktif,


24

sehingga terjadi perbedaan konsentrasi antara zat di dalam dan zat di luar

sehingga menyebabkan zat aktif yang terlarut terdesak keluar sel (Depkes

RI, 1986).

Metode maserasi dimulai dengan membasahi serbuk simplisia

dengan cairan penyari selama 15 menit yang bertujuan untuk memudahkan

penyarian zat aktif. Selanjutnya serbuk daun binahong yang telah dibasahi,

direndam dengan etanol 70% dengan perbandingan 1:10 yaitu 177,93 :

1800 mL etanol 70% kemudian diaduk setiap 30 menit selama 3 hari.

Tujuan pengadukan adalah untuk menjaga derajat perbedaan konsentrasi

antara larutan di dalam sel dengan larutan di luar sel. Endapan I dan filtrat

I dipisahkan dengan cara disaring lalu diperas. Endapan I yang didapat

direndam kembali (diremaserasi), dengan menggunakan etanol 1:5,

kemudian di aduk selama 30 menit selama 2 hari. Remaserasi sebanyak 3

kali. Filtrat III disatukan dengan campuran filtrat I dan II dengan total

volume filtrate yang diperoleh 1 liter dan jumlah pelarut yang digunakan

adalah 3600 ml. Filtrat hasil maserasi diuapkan menggunakan evaporator

sampai kental dan penguapan dilanjutkan dengan menggunakan waterbath

sampai tidak berbau etanol. Ekstrak kental yang didapat berwarna hijau

kehitaman dengan berat 57,29 gram dan rendemen akhir didapat 32,198%

dari serbuk kering. Ekstrak kental yang diperoleh kemudian digunakan

untuk uji toksisitas akut. Perhitungan rendemen adalah:

D. Uji Pendahuluan (sighting study)

Uji pendahuluan (Shighting study) ini mengacu pada OECD

(Organization for Economic Co-Operation and Development Guidlines for

Testing of Chemicals number 420 (OECD, 2001). Sighting study dilakukan


25

untuk mendapatkan dosis tertinggi yang menyebabkan kematian dan akan

digunakan untuk uji toksisitas (main study). Pada sighting study

menggunakan 3 hewan uji, pemberian preparat uji dimulai dari dosis 300

mg/kgBB sebanyak 2 mL akuades secara peroral karena belum ada

informasi toksisitas mengenai daun binahong (OECD, 2001). Pengamatan

selama 24 jam meliputi gejala efek toksik dan kematian pada hewan uji.

Gejala efek toksik yang diamati berupa perilaku (kecemasan,

keberangsangan, agresif dan ketakutan), saluran cerna (diare, muntah tinja

berdarah), kulit (kerontokan rambut, kulit kemerahan dan udema). Setelah

pengamatan 24 jam tidak terdapat kematian pada hewan uji. Kemudian

pada hari berikutnya dosis dinaikan menjadi 2000 mg/kg BB,

menggunakan 3 ekor hewan uji, kemudian diamati lagi gejala efek toksik

dan kematian hewan uji seperti pada dosis 300 mg/kgBB selama 24 jam.

Tabel perhitungan dosis dapat dilihat pada Lampiran 3.

Pengamatan selama 24 jam tidak ditemukan gejala efek toksik

maupun kematian pada hewan uji, sehingga dosis yang digunakan pada

main study adalah 2000 mg/kgBB yang berarti LD50 yang didapat untuk

ekstrak etanol daun binahong termasuk berdasarkan GHS (Globally

Harmonized System for Chemical Substant and Mixtures) pada kategori 4

dimana LD50 berkisar >300 mg/kgBB ≤ 2000 mg/kgBB. Tabel hasil

pengamatan gejala efek toksik terlampir pada Lampiran 4. Gambar

klasifikasi GHS terlampir pada Lampiran 5.

E. Uji utama (Main study)

Pada uji utama digunakan 10 tikus yang dibagi menjadi 2

kelompok, yaitu kelompok kontrol dan kelompok perlakuan. Bagan uji

utama dapat dilihat pada Gambar 4.

10 tikus

5 tikus (kontrol)

akuades

5 ekor tikus (uji)

2000 mg/kg BB

Berat badan, gejala efek toksik (kegelisahan, keberangasan, agresif, ketakutan,kebingungan

muntah, diare, tinja berdarah, kerontokan bulu, kulit kemerahan), fungsi darah (sel darah merah

dan sel darah putih), fungsi hati (SGOT, SGPT, bobot hati dan histopatologi hati), fungsi ginjal

(urea darah, bobot organ ginjal dan histopatologi ginjal)


26

Hewan uji ditempatkan di masing-masing kandang dengan tujuan

agar hewan uji memiliki ruang lebih luas sehingga diharapkan hewan uji

tidak stress, juga nutrisi dan air minum juga terpenuhi. Alas kandang

menggunakan sekam yang berfungsi untuk mempertahankan suhu agar

hewan uji tidak kedinginan sehingga menyebabkan kematian pada hewan

uji. Sekam diganti 2 hari sekali untuk mempertahankan kebersihan

kandang karena sekam juga cepat lembab, sehingga dapat mencegah

terjadinya infeksi. Hewan uji diberi makan ±28,5 gram per hari yang

diberikan untuk 2 kali pemberian pakan yaitu jam 08.00 dan 16.00.

