BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan Percobaan

Bahan yang digunakan dalam percobaan ini ialah larutan induk (BSA 1

mg/mL), larutan sampel protein, larutan Lowry A (Follin ciocalteus dan akuades),

larutan Lowry B (Na2CO3 2% dalam NaOH 0,1 N, Na-K Tartrat, CuSO4.5H2O),

akuades dan tissue roll.

3.2 Alat Percobaan

Alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu rak tabung, tabung reaksi,

labu takar 10 mL, gelas kimia 100 mL, pipet ukur 0,2 mL, 1 mL, 2 mL, dan 5 mL,

lambut semprot, buret 50 mL, filler pipet, pipet tetes, statif, dan spektronik 20 D+.

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Pembuatan Larutan Induk

Disiapkan gelas ukur 10 mL, dimasukkan 0,01 gram BSA, ditambahkan

akuades sampai tanda batas dan dikocok untuk menghomogenkan.

3.3.2 Pembuatan Larutan Standar

Pembuatan larutan standar dibuat dengan mengencerkan larutan induk

dengan akuades, volume dan konsentrasi telah dibuat sesuai tabel dibawah:

C standar (ppm) VBSA Vakuades (mL) Vtotal (mL)

0,02 0,04 1,96 2 mL

0,04 0,08 1,92 2 mL

0,06 0,12 1,88 2 mL

0,08 0,16 1,84 2 mL

0,10 0,20 1,80 2 mL

0,12 0,24 1,76 2 mL

Kemudian disiapkan 6 tabung reaksi kedalam tabung dimasukkan akuades

dan diencerkan sampai volume 2 ml, dikocok untuk dihomogenkan.

3.3.3 Pembuatan Pereaksi

A. Lowry A

Dipipet larutan Follin Ciocalteus sebanyak 0,21 mL, menggunakan pipet

skala 5 mL dan kemudian ditambahkan dengan akuades sebanyak 0,21 mL,

dimasukkan kedalam gelas kimia untuk dihomogenkan. (perbandingan 1:1)

B. Lowry B

Kedalam gelas kimia dipipet sebanyak 46 mL larutan Na2CO3 2% dalam

NaOH 0,1 N, kemudian ditambahkan dengan 0,46 mL larutan Na-K-Tartrat 2%,

dan, 0,46 mL larutan CuSO4.5H2O 1% (perbandingan 100:1:1), larutan dikocok

dan homogenkan.

3.3.4 Preparasi Sampel

Dipipet sebanyak 0,02 mL larutan sampel, kemudian ditambahkan dengan

1,98 mL aquades, dengan faktor pengenceran 100 kali.

3.5 Penentuan Kadar Protein Sampel

Dipipet masing-masing sebanyak 2 mL larutan standar 0,02 M; 0,04 M;

0,06 M; 0,08 M, 0,10 M, dan 0,12 M; larutan sampel, dan larutan blanko

(akuades) ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing sebanyak 0,46

mL larutan Lowry B, lalu dibiarkan selama 15 menit. Kemudian ditambahkan

0,21 mL larutan Lowry A ke dalam masing-masing tabung reaksi, dan dibiarkan

selama 30 menit. Setelah itu, diukur absorban dari masing-masing larutan dengan

menggunakan spektronik-20 pada panjang gelombang maksimum.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Tabel Pengamatan

Tabel 1. Penentuan panjang gelombang maksimum

Panjang Gelombang (nm) Absorban

660 0,325

670 0,326

680 0,329

690 0,334

695 0,334

700 0,334

705 0,335

710 0,333

Grafik 1. Hasil pengamatan penentuan panjang gelombang maksimum

650 660 670 680 690 700 710 7200.32

0.322

0.324

0.326

0.328

0.33

0.332

0.334

0.336

Konsentrasi

Abso

rban

Y= 4013x - 640

4.2 Penentuan kadar protein

Tabel 2. Hasil pengamatan penentuan kadar protein

Konsentrasi sampel (ppm)

