13

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bioteknologi UMM,

Laboratorium Biomed Fakultas Kedokteran UMM, dan screenhouse yang terletak

di Dusun Kasin, Desa Ampeldento, Kecamatan Karangploso, Malang. Kegiatan

penelitian dilaksanakan selama enam bulan, dari bulan Januari sampai dengan

bulan Juni 2018.

3.2. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah cawan petri diameter 9 cm,

mikroskop optilab, haemocytometer, kaca preparat, cover glass, beaker glass,

vortex homogenizer mortar-martil, plastik wrapping, hand sprayer, hand counter,

cellspreader, pisau, scalpel blade, pinset, gelas ukur, erlenmeyer, autoklaf, UV

LAF, mikropipet, aluminium foil, tisu, botol kultur, botol laboratorium, kain kasa,

dan kertas label.

Bahan yang digunakan adalah alkohol 70%, MgCl2, media PDA (Potato

Dextrose Agar), media PDB (Potato Dextrose Broth), media NA (Nutrient Agar),

media LB (Lysogeny Broth), methanol, kapas, akuades steril, pupuk organik cair

(POC), carborundum, tanaman cabai dan isolat CMV. Sampel tanaman yang

dieksplorasi adalah tanaman cabai sehat yang diambil secara acak di lahan petani

desa Gadingkulon, sedangkan untuk ekstraksi virus mosaik diambil dari tanaman

yang terinfeksi CMV.

14

3.3. Variabel Penelitian

Variabel penelitian ini terdiri dari dua jenis, yaitu variabel bebas dan

variabel terikat. Variabel bebas yakni keanekaragaman mikroba endofit

indigenous pada bagian akar, batang, daun, buah, dan tanah sekitar perakaran.

Adapun variabel terikat terbagi atas intensitas serangan dan ketahanan tanaman,

3.4. Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode eksplorasi dan uji efektivitas

aplikasinya di screenhouse menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK)

sederhana. Perlakuan cendawan endofit indigenous sebanyak 30 perlakuan

ditambah dua perlakuan kontrol. Perlakuan yang ada diulang sebanyak dua kali

sehingga terdapat 64 unit percobaan. Adapun perlakuan yang diberikan adalah

kontrol positif dengan pemberian POC (P1), kontrol negatif dengan tanpa

perlakuan (P2), dan perlakuan cendawan pada tiga tingkatan kerapatan spora

(P3 s/d P32) yang disajikan pada Tabel 1.

Tabel 1. Kode Perlakuan Cendawan Endofit Indigenous

No. Kode Isolat

Kode Perlakuan-

Pada Tingkat Pengenceran

Tanpa pengenceran 10-1

10-2

1 CC AK P3 P13 P23

2 CC BH P4 P14 P24

3 CC BT1 P5 P15 P25

4 CC BT2 P6 P16 P26

5 CC BT3 P7 P17 P27

6 CC BT4 P8 P18 P28

7 CC DN1 P9 P19 P29

8 CC DN2 P10 P20 P30

9 CC DN3 P11 P21 P31

10 CC TN P12 P22 P32 Keterangan : CC AK: cendawan asal jaringan akar, CC BH: cendawan asal jaringan buah, CC

BT: cendawan asal jaringan batang, CC DN: cendawan asal jaringan daun, CC TN:

cendawan asal tanah perakaran

15

Denah penelitian untuk perlakuan dengan cendawan endofit indigenous

digambarkan pada skema berikut ini:

Gambar 1. Denah Sampel Penelitian dengan Perlakuan Cendawan Endofit Indigenous

Keterangan :

1. Jarak antar baris adalah 20 cm

2. Jarak antar ulangan adalah 40 cm

3. I dan II merupakan ulangan perlakuan

Uji efektivitas aplikasi di screenhouse menggunakan Rancangan Acak

Kelompok (RAK) sederhana. Perlakuan bakteri endofit indigenous sebayak 9

perlakuan ditambah dua perlakuan kontrol. Perlakuan yang ada diulang sebanyak

tiga kali sehingga terdapat 33 unit percobaan. Adapun perlakuan yang diberikan

adalah kontrol positif dengan pemberian POC (P1), kontrol negatif dengan tanpa

perlakuan (P2), dan perlakuan cendawan pada tiga tingkatan kerapatan spora

(P3 s/d P11) yang disajikan pada Tabel 2.