Pemberian pakan sebanyak 200 gram perminggu bertujuan untuk

mengontrol pemberian pakan sehingga dapat meminimalisir kondisi lain

yang dapat menyebabkan toksisitas pada hewan uji, sehingga efek toksik

atau kematian yang terjadi benar-benar di karenakan pemberian ekstrak

etanol daun binahong. Kelompok kontrol hanya diberi akuades 2 mL,

sedangkan kelompok perlakuan diberi ekstrak etanol daun binahong

sebanyak 2 mL yang mengandung ekstrak etanol daun binahong dosis

2000 mg/kg BB, perhitungan dosis pada uji utama dapat dilihat pada

Lampiran 6. kemudian diamati berat badan, gejala efek toksik, fungsi

darah, biokimia darah, bobot organ hati dan ginjal dan histopatologi hati

dan ginjal.

1. Gejala efek toksik

Pengamatan gejala efek toksik dilakukan selama 5 menit sebanyak

tiga kali sehari selama 14 hari, tujuannya untuk mengetahui gejala

yang timbul setelah pemberian sediaan uji. Pengamatan dilakukan

selama 14 hari setelah pemberian ekstrak etanol daun binahong dosis

2000 mg/kg BB secara peroral pada kelompok perlakuan dan

kelompok kontrol. Hasil pengamatan menunjukan tidak adanya gejala

efek toksik dan dapat dilihat pada Lampiran 7.

Pengamatan gejala efek toksik dilakukan pada tanda-tanda

ketoksikan yang dapat dilihat secara langsung. Gangguan saluran cerna

Gambar 4. Gambar uji utama


27

seperti diare dan muntah sering dihubungkan dengan gejala efek

toksik. Diare terjadi karena adanya gangguan resorpsi air dan

terjadinya hipersekresi sehingga menyebabkan penumpukan cairan di

usus. Proses resorpsi dan proses sekresi berjalan dalam waktu yang

bersamaan dimana proses resorpsi lebih cepat dari proses sekresi,

proses resorpsi diatur oleh hormon enkefalin dan proses sekresi diatur

oleh prostaglandin tetapi karena sesuatu sebab, sekresi menjadi lebih

besar dari resorpsi sehingga menyebabkan diare. Penyebab diare bisa

berupa agen pengiritasi atau pengkorosi, arsen, detergen, keracunan

jamur, infeksi, alergi makanan dan zat asing lainnya. Iritasi dan

inflmasi gastrointestinal berkaitan dengan sakit perut yang

menyebabkan translokasi endotoksin dan bakteri ke dalam sirkulasi

sistemik dan mengakibatkan diare dan jika zat asing yang

menyebabkan iritasi saluran cerna tidak segera dikeluarkan akan

menyebabkan pendarahan pada saluran cerna dan menyebabkan tinja

berdarah (Tjay dan Rahardja, 2007).

Muntah adalah pengeluaran isi lambung yang disebabkan oleh

kontraksi otot perut yang kuat yang dianggap sebagai reaksi

perlindungan alamiah terhadap zat-zat yang merangsang seperti racun

dan makanan juga obat-obatan. Rasa mual menandakan lambung

sedang mengendur dan terjadi aktivitas antiperistaltik diusus halus

sehingga terjadi pembalikan isi usus halus ke bagian atas lambung,

disusul dengan menutupnya glottis (bagian pangkal tenggorokan),

penahanan nafas, katup esophagus dan lambung merelaks, sehingga

menimbulkan kontraksi dari diagfragma serta otot-otot pernafasandan

menyebabkan muntah. Penyebab muntah adalah adanya penghalang

pada saluran nafas seperti toksikan dan zat asing, trakeobronkhitis,

bronkopneumonia sekunder akibat kontaminasi pada saluran nafas.

Gejala efek toksik pada kulit sperti kerontokan bulu, kulit kemerahan

dan terjadinya udem dapat terjadi karena absorpsi senyawa toksik

secara oral maupun absorpsi secara transdermal (Tjay dan Rahardja,


28

2007). Pengamatan gejala efek toksik yang berupa perilaku hewan

dilakukan selama 5 menit, dimana gejala efek toksik yang diamati

berupa kegelisahan, keberangasan, agresif, ketakutan, kebingungan.

2. Pengamatan Berat badan

Berat badan tikus ditimbang setiap hari dengan tujuan untuk

mengetahui perubahan berat badan selama 14 hari. Data pengukuran

berat badan kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dapat dilihat

pada Tabel 2. Data pengukuran berat badan dapat dilihat pada Tabel

3. Hasil penimbangan hewan uji selama 14 hari terdapat pada

Lampiran 8.

Tabel 2. Pengukuran berat badan hewan uji pada kelompok kontrol dan

kelompok perlakuan

Waktu

Berat badan (gram)

P value Kontrol Perlakuan

H-1

H+7

H+14

139,5±16,78

169,8±10,65

168,8±16,57

153,8±22,40

184,1±17,65

188,1±6,73

0,287

0,162

0,043

nilai yang tertera adalah nilai rata ± standar deviasi, n = 10, kelompok kontrol 5

ekor hewan uji dan kelompok perlakuan 5 ekor hewan uji.

Tabel 3. Hasil analisis statistik berat badan pada kelompok perlakuan

Waktu Perlakuan P value

H-1 vs H+7

H-1 vs H+14

-30,30±36,09

-34,31±28,36

0,134

0,054

nilai yang tertera adalah nilai rata ± standar deviasi, n = 10, kelompok kontrol

5 ekor hewan uji dan kelompok perlakuan 5 ekor hewan uji.

Hasil perhitungan statistik menggunakan uji T tidak berpasangan,

nilai rataan sebelum perlakuan (H-1) dan pada H+7 pada kelompok

perlakuan dan kelompok kontrol p value yang diperoleh masing 0,287

dan 0,162 (P>0,05), yang berarti tidak terdapat perbedaan berat badan

yang signifikan antara kelompok kontrol dan perlakuan baik itu pada

H-1 maupun H+7. Tetapi hal ini tidak terjadi pada H+14 dimana


29

terdapat perbedaan berat badan yang signifikan antara kelompok

perlakuan dan kelompok kontrol (P<0,05).