Absorban

0,02 0,142

0,04 0,160

0,06 0,335

0,08 0,448

0,10 0,520

0,12 0,590

Sampel A 0,160

Grafik 1. Hasil pengamatan penentuan kadar protein

0 1 2 3 4 5 6 7 80

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

f(x) = 0.0323571428571429 x + 0.220285714285714f(x) = 0.0323571428571429 x + 0.220285714285714

ppm

Abso

rbas

i

4.3 Reaksi

4.4 Pembahasan

Dalam praktikum ini penetapan kadar protein dilakukan dengan metode

lowry. Protein standar yang digunakan adalah BSA (Bovine Serum Albumin).

Albumin merupakan salah satu jenis protein globuler yang larut dalam air dan

terkoagulasi oleh panas. BSA dalam praktikum ini berfungsi untuk membuat

larutan standar. BSA digunakan karena stabilitas untuk meningkatkan sinyal

dalam tes, kurangnya efek dalam reaksi biokimia.

Reagen yang digunakan dalam uji lowry salah satunya adalah reagen

Follin Ciocalteu. Follin-Ciocalteu merupakan pereaksi kompleks yang berisi

fosfomolibdat dan fosfotungstat. Fungsi dari reagen ini adalah membentuk

kompleks warna biru yang disebabkan dari reaksi antara tirosin yang ada dalam

protein dengan fosfomolibdat dan fosfotungstat.

Yang dikerjakan terlebih dahulu adalah membuat pereaksi Lowry A dan

Lowry B masing-masing dibuat dengan tekaran yang sesuai dengan kebutuhan,

misalnya Lowry A dibuat dengan memipet larutan Follin sebanyak 0,21 mL dan

ditambahkan dengan akuades dengan jumlah yang sama (perbandingan 1:1).

Kemudian dibuat larutan Lowry B dengan memipet larutan Na2CO3 2% sebanyak

46 mL kemudian ditambahkan dengan 0,46 mL larutan Na-K-Tartrat 2%, dan,

0,46 mL larutan CuSO4.5H2O 1% (perbandingan 100:1:1).

Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam

metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk

sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi

menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin Ciocalteu,

kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat akan menghasilkan heteropoly-

molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (ranti samping asam

amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi

secara kolorimetri.

Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu

tryptophandan tyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100

kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih

sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL. Namun metode

Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya.

Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban

suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer dapat

mengukur serapan di daerah tampak, UV (200-380 nm) maupun IR (> 750 nm)

dan menggunakan sumber sinar yang berbeda pada masing-masing daerah (sinar

tampak, UV, IR).

Pada penentuan kadar protein, digunakan panjang gelombang kisaran

600-800 nm, karena konstituen utama reagen follin dan ciocalteus yaitu biru

tungsten dan biru molibdenum menunjukkan puncak serapan dipanjang

gelombang tersebut.

pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut

dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat

berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent

Folin. Saat protein terlarut direaksikan dengan Follin dalam suasana sedikit basa,

ikatan peptida pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna

biru.

Dari tabel yang diperoleh menunjukkan hasil bahwa semakin tinggi nilai

panjang gelombang, maka semakin tinggi pula serapan spektum cahayanya, begitu

pun untuk nilai absorban dan dan konsentrasi larutan, semakin tinggi konsentrasi

larutan maka nilai absorbannya juga semakin tinggi, dan karena semakin tinggi

intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk

yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sampel.

Larutan standar yang digunakan dibuat dengan konsentrasi yang berbeda-

beda dengan tujuan untuk menentuan kurva baku, persamaan garis lurus yang

diperoleh adalah Y= 4013x – 640 yang didapatkan dengan cara menentukan nilai

intercept dan slope larutan standar, sehingga dari persamaan ini bisa diketahui

kadar protein yang ada dalam sampel, pada konsentrasi 0,02 mg/mL dan hasil

perhitungannya didapatkan larutan protein dalam sampel sebesar 0,160 mg/mL.