I II

P5 P1 P18 P2 P8 P24 P13 P3

P15 P29 P20 P10 P26 P29 P32 P21

P13 P27 P16 P22 P11 P14 P16 P28

P30 P6 32 P3 P20 P1 P9 P4

P26 P12 P24 P28 P6 P22 P18 P12

P21 P19 P7 P14 P15 P30 P2 P25

P8 P11 P25 P31 P27 P10 P23 P17

P23 P17 P9 P4 P5 P19 P31 P7

U

T

S

B

16

Tabel 2. Kode Isolat Bakteri Endofit Indigenous

No. Kode Isolat

Kode Perlakuan-

Pada Tingkat Pengenceran

10-1

10-2

10-3

1 BC BH P3 P6 P9

2 BC AK P4 P7 P10

3 BC TN P5 P8 P11

Keterangan : BC BH: bakteri asal jaringan akar, BC AK: bakteri asal jaringan buah, BC TN:

bakteri asal tanah perakaran

Denah penelitian untuk perlakuan dengan bakteri endofit indigenous digambarkan

pada skema berikut ini:

I II III

P1 P9 P5 P3 P7 P2

P10 P7 P8 P11 P10 P5

P2 P11 P1 P7 P3 P8

P4 P6 P10 P4 P6 P11

P8 P3 P6 P9 P9 P1

P5 P2 P4

Gambar 2. Denah Sampel Penelitian dengan Perlakuan Bakteri Endofit Indigenous

Keterangan :

1. Jarak antar baris adalah 20 cm,

2. Jarak antar ulangan adalah 40 cm,

3. I, II dan III merupakan ulangan perlakuan.

U

T

S

B

17

3.5. Analisis Data

Data hasil eksplorasi dianalisis secara deskriptif. Data pengujian di lapangan

dianalisis dengan analisis varian (ANOVA) menggunakan Microsoft Office Excel

2010, kemudian uji lanjut DMRT (Duncan Multiple Range Test) 5% untuk

mengetahui pengaruh perlakuan terhadap variabel yang diukur.

3.6. Pelaksanaan Penelitian

3.6.1. Pembuatan Media

1. Pembuatan media PDA (Potato Dextrose Agar), diawali dengan menimbang

18 gram bubuk agar, 20 gram dextrose, dan 200 gram kentang yang telah

dipotong dadu. Kentang direbus dalam akuades 400 ml hingga mendidih

kemudian diangkat dan disaring untuk diambil sarinya. Setelah itu,

menambahkan 20 gram dextrose ke dalam sari kentang dan mengaduknya

hingga rata. Selanjutnya menambahkan akuades hingga 1000 ml dan

memanaskannya dengan api kecil, sambil memasukkan bubuk agar secara

perlahan lalu mengaduknya hingga homogen. Kemudian menambahkan 2

kapsul chloramphenicol sebagai antibakteri. Menuangkan larutan media PDA

ke dalam tabung Erlenmeyer untuk disterilkan pada autoklaf dengan suhu

121 ºC selama 15 menit.

2. Pembuatan media PDB (Potato Dextrose Broth), diawali dengan menimbang

20 gram dextrose, dan 200 gram kentang yang telah dipotong dadu. Kentang

direbus dalam akuades 400 ml hingga mendidih kemudian diangkat dan

disaring untuk diambil sarinya. Setelah itu, menambahkan 20 gram dextrose ke

dalam sari kentang dan mengaduknya hingga rata. Selanjutnya menambahkan

18

akuades hingga 1000 ml dan memanaskannya dengan api kecil, sambil

memasukkan bubuk agar secara perlahan lalu mengaduknya hingga homogen.

Kemudian menambahkan 2 kapsul chloramphenicol sebagai antibakteri.

Menuangkan larutan media PDB ke dalam tabung Erlenmeyer untuk

disterilkan pada autoklaf dengan suhu 121 ºC selama 15 menit.