Tabel 4. Tabel komposisi pakan hewan uji (hi-pro-vit)

komposisi

Kadar air

Protein

Lemak

Serat

Abu

Kalsium

Fospor

minimal

minimal

maksimal

maksimal

minimal

minimal

13,0%

17,5-19,5%

3,0%

8,0%

7,0%

0,90%

0,60%

Selain menggunakan perhitungan uji T tidak berpasangan,

digunakan juga uji T berpasangan untuk membandingkan perubahan

berat badan inter kelompok perlakuan. Hasil yang diperoleh adalah

tidak terdapat perubahan berat badan pada H-1 vs H+7 (p > 0,05)

namun ada perubahan yang nyata pada H-1 vs H+14 pada kelompok

perlakuan. Karena pada uji T tidak berpasangan pada H+14

menunjukan perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dan

kelompok perlakuan, sehingga diduga peningkatan berat badan terjadi

karena pemberian ekstrak etanol daun binahong. Diduga perubahan

yang signifikan terjadi karena adanya senyawa saponin yang dapat

meningkatkan permeabilitas dinding usus, sehingga meningkatkan

absorpsi makanan (komposisi nutrisi pakan hewan uji dapat dilihat

pada Tabel 4), selanjutnya akan meningkatkan nafsu makan hewan

uji dan akhirnya akan meningkatkan berat badan (Cheeke, 1989).

Selain itu, menurut Yi Liang et al (2010), dalam Anredera cordifolia

terdapat nutrisi seperti protein, vitamin C dan mineral, sehingga di

duga pada H+14 terjadi penyerapan kandungan ekstrak daun

binahong yang optimal, sehingga berat badan hewan uji meningkat.


30

3. Uji hematologi

Pada uji hematologi digunakan sampel darah. Pada uji hematologi

digunakan sampel darah. Darah merupakan sarana penyebaran hormon

dan penyampaian pesan kimiawi terhadap organ-organ lain yang

berjauhan untuk menjalankan fungsinya. Darah diambil sebanyak ±0,5

ml dengan cara menyayat ekor tikus yang sebelumnya telah

dibersihkan dengan alkohol, kemudian darah ditampung ke dalam

tabung reaksi yang telah berisi antikoagulan EDTA. Data hasil jumlah

eritrosit terlampir pada Lampiran 9.

Tabel 5. Hasil pengukuran eritrosit pada kelompok kontrol dan kelompok

perlakuan

H-1 H+1 H+7 H+14

kontrol (106/mm

3)

Perlakuan (106/mm

3)

P value

7,93±1,63

8,02±1,03

0,921

10,16±2,39

8,08±2,93

0,254

16,06±7,18

14,56±5,88

0,727

6,40±2,46

7,36±1,43

0,473



Tabel 6. Hasil analisis statistik eritrosit pada kelompok perlakuan sebelum dan

setelah perlakuan

H-1 vs H+1 H-1 vs H+7 H-1 vs H+14

Eritrosit (106/

mm3)

P value

-0,06±2,93

0,966

-6,54±4,99

0,043

0,66±0,66

0,090



Penghitungan jumlah sel darah merah perlu ditambahkan larutan

hayem, Larutan hayem mengandung 5 gr Na-sulfat, 1 gr NaCl, 0,5 gr

HgCl2 dan aquadest ad 100 mL. Larutan hayem berfungsi sebagai

pengencer sehingga memudahkan dalam penghitungan sel darah merah

karena harus bersifat isotonis dan fiksatif terhadap eritrosit. Eritrosit di

pilih dalam penelitian ini karena eritrosit berperan dalam penghantaran

oksigen melalui pengikatan dengan hemoglobin dan kemudian di


31

edarkan ke seluruh tubuh, sehingga dapat dikatakan bahwa darah

merupakan sumber kehidupan.

Nilai rataan eritrosit kelompok kontrol dan perlakuan masing pada

H-1 berkisar 7 juta sampai 8 juta. Hal ini masih normal seperti yang

disebutkan oleh Anonim (2010) yang menyebutkan bahwa nilai normal

eritrosit pada tikus adalah 7x106 – 13x10

6/mm

3. Analisis uji T

berpasangan dilakukan untuk mengetahui perubahan hematologi pada

kelompok perlakuan dengan membandingkan H-1 dengan H+1, H-1

dengan H+7 dan H-1 dengan H+14. Hasil analisis tersebut menunjukan

jumlah eritrosit pada H-1 vs H+1, H-1 vs H+14 tidak berubah secara

signifikan sedangkan pada H-1 dengan H+7 terdapat perubahan nilai

hematologi yang signifikan (P<0,05). Pada kelompok perlakuan dan

kelompok kontrol (dapat dillihat pada Tabel 3.) Jumlah eritrosit pada

H+1 dan H+7 meningkat dan pada H+14 menurun.

Seharusnya kandungan flavonoid dan saponin dalam ekstrak etanol

daun binahong dapat meningkatkan jumlah eritrosit namun hasil uji T

tidak berpasangan menunjukan tidak terdapat perbedaan yang nyata

antara kelompok kontrol dan perlakuan. Sehingga dapat disimpulkan

ekstrak etanol daun binahong tidak mempengaruhi jumlah eritrosit

pada hewan uji namun peningkatan eritrosit pada kelompok ini diduga

disebabkan kondisi dari hewan uji seperti faktor umur, aktivitas tubuh,

gizi dan keadaan lingkungan (Triana dan Nurhidayat, 2006).

Flavonoid dalam ekstrak daun binahong dapat meningkatkan

jumlah eritrosit. Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang dapat

menangkap radikal bebas dengan jalan menghambat pembelahan sel.