3. Pembuatan Media NA (Nutrient Agar), sebanyak 28 gram bubuk NA yang

telah tersedia ditambahi akuades 1 liter, diaduk, dan dipanaskan. Pemanasan

dilakukan sampai dengan terlarutnya semua serbuk dan tidak ada sisa kristal.

Setelah itu, menuangkan larutan media NA ke dalam tabung Erlenmeyer untuk

disterilkan pada autoklaf dengan suhu 121 ºC selama 15 menit.

4. Pembuatan media LB (Lysogeny Broth), diawali dengan menimbang

10 gram tripton, 10 gram NaCl, dan 5 gram yeast extract. Selanjutnya bahan

ditambahi akuades 1 liter, diaduk, dan dipanaskan. Pemanasan dilakukan

sampai dengan terlarutnya semua serbuk dan tidak ada sisa kristal. Setelah itu,

menuangkan larutan media NA ke dalam tabung Erlenmeyer untuk disterilkan

pada autoklaf dengan suhu 121 ºC selama 15 menit.

3.6.2. Sterilisasi Alat dan Bahan

Alat dan bahan disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC

dengan tekanan 1.5 atm. Sterilisasi alat dilakukan selama 60 menit, sedangkan

sterilisasi bahan dilakukan selama 15 menit.

3.6.3. Isolasi, Purifikasi, dan Identifikasi Cendawan Endofit Indigenous

Isolasi diawali dengan eksplorasi cendawan endofit indigenous dari

jaringan tanaman cabai yaitu akar, batang, daun, buah, serta tanah sekitar

19

perakaran. Bagian tanaman yang telah diambil selanjutnya dibersihkan dari

kotoran dengan cara dicuci pada air mengalir. Bagian tanaman dipotong dengan

ukuran 1 cm dan direndam dengan alkohol 70% selama satu menit. Selanjutnya

potongan bagian tanaman direndam dengan larutan MgCl2 selama 1 menit,

masing-masing pencucian dilakukan sebanyak dua kali ulangan. Setelah itu

bagian tanaman dicuci kembali menggunakan akuades steril selama satu menit

dengan dua kali ulangan, dan mengeringkannya menggunakan tisu steril. Bagian

jaringan tanaman yang telah disterilisasi kemuadian ditanam di media PDA yang

telah disiapkan sebelumnya. Adapun proses inkubasi dilakukan dengan

menyimpannya selama tujuh hari hingga muncul koloni cendawan. Biakan murni

didapati dari purifikasi yang dilakukan dengan memindahkan miselium yang

memiliki karakteristik berbeda ke cawan petri baru yang telah berisi media PDA.

Identifikasi makroskopis cendawan disesuaikan dengan buku identifikasi Barnett

dan Hunter (1998).

3.6.4. Isolasi, Purifikasi dan Identifikasi Bakteri Endofit Indigenous

Isolasi bakteri endofit indigenous dari jaringan tanaman cabai yaitu akar,

batang, daun, buah, serta tanah sekitar perakaran. Bagian tanaman yang telah

diambil selanjutnya dibersihkan dari kotoran dengan cara dicuci pada air

mengalir. Bagian tanaman dipotong dengan ukuran 1 cm dan direndam dengan

alkohol 70% selama satu menit. Selanjutnya potongan bagian tanaman direndam

dengan larutan MgCl2 selama 1 menit, masing-masing pencucian dilakukan

sebanyak dua kali ulangan. Setelah itu bagian tanaman dicuci kembali

menggunakan akuades steril selama satu menit dengan dua kali ulangan, dan

mengeringkannya menggunakan tisu steril. Kemudian menghaluskan setiap

20

bagian tanaman cabai dengan larutan methanol 70% dan melakukan sentrifugasi

dengan kecepatan 4000 rpm selama 10 menit, untuk memisahkan natan dan

supernatan. Selanjutnya supernatan sebanyak 10 µl dipindahkan ke dalam cawan

petri yang telah berisi media NA. Purifikasi bakteri dilakukan dengan

memindahkan koloni bakteri yang telah tumbuh ke dalam cawan petri berisi

media NA dengan metode zig-zag. Adapun identifikasi bakteri dilakukan

berdasarkan kenampakan makroskopis dan mikroskopis. Identifikasi makroskopis

bakteri disesuaikan dengan metode pewarnaan Gramm, sedangkan identifikasi

mikroskopis berdasarkan morfologi bakteri.