Di dalam tubuh radikal bebas tetap diproduksi melalui kegiatan

metabolisme sehari-hari. Radikal bebas tersebut bersifat prooksidasi

(pemicu oksidasi). Pembentukan prooksidasi normalnya seimbang

dengan pembentukkan antioksidan di dalam tubuh. Sel darah merah

menghasilkan radikal bebas, sehingga dengan penambahan flavonoid

sebagai penangkal radikal bebas, akan mengurangi produksi sel darah


32

merah sehingga agar tetap seimbang antara prooksidasi dengan

antioksidan, maka jumlah sel darah merah meningkat (Sundaryono,

2011). Saponin juga dapat meningkatkan eritrosit melalui hemolisis

(pemecahan eritrosit), terjadinya hemolisis akan merangsang sumsum

tulang untuk memproduksi eritrosit dalam bentuk retikulosit (pra

eritrosit) (Nijveld, 2001; Nadjeeb, 2010; Frandson, 1992).

Leukosit terlibat dalam pertahanan seluler dan humoral dari zat-zat

toksik dan rangsangan infeksi dalam tubuh. Sel darah putih dapat

dihitung dengan menggunakan larutan pengencer turk. Larutan turk

mengandung larutan gentian violet 1% dalam 1 mL air, asam asetat

glacial 1 mL, aquadest ad 100 mL. Larutan gentian violet berfungsi

memberikan warna pada inti dari granula leukosit dengan memecah

eritrosit dan trombosit (Sundaryono, 2011). Hasil pengukuran jumlah

leukosit antara kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan dapat

dilihat pada Tabel 7. Hasil pengukuran jumlah leukosit pada kelompok

perlakuan sebelum dan sesudah pemberian sediaan uji dapat dilihat

pada Tabel 8. Data hasil jumlah leukosit terlampir pada Lampiran 9.

Tabel 7. Hasil pengukuran leukosit pada kelompok kontrol dan kelompok

perlakuan

H-1 H+1 H+7 H+14

kontrol (103/mm

3)

Perlakuan(103/mm)

P value

4.52±1645.2

5.36±0.551

0.897

7.62±1248.7

7.71±0.855

0.330

8.60±1200

8.07±1236.2

0.511

7.680±1242.2

7.93±1150.8

0.750



Tabel 8. Hasil analisis statistik leukosit pada kelompok perlakuan sebelum dan

setelah perlakuan

H-1 vs H+1 H-1 vs H+7 H-1 vs H+14

Leukosit(103/

mm3)

P value

-3,10±1,23

0,005

-3,55±2,51

0,034

-3,41±1,87

0,015




33

Nilai rataan jumlah leukosit pada H-1 pada kelompok perlakuan

dan kontrol masing-masing 4,52±1,645dan 5,36±0,551 dimana kisaran

ini masih normal untuk tikus dewasa, yaitu 5000-12000/mm3 (Anonim,

2010). Pada uji T berpasangan pada kelompok perlakuan terdapat

peningkatan jumlah leukosit secara signifikan (P<0,05). Namun

setelah penghitungan secara statistik menggunakan uji T tidak

berpasangan menunjukan tidak terdapat perbedaan antara kelompok

kontrol dan perlakuan. Sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak

etanol daun binahong tidak mempengaruhi jumlah leukosit pada hewan

uji.

Peningkatan leukosit pada penelitian ini diduga karena luka

sayatan pada ekor tikus dapat menyebabkan inflamasi sehingga dapat

meningkatkan leukosit, juga karena infeksi cacing jenis trematoda

yang di temukan pada saat uji histopatologi. Perubahan jumlah leukosit

dapat dipengaruhi oleh keadaan fisiologi maupun patologis dari hewan

uji. Pengaruh fisiologi dapat berupa aktivitas otot, rangsangan

ketakutan dan gangguan emosional. Sedangkan pengaruh patologis

bisa berupa rangsangan terhadap suatu penyakit (Ganong, 1999)

4. Uji Biokimia Darah

Pada pengukuran aktivitas enzim GPT digunakan sampel plasma.

Darah diambil dengan cara melukai pembuluh vena bagian ekor tikus,

kemudian ditampung ke dalam tabung reaksi yang telah berisi

antikoagulan EDTA dan sebelumnya telah dikalibrasi sebanyak 2 mL,

kemudian di sentrifuge dengan kesepatan 3000 rpm selama 10 menit.

Reaksi yang enzimatik GPT adalah sebagai berikut:

L-alanin + 2-Oksoglutarat ↔ L-Glutamat + Piruvat

Piruvat + NADH + H+ ↔D-Laktat + NAD

+

GPT yang terdapat dalam plasma akan bereaksi dengan L-alanin dan

2-Oksoglutarat dalam larutan buffer. GPT akan mengkatalisis

pemindahan gugus amino yang ada dalam L-alanin ke 2-oksoglutarat


34

sehingga akan menghasilkan piruvat dan L-Glutamat. 2-oksoglutarat

adalah enzim yang berperan sebagai sepasang donor dan akseptor pada

semua reaksi transfer amino. Piruvat yang dihasilkan akan bereaksi

dengan NADH dengan bantuan enzim LDH (lactat dehidrogenase)

dan akan menghasilkan D-Laktat dengan NAD+. NADH merupakan

enzim yang dapat di baca pada panjang gelombang 340 nm.

Pembacaan absorbansi pada sisa NADH yang tidak bereaksi.

Absorbansi yang kecil menandakan peningkatan NADH (Moss et al,

1996)

Hasil pengukuran enzim GPT antara kelompok kontrol dengan

kelompok perlakuan dapat dilihat pada Tabel 9. Hasil pengukuran

SGPT pada kelompok perlakuan sebelum dan sesudah pemberian

sediaan uji dapat dilihat pada Tabel 10. Data hasil pengukuran SGPT

terlampir dalam Lampiran 10.

Tabel 9. Hasil pengukuran GPT pada kelompok kontrol dan kelompok

perlakuan

H-1 H+1 H+7 H+14

kontrol (U/L)

Perlakuan (U/L)

P value

21,14±2,79

33,3±21,96

0,285

29,9±5,46

38,5±17,81

0,331

35,26±14,59

28,56±5,08

0,361

20,7±4,17

28,98±8,13

0,078



Tabel 10. Hasil pengukuran GPT pada kelompok perlakuan sebelum dan

setelah perlakuan

H-1 vs H+1 H-1 vs H+7 H-1 vs H+14

SGPT

P value

-5,22±20,31

0,596

4,74±24,47

0,687

4,32±24,60

0,715



Plasma darah merupakan larutan berair yang mengandung protein

plasma (albumin dan fibrinogen) sebanyak 7%, garam anorganik 0,9%


35

dan sebanyak 10% senyawa organik (asam amino, lipoprotein,

vitamin, hormon dsb).

Rataan nilai GPT hewan uji kelompok kontrol dan perlakuan

sebelum perlakuan (H-1) masing-masing adalah 21,14 U/L dan 33,3

U/L. Nilai rataan ini masih normal seperti yang disebutkan Fukuda

(2004) nilai GPT pada tikus wistar betina galur wistar berumur 2 bulan

sampai 6 bulan adalah 18,7-31,6 U/L. Hasil uji statistik T tidak

berpasangan pada H+1 dan H+7 kelompok kontol dapat dilihat terjadi

peningkatan nilai rataan aktivitas enzim GPT, sedangkan pada H+14

aktivitas enzim GPT menurun. Sedangkan pada kelompok perlakuan

H+1 terjadi peningkatan nilai rataan GPT dan pada H+7 terlihat

adanya penurunan dan nilainya tetap pada H+14. Meskipun terdapat

kenaikan dan penurunan nilai rataan GPT, nilai P masih menunjukan

angka > 0,05. Pada uji T berpasangan juga menunjukan tidak terdapat

perubahan aktivitas enzim yang signifikan (p>0,05). Sehingga dapat

disimpulkan bahwa peningkatan dan penurunan nilai GPT bukan

akibat pemberian ekstrak etanol daun binahong.

Pada pengukuran aktivitas enzim GOT digunakan sampel plasma.

Reaksi enzimatik GOT adalah sebagai berikut :

L-aspartat + 2-Oksoglutarat ↔ L-Glutamat + Oksaloasetat

Oksaloasetat + NADH + H+ ↔L-Malat + NAD

+

Enzim GOT yang terdapat dalam plasma akan bereaksi dengan L-

aspartat dan 2-oksoglutarat dalam larutan buffer. GOT akan

mengkatalisis pemindahan gugus amino yang ada dalam L-aspartat ke

2-oksoglutarat sehingga akan menghasilkan oksaloasetat dan L-

glutamat. 2-oksoglutarat berperan sebagai sepasang donor dan akseptor

pada semua reaksi transfer amino. oksaloasetat yang dihasilkan akan

bereaksi dengan NADH dengan bantuan enzim MDH (malate

dehidrogenase) akan menghasilkan L-Malat dengan NAD+. NADH

merupakan enzim yang dapat di baca pada panjang gelombang 340


36

nm. Pembacaan absorbansi pada sisa NADH yang tidak bereaksi

(Moss et al, 1996).

Hasil pengukuran enzim GOT antara kelompok kontrol dengan


GOT pada kelompok perlakuan sebelum dan sesudah pemberian

sediaan uji dapat dilihat pada Tabel 12. Data hasil pengukuran enzim

GOT terlampir pada Lampiran 11.

Tabel 11. Hasil pengukuran enzim GOT pada kelompok kontrol dan perlakuan

Parameter H-1 H+1 H+7 H+14

kontrol (U/L)

Perlakuan (U/L)

P value

66,44±14,8

85,94±24,11

0,162

98,16±1,19

118,2±40,81

0,337

139,8±41,911

07,3±21,77

0,163

94,78±18,12

99,26±23,32

0,743



Tabel 12. Hasil statistik enzim GOT pada kelompok perlakuan sebelum dan

setelah perlakuan

Waktu H-1 vs H+1 H-1 vs H+7 H-1 vs H+14

GOT

P value

-3,25±53,30

0,244

-21,44±27,61

0,158

-13,32±39,28

0,491



Nilai rataan GOT hewan uji pada H-1 adalah 66,44 U/L untuk

kelompok kontrol dan 85,94 U/L untuk kelompok perlakuan. Menurut

Fukuda (2004) nilai normal aktivitas enzim GOT pada tikus betina

galur wistar yang berumur 2-6 bulan berkisar antara 51,9-97,5 U/L.

Sehingga nilai GOT masih dikatakan normal. Pada H+1 dan H+7

kelompok kontrol terjadi peningkatan aktivitas enzim GOT dan terjadi

penurunan pada H+14. Sedangkan pada kelompok perlakuan terjadi

peningkatan aktivitas GOT pada H+1 dan penurunan pada H+7 dan

H+14. Meskipun terjadi peningkatan dan penurunan aktivitas enzim

GOT, namun menurut perhitungan statistik hal tersebut bukan


37

disebabkan oleh ekstrak etanol daun binahong (p>0,05), karena pada

kelompok kontrol pun menunjukan hal serupa dan hasil uji T

berpasangan menunjukan tidak terdapat perubahan aktivitas enzim

GOT yang signifikan pada kelompok perlakuan baik sebelum

perlakuan maupun setelah perlakuan (P>0,05). Peningkatan dan

penurunan aktivitas enzim GPT dan GOT dapat disebabkan oleh bobot

badan hewan uji, terjadinya hemolisis, reaksi biokimia, fisika atau

kimia, perbedaan fisiologi dan makro enzim dari individu hewan uji

dan stress akibat pencekokkan sediaan uji (Girindra, 1989). Degenerasi

melemak yang terlihat pada hasil histopatologi bukan disebabkan

karena nilai GOT dan GPT. Karena nilai GOT dan GPT menurut Sass

(2005) tidak mempengaruhi secara signifikan terhadap terjadinnya

degenerasi melemak namun yang berpengaruh adalah rasio GOT

terhadap GPT.