Tahapan pewarnaan Gramm adalah sebagai berikut:

1. Menyiapkan gelas objek yang telah diberi isolat bakteri.

2. Meneteskan larutan kristal violet ke atas isolat bakteri, mendiamkannya

selama satu menit, dan membilasnya dengan air mengalir.

3. Meneteskan lugol ke atas isolat bakteri dan mendiamkannya selama

satu menit, kemudian membilasnya dengan air mengalir.

4. Meneteskan alkohol 96% selama 5-10 detik atau sampai dengan warna

luntur, kemudian membilasnya dengan air mengalir.

5. Meneteskan safranin ke atas isolat bakteri dan mendiamkannya selama

30 detik, kemudian membilasnya dengan air mengalir.

6. Mengeringkan kaca objek dengan kertas penghisap.

7. Mengamati di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 100x.

3.6.5. Uji Hipovirulensi Mikroba Endofit Indigenous

Uji Hipovirulensi dilakukan dengan menggunakan tanaman mentimun

sebagai tanaman indikator, dikarenakan tanaman mentimun memiliki

21

pertumbuhan kecambah yang cepat dan dapat memberikan respon yang cepat

terhadap serangan patogen. Metode yang digunakan adalah menurut Ichielevich-

Auster et al. (1985) dalam Worosuryani et al. (2006) dengan modifikasi oleh

penulis. Permukaan benih mentimun disterilkan dengan alkohol 70% selama 1

menit, dilanjutkan dengan Clorox 2% selama 30 detik, lalu dibilas akuades

sebanyak tiga kali, setelah itu dikering anginkan. Media yang digunakan adalah

media PDA untuk uji hipovirulensi cendawan, isolat murni ditanam pada media

PDA dalam botol kultur dan inkubasi selama 3 hari kemudian tiga benih

mentimun ditanam pada tiap-tiap biakan cendawan dan diinkubasi lagi selama

14 hari. Sedangkan untuk bakteri, benih mentimun direndam dalam suspensi

bakteri selama 2 jam lalu ditaman pada media NA dalam botol kultur dan

diinkubasi selama 14 hari. Kontrol dibuat dengan menaman kecambah pada media

tanpa penambahan cendawan dan bakteri. Perkecambahan benih mentimun

diamati setiap hari. Indeks keparahan penyakit pada hasil perkecambahan

mentimun dideterminasikan dengan skor individual hasil modifikasi

Worosuryani et al. (2006) sebagai berikut:

DSI =

Keterangan :

DSI = Disease Severity Index (Indeks Keparahan Penyakit)

N = Nilai tingkat keparahan penyakit masing-masing individu

Z = Jumlah individu yang digunakan

22

Nilai Tingkat keparahan penyakit:

0 = Sehat dan tidak ada infeksi pada hipokotil,

1 = Satu atau dua bercak coklat muda <0.25 cm,

2 = Bercak coklat muda <0.5 cm dan area kebasahan <10% pada hipokotil,

3 = Bercak coklat muda sampai tua >1.0 cm dan kemudian bergabung

dengan bercak lainnya dan daerah kebasahan 10%<x<100% pada hipokotil

(daun belum layu dan hipokotil masih tegar dan putih,

4 = Hipokotil bercak hitam, daun layu, dan bibit mati.

Klasifikasi isolat virulen terdiri atas lima kategori berdasarkan nilai DSI dan

gejalanya. Isolat dengan nilai DSI 0-0.3 dikategorikan sebagai isolat tidak

virulen atau bersifat hipovirulen. Nilai DSI 0.4-0.9 dengan kategori virulensi

rendah, 1-1.9 dengan kategori moderat, 2-2.9 dengan kategori virulen, dan 3-4

dengan kategori sangat virulen (Sneh et al., 2004). Worosuryani et al. (2006)

menambahkan isolat yang tidak menyebabkan gejala penyakit atau menunjukkan

sedikit gejala (DSI<2.0) pada perkecambahan mentimun dikategorikan sebagai

isolat hipovirulen.