Urea merupakan zat hasil metabolisme yang tidak diperlukan oleh

tubuh, sehingga harus dibuang oleh ginjal dalam bentuk urin.

Kerusakan pada ginjal, akan menyebabkan penumpukan urea di dalam

darah. Reaksi enzimatik urea adalah sebagai berikut:

Urea + 2 H2O + → 2 NH4+ + 2 CO3

-

2-Oksoglutarat + NH4+ +NADH + →L-Glutamat + NAD

+ + H2O

Urea ditambah dengan air membentuk 2 amonium dan

karbondioksida dengan bantuan enzim urease yang ada dalam plasma.

Amonium akan bereaksi dengan 2-oksoglutarat dan NADH dengan

bantuan enzim GLDH (Glutamat Dehidrogenase) menjadi L-glutamat,

NAD+

serta air. Yang di ukur adalah NADH yang akan berubah

menjadi NAD+.

Semakin rendah nilai absorbansi maka semakin banyak

NADH yang digunakan untuk reaksi. Berarti kadar urea semakin

tinggi.


38

Hasil pengukuran enzim urea antara kelompok kontrol dengan


urea pada kelompok perlakuan sebelum dan sesudah pemberian

sediaan uji dapat dilihat pada Tabel 14. Data hasil pengukuran urea

terlampir dalam Lampiran 12.

Tabel 13. Hasil pengukuran urea darah pada kelompok kontrol dan perlakuan

Parameter H-1 H+1 H+7 H+14

kontrol (mg/dL)

Perlakuan (mg/dL)

34,80±9,88

36,80±14,20

31,20±3,67

43,40±29,33

31,40±3,91

27,60±4,00

28,20±5,54

34,00±5,03

P value 0,803 0,388 0,329 0,862


ekor hewan uji dan kelompok perlakuan 5 ekor hewan uji

Tabel 14. Hasil hasil analisis statistik urea darah pada kelompok perlakuan

sebelum dan setelah perlakuan

Waktu H-1 vs H+1 H-1 vs H+7 H-1 vs H+14

Urea

P value

-6,60±24,52

0,580

9,20±12,15

0,166

2,80±15,03

0,699


ekor hewan uji dan kelompok perlakuan 5 ekor hewan uji

Kadar urea tikus betina galur wistar berumur 2-6 bulan menurut

Fukuda (2004) adalah 17-19,7 mg/dL. Kadar rataan urea hewan uji

pada H-1 adalah 34,80 -38,80 mg/dL nilai ini lebih besar dari normal.

Pada kelompok kontrol terlihat tidak terdapat kenaikan kadar urea

darah secara bermakna, namun pada kelompok perlakuan terdapat

peningkatan rataan kadar urea darah pada H+1 dan penurunan di H+7

dan H+14 namun tidak bermakna. Hasil uji T berpasangan tidak ada

perbedaan kadar urea yang bermakna antara kelompok kontrol dan

kelompok perlakuan (p>0,05), sehingga peningkatan kadar urea ini

bukan disebabkan oleh pemberian ekstrak etanol daun binahong. Uji T

berpasangan (P>0,05) yang berarti bahwa ekstrak etanol daun

binahong tidak mempengaruhi perubahan nilai urea darah hewan uji

pada sebelum dan setelah perlakuan.


39

Peningkatan urea di duga dari pakan hewan uji yang mengandung

banyak protein, sehingga meningkatkan kadar urea (lihat Tabel 4).

Protein yang dibutuhkan maupun yang tidak dibutuhkan tubuh akan

dimetabolisme oleh hati. Protein yang tidak dibutuhkan oleh tubuh

akan dipecah menjadi asam amino. Asam amino akan dipecah menjadi

urea. Asam amino yang tinggi karena konsumsi protein tinggi maka

kadar urea yang diekskresikan akan meningkatkan (Almatsier, 2006).

5. Bobot Organ

Organ hati dan ginjal merupakan organ penting dalam metabolisme,

detoksifikasi, penyimpanan, ekskresi xenobiotik dan metabolitnya

juga. Organ ini rentan terhadap kerusakan akibat metabolit yang

bersifat toksik, sehingga organ hati dan ginjal yang dipilih untuk uji

toksisitas (Brzoska et al., 2003). Hewan uji dibunuh dengan cara

dimasukan ke dalam bejana yang telah telah dijenuhi eter, kemudian

hewan uji dibedah mulai dari bagian perut sampai uterus menggunakan

pisau steril, organ hati dan ginjal diambil kemudian dibersihkan

dengan NaCL 0.9% selanjutnya ditiriskan diatas kertas kertas saring,

kemudian organ ditimbang menggunakan timbangan analitik

Shimadzu. Data hasil penimbangan bobot organ hati terlampir dalam

Lampiran 13.

Tabel 15. Bobot organ hati tikus pada kelompok kontrol dan kelompok

perlakuan

Organ

Bobot organ (gram)


Hati (g)

Berat relatif (%)

6,52±0,35

3,89

6,58±1.09

3,49

0,100



Rataan bobot organ hati pada kelompok kontrol dan kelompok

perlakuan adalah 6,52 gram dan 6,58 gram dengan bobot relatif hati

kelompok kontrol adalah 3,89% dan bobot relatif kelompok perlakuan

adalah 3,49%. Menurut Popp (1991) berat relatif normal organ hati


40

adalah 3,5%- 4,0%, sehingga berat organ hati kelompok perlakuan

masih dalam kisaran normal. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak

etanol daun binahong tidak mempengaruhi bobot organ hati. Hasil uji

T juga menunjukan (P>0,05) yang berarti tidak terdapat perbedaan

bobot organ yang signifikan antara kelompok kontrol dengan

kelompok perlakuan. Hal ini sejalan dengan penelitian Purwani et al

(2013) yang menyatakan bahwa flavonoid tidak mempengaruhi bobot

organ hati mencit.

Penurunan berat hati dapat terjadi karena gangguan hepatik akut dan

kronik. Peningkatan berat hati bisa bersifat adaptif maupun toksik,

tetapi umumnya bersifat adaptif. Peningkatan berat hati yang bersifat

adaptif seperti proliferasi retikulum endoplasma halus, peningkatan

kandungan sitokrom P-450, peningkatan metabolisme obat. Selain itu

peningkatan berat hati yang bersifat toksik, seperti hepatotoksikan

yang akan mengganggu struktur membran retikulum endoplasma,

menurunkan kandungan sitokrom P-450 dan menurunkan aktivitas

metabolisme obat (Popp, 1991 ;Lu, 1995). Data hasil penimbangan

bobot organ ginjal terlampir pada Lampiran 13.

Tabel 16. Bobot organ ginjal tikus pada kelompok kontrol dan kelompok

perlakuan

Ginjal

Bobot organ (gram)


Kanan

Berat relatif (%)

Kiri

Berat relatif (%)

0,55±0,06

0,32

0,52±0.08

0,30

0,57±0,05

0,30

0,56±0.05

0,29

0,647

0,411



Rataan bobot organ ginjal kanan dan kiri dan pada hewan uji

0,55±0,06 dan 0,52±0,08 dengan berat relatif 0,32 % dan 0,30 % untuk

kelompok kontrol dan 0,57±0.05 dan 0,56±0,05 dengan berat relatif


41

0,30 % dan 0,29 % untuk kelompok perlakuan, hal ini sejalan dengan

Sihombing (2011) melalui penelitiannya menyebutkan bahwa rataan

bobot organ ginjal tikus betina yang berumur 3 bulan adalah 0,520

gram.Hasil perhitungan statistik menunjukan bahwa tidak terdapat

perbedaan rataan berat organ ginjal kelompok kontrol dan kelompok

perlakuan (P>0,05). Lu (1995) menyebutkan bahwa bobot organ ginjal

merupakan indikator nefrotoksiksisistas yang paling peka, sehingga

meskipun nilai urea darah hewan uji lebih besar dari normal (dapat

dilihat pada Tabel 13), namun bobot organ dan tikus masih normal dan

pada uji histopatologi pun menunjukan tidak ditemukan perubahan

patologi maupun morfologi, sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa

ekstrak etanol daun binahong masih aman dan tidak mempengaruhi

bobot organ ginjal (Lu, 1995).

6. Histopatologi

Pemeriksaan histopatologi hati dilakukan terhadap 6 hewan uji,

dimana 3 ekor hewan uji yang termasuk pada kelompok kontrol dan 3

ekor kelompok perlakuan. Hasil histopato;ogi terlampir pada

Lampiran 14.

Tabel 17. Tabel hasil uji histopatologi organ hati dan ginjal hewan uji

Kode hati ginjal

Kontrol

F6

F7

F9

perlakuan

F1

F4

F5

DM++

DM+

DM+

DM+

DM++

DM+

TAP

TAP

TAP

TAP

TAP

TAP

Ket: F6, F7 dan F8: kelompok kontrol, F1, F4 dan F5: Kelompok perlakuan,

TAP: Tidak ada perubahan patologi, DM: Degenerasi Melemak


42

Pembacaan secara mikroskopik dilakukan pada tikus nomor 4 yang

mengalami pembentukan degenerasi melemak cukup parah. Setelah

pemberian ekstrak etanol daun binahong dosis 2000 mg/kg BB secara

peroral menunjukkan adanya degenasi melemak pada kelompok

kontrol dan kelompok perlakuan. Degenerasi melemak adalah

penimbunan lemak secara abnormal pada sel parenkim yang terdapat

dalam sitoplasma sel. Degenerasi melemak ditandai dengan adanya

vakuola lemak atau air (hidrofik) dalam sitoplasma dengan ukuran

yang besar maupun kecil, sehingga inti sel terdesak ke tepi sitoplasma

vakuola lemak yang dapat dilihat secara mikroskopik (Robbins dan

Kumar, 1992). Degenerasi melemak terjadi karena adanya gangguan

hepatosit (diet atau toksin) yang menyebabkan ketidakseimbangan

kecepatan penyerapan asam lemak dan sekresinya sebagai VLDL

(Very Low Density Lipoprotein) dalam sirkulasi sistemik.

Terhambatnya pembentukkan lipoprotein ini menyebabkan akumulasi

trigliserida dalam parenkim hati yang menyebabkan degenerasi

melemak (Popp, 1991). Penyebab degenerasi melemak adalah toksin,

malnutrisi protein, diabetes mellitus, obesitas dan anoksia (Suhita,

2013).

Gambar 5. Struktur histopatologi hati normal (kiri) Struktir

histopatologi hati Degenerasi melemak (kanan) yang

ditandai dengan adanya vakuola–vakuola berbagai

ukuran dengan batas jelas sitoplasma dan tampak

beberapa inti terdesak ke tepi.