3.6.6. Penanaman dan Pemeliharaan Tanaman Uji

Pengujian ketahanan tanaman dilakukan pada tanaman cabai varietas Laju

F1. Benih cabai ditanam dengan kedalaman 1 cm pada media semai. Bibit cabai

yang telah berumur 2 minggu setelah tanam (MST) kemudian dipindahkan ke

dalam polybag berukuran 30 cm x 30 cm. Media tanam yang digunakan adalah

berupa campuran tanah dan pupuk kandang dengan perbandingan 1:3 (b/b).

Tanaman dipelihara di screenhouse dan disusun sesuai dengan denah percobaan

23

dengan jarak 20 cm x 20 cm antar polybag. Pemeliharaan tanaman meliputi

penyiraman rutin setiap sore hari, pengendalian gulma secara manual, dan

pengendalian hama dengan pestisida jika ditemukan ulat dan serangga.

3.6.7. Pembuatan Sari Perasan (sap) Cucumber Mosaik Virus (CMV)

Pengambilan sari perasan daun tanaman cabai yang sakit bertujuan

mendapatkan virus mosaik, yang kemudian digunakan untuk menginfeksi

tanaman sehat yang telah diinduksi mikroba endofit indigenous. Pembuatan sari

perasan dilakukan dengan mengambil bagian daun yang mengandung konsentrasi

virus yang tinggi kemudian ditumbuk dengan mortar-martil. Hancurnya sel-sel

tanaman tersebut menyebabkan lepasnya virus pada sap. Untuk menstabilkan

virus, digunakan larutan buffer phosphate dengan pH normal

(Sastrahidayat, 2011). Larutan buffer phosphate sebagai larutan inokulasi 0.01 M

(pH 7) ditambahkan dengan perbandingan 1 gr daun terinfeksi virus tiap 5 ml

larutan buffer phosphate (1:5 b/v). Kemudian dilakukan sentrifugasi dengan

kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit (Subekti et al., 2006).

3.6.8. Perbanyakan Mikroba Endofit Indigenous

Mikroba endofit indigenous diperbanyak menggunakan metode suspensi.

Suspensi cendawan dibuat dengan cara memanen spora cendawan pada cawan

petri. Kegiatan diawali dengan menambahkan 10 ml media PDB ke dalam petri

berisi biakan cendawan lalu menggeseknya dengan alat cellspreader dan

memasukkannya ke dalam tabung reaksi. Suspensi cendawan dihomogenkan

menggunakan Vortex Homogenizer, kemudian suspensi cendawan diinkubasi

selama tujuh hari pada shaker dengan kecepatan 150 rpm. Suspensi cendawan

awal selanjutnya diencerkan dengan tingkat pengenceran 10-1

dan 10-2

. Jumlah

24

kerapatan spora cendawan dihitung menggunakan haemocytometer dengan

bantuan fotomikroskop optilab. Adapun biakan bakteri diambil menggunakan

jarum ose sebanyak 1-2 kali dan disuspensikan ke dalam 10 ml media cair LB lalu

diinkubasi selama 24 jam. Suspensi bakteri selanjutnya diencerkan dengan tingkat

pengenceran 10-1

, 10-2

, dan 10-3

.

3.6.9. Penghitumgan Kerapatan Populasi Spora Cendawan dan Sel Bakteri

Kerapatan populasi spora cendawan dan sel bakteri per ml larutan dihitung

menggunakan alat haemocytometer dibantu dengan mikroskop cahaya.

Penghitungan dilakukan dengan tahapan sebagai berikut:

1. Membersihkan haemocytometer dengan alkohol 70% lalu mengeringkannya

dengan tisu.

2. Meletakkan cover glass di atas alat hitung.

3. Menambahkan ± 50 μl suspensi sel mikroba (kira-kira 1 tetes) dengan cara

meneteskan pada parit kaca pada alat hitung. Suspensi sel akan menyebar

karena daya kapilaritas.

4. Memastikan bahwa ruangan penuh terisi dengan suspensi mikroba, ditambah

beberapa kelebihan dalam saluran di sampingnya. Membiarkan sejenak

sehingga sel diam di tempat (tidak terkena aliran air dari efek kapilaritas).

5. Meletakkan alat hitung pada meja objek mikroskop, kemudian mencari

fokusnya pada perbesaran 40 x10.

6. Menghitung jumlah spora cendawan atau sel bakteri pada 5 kotak hitung.

Hasil penghitungan kemudian hasil rataan dimasukkan ke dalam rumus

sebagai berikut (Balai Besar Perbenihan dan Proteksi Tanaman Perkebunan

Surabaya, 2009) :

25

x 10

3

Keterangan : A = Luas Kotak Hitung = 0.04 mm2 x 5 = 0.2 mm

2

B = Kedalaman Bidang Hitung = 0.1 mm

Faktor Pengenceran =

3.6.10. Inokulasi Mikroba Endofit Indigenous pada Tanaman Cabai

Inokulasi mikroba endofit indigenous dilakukan sebanyak tiga kali.

Inokulasi cendawan pertama kali dilakukan dengan merendam benih cabai pada

suspensi cendawan endofit indigenous selama 24 jam. Inokulasi kedua dilakukan

dengan menyiramkan suspensi cendawan endofit indigenous ke sekitar perakaran

bibit cabai pada pertengahan fase vegetatifnya, yaitu pada 3 minggu setelah tanam

(MST). Inokulasi ke tiga dilakukan dengan menyemprotkan suspensi cendawan

endofit indigenous ke permukaan daun cabai bagian bawah pada akhir masa

pertumbuhan vegetatifnya, yaitu pada umur 6 MST. Kontrol pada masing-masing

inokulasi menggunakan akuades steril untuk perendaman dan penyiraman.

Adapun inokulasi bakteri juga dilakukan sebanyak tiga kali yakni dengan

perendaman benih cabai dengan suspensi bakteri endofit indigenous selama dua

jam, penyiraman suspensi bakteri endofit indigenous di sekitar bibit cabai umur 3

MST, dan penyemprotkan suspensi bakteri endofit indigenous ke permukaan daun

bagian bawah pada bibit cabai umur 6 MST.

3.6.11. Infeksi Cucumbe Mosaik Virus (CMV) dengan Metode Sap

Infeksi cairan sap diawali dengan menaburi serbuk karborundum di

permukaan atas daun muda kemudian mengoleskan cairan sap pada daun tersebut

26

menggunakan kapas steril. Subekti et al. (2006) menyatakan bahwa setelah

pengolesan sap, segera dilakukan pembilasan sisa-sisa cairan perasan yang masih

melekat pada permukaan daun tanaman uji menggunakan air mengalir.

3.6.12. Pengamatan Intensitas Serangan Virus dan Ketahanan Tanaman

Intensitas serangan atau infeksi virus pada tanaman cabai ditentukan dengan

menggunakan rumus kerusakan mutlak sebagai berikut (Untung, 2010):

I =

x 100%

Keterangan:

I = Intensitas serangan (%)

A = Banyaknya daun yang rusak mutlak atau dianggap rusakmutlak.

B = Banyaknya daun yang tidak terserang (tidak menunjukkkan gejala

serangan).

3.6.13. Pengamatan Badan Inklusi Virus

Respon atau tanggap histologi pada tanaman yang diinfeksi virus berupa

adanya pembentukan badan inklusi dalam sel. Pengamatan badan inklusi virus

dilakukan dengan cara mengambil daun yang terinfeksi virus. Pengamatan Badan

Inklusi virus dilakukan berdasarkan metode yang dijelaskan oleh Badan Karantina

Pertanian (2009). Pengamatan badan inklusi virus dilakukan dengan cara

mengambil daun yang terinfeksi virus. Sampel daun kemudian dipotong/diiris

melintang setipis mungkin menggunakan silet. Irisan tersebut kemudian

diletakkan pada kaca objek dan diberi setetes metilen biru, lalu ditutup dengan

cover glass. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop cahaya dengan perbesaran

40x.