43

Degenerasi melemak terjadi bisa karena induksi alkohol dan tanpa

diinduksi alkohol. Ciri-ciri degenerasi melemak yang diinduksi alkohol

gejala dan tanda berupa asimptomatik, perbandingan GOT dengan

GPT adalah >2 (Marsano et al, 2003). Degenerasi melemak tanpa

diinduksi alkohol dapat disebabkan karena resisten insulin, gangguan

metabolisme, nutrisi, penggunaan obat dan toksin (Sass et al, 2005).

Menurut Sass et al pada tahun 2005, penyakit degenerasi melemak

biasanya tidak disertai gejala, sehingga pada pengamatan efek toksik

tidak ditemukan gejala yang signifikan (Tabel 2).

Flavonoid sebagai antioksidan yang dapat mengurangi oksidasi

kolesterol LDL. Saponin dapat menurunkan kolesterol hati dan

menurunkan trigliserida sehingga dapat mencegah terjadinya

hiperkolesterolemia yang dapat menyebabkan hiperlipidemia yang

merupakan salah satu penyebab terjadinya degenerasi melemak pada

hati tanpa diinduksi alkohol (Knektm, 2007; Matsui, 2009). Ekstrak

etanol daun binahong mengandung senyawa flavonoid dan saponin.

Bedasarkan penelitian sebelumnya, senyawa tersebut seharusnya dapat

menurunkan kolesterol darah sehingga tidak menyebabkan degenerasi

melemak, tetapi dalam penelitian ini pada kelompok perlakuan

ditemukan adanya pembentukan degenerasi melemak. Ditemukannya

degenerasi melemak ini diduga sebelum dilakukannya penelitian,

hewan uji telah menderita degenerasi melemak karena perbandingan

GOT terhadap GPT >2 mulai dari sebelum perlakuan sampai H+14.

Degenerasi melemak terjadi karena pemberian makan dan minum yang

tidak teratur, kondisi kandang yang kurang ideal, faktor stress tikus,

pengaruh zat atau penyakit lain, serta faktor internal lain seperti daya

tahan tubuh dan kerentanan tikus terhadap pengaruh luar (Bhara,

2013).

Organ hati pada kelompok perlakuan no 6 dan kelompok kontrol no

5 ditemukan flek putih yang mengindikasikan infeksi cacing jenis


44

trematoda (caing daun) hati, namun kelompok cacingnya belum bisa

dipastikan. Salah satu jenis cacing trematoda hati adalah Fasciola

hepatica Penyebab infeksi Fasciola hepatica ini diduga karena

pengkonsumsian air minum yang tercemar cacing tersebut, sehingga

menimbulkan infeksi dan menyebabkan jumlah sel darah putih

meningkat (Tabel 8). Cacing terematoda adalah cacing yang secara

morfologi berbentuk pipih seperti daun. Salah satu jenis cacing

trematoda adalah trematoda hati (Fasciola hepatica). Cacing ini

dikeluarkan melalui empedu ke dalam tinja dalam keadaan belum

matang. Pematangan telur terjadi dalam air selama 9-15 hari dan

berisis mirasidium. Telur akan menetas dan mirasidium keluar mencari

keong air. Keong air mengeluarkan serkaria dan berenang mencari

hospes perantara kedua yaitu tumbuh-tumbuhan air dan membentuk

kista pada permukaan tumbuhan air. Bila tertelan, metasekaria menetas

dalam usus halus, menembus dinding usus dan bermigrasi dalam ruang

peritoneum hingga menembus hati, larva masuk ke saluran empedu

dan menjadi dewasa (Sutanto et al, 2008). Sehingga infeksi yang

terjadi pada hewan uji tidak disebabkan karena pemberian ekstrak

etanol daun binahong tetapi diduga disebabkan karena air minum yang

tercemar.

Gambar 6.Struktur histopatologi ginjal normal

Hasil histopatologi organ ginjal pada kelompok kontrol maupun

perlakuan tidak ditemukan perubahan patologi seperti nekrosis ataupun


45

degenarasi melemak. Hal ini menunnjukan bahwa pemberian ekstrak

etanol daun binahong tidak mempengaruhi fungsi ginjal dan masih

aman digunakan sampai dosis 2000 mg/kg BB. Ginjal merupakan

organ tubuh yang vital berfungsi mengeluarkan sisa-sisa metabolisme.

Kerusakan ginjal dapat dilihat berdasarkan perubahan struktur

histologi. Perubahan struktur histologi dapat dipengaruhi oleh jumlah

senyawa yang masuk ke dalam tubuh. Selain itu ada faktor lain yang

dapat menyebabkan kerusakan ginjal yaitu kemampuan ginjal dalam

mengkonsentrasikan xenobiotik di dalam sel. Ginjal akan

mengeluarkan sisa metabolisme dalam bentuk urin, zat kimia terlebih

dahulu diakumulasikan dalam tubulus proksimal untuk dikeluarkan

dari darah ke urin. Pada proses reabsorpsi senyawa yang tidak

dibutuhkan tubuh akan dibuang ke luar tubuhdan senyawa yang

dibutuhkan tubuh termasuk zat-zat toksik akan diserap kembali melalui

sel epitel tubulus dalam konsentrasi tinggi akibatnya akan terjadi

pemekatan dan zat-zat toksik ini akan terakumulasi di ginjal dan

menyebabkan kerusakan ginjal (Yuanita, 2008).


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN - repository.ump.ac.idrepository.ump.ac.id/1728/5/FITRI KURNIAWATI, BAB...

Documents

Transcript of BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN - repository.ump.ac.idrepository.ump.ac.id/1728/5/FITRI KURNIAWATI, BAB...