Pada tabel 1 hasil pengamatan penentuan panjang gelombang maksimum,

pada panjang gelombang 690, 695, dan 700 nm ternyata diperoleh nilai absorban

yang sama, dimana kita ketahui semakin meningkat konsentrasi larutan maka nilai

absorbannya pun ikut meningkat, tentunya hal ini dipengaruhi oleh faktor tertentu,

misalnya, saat memipet larutan ketelitian yang dipakai harus benar-benar baik

namun karena pengaruh alat filler yang longgar saat sedang digunakan maka

larutan yang dipipet tersebut kurang tepat, serta saat pemipetan larutan-larutan

lainnya.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari hasil percobaan ini, didapatkan kesimpulan bahwa kadar protein

dalam larutan contoh adalah 1,60 mL

5.2 Saran

5.2.1 Laboratorium

Ada baiknya untuk alat yang rusak segera digantikan dengan alat masih

baik fungsi dan kerja alatnya, karena pengukuran menggunakan alat yang kurang

tepat kegunaanya akan sangat mempengaruhi hasil akhir dari percobaan.

5.2.2 Percobaan

Untuk penentuan kadar protein dalam praktikum sebaiknya juga

menggunakan metode Biuret, untuk membandingkan dan mengetahui perbedaan

spesifik dari kedua metode yang ada.

5.2.3 Asisten

Sebaiknya sebelum hari pelaksaan praktikum diberikan arahan tentang

percobaan, misalnya prosedur pelaksanaan berhubung karena yang didalam buku

penentun adalah metode Biuret sehingga dalam pelaksaan praktikum waktu yang

digunakan bisa lebih diefisienkan.

LAMPIRAN 1 :

BAGAN KERJA PENENTUAN KADAR PROTEIN

1. Penentuan larutan induk BSA 1 mg/mL

- Dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL

- Ditambahkan dengan akuades hingga tanda batas

- Dikocok dan dihomogenkan

2. Pembuatan larutan standar

- Dipipet 0,04 mL, 0,08 mL, 0,12 mL, 0,16 mL, 0,20 mL, dan 0,24

mL

- Dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berbeda.

- Ditambahkan akuades sampai volume 2 mL

3. Pembuatan pereaksi

Lowry As

- Dimasukkan kedalam gemas kimia

- Ditambahkan akuades sebanyak 2,1 mL

- Dikocok dan dihomogenkan

Lowry B

BSA 0,01 gram

Hasil

Larutan induk 1 mg/mL

Hasil

Follin Ciocalteus 2,1 mL

Hasil

Na2CO3 2% 46 mL

- Dimasukkan kedalam gelas kimia

- Ditambahkan CuSO4.5H2O 1% sebanyak 0,46 mL

- Ditambahkan larutan Na-K-Tartrat 2% sebanyak 0,46 mL

- Dikocok dan dihomogenkan

4. Preparasi sampel

- Dimasukkan kedalam labu takar 25 mL

- Ditambahkan akuades sampai tanda batas

- Dikocok hingga homogen

5. Penentuan kadar protein

- Dimasukkan ke tabung reaksi sebanyak 2 mL

- Ditambahkan 0,21 mL Larutan Lowry B dan

didiamkan selama 15 menit

- Ditambahkan 46 mL larutan Lowry A dan

didiamkan selama 30 menit

- Dimasukkan kedalam spektromter, diukur

absorbannya pada λ Maksimum

LAMPIRAN 2 :

Hasil

Sampel

Hasil

Standar Sampel Blanko

Hasil

PERHITUNGAN

1. Perhitungan larutan induk

1 mg = 1 mL

x = 10 mL

x = 10 mL x1mg

1mL

x = 10 mg = 0,01 gr BSA (dilarutkan dalam labu ukur 10 mL).

2. Perhitungan larutan standar

2.1 Untuk standar 0,02 mg/mL

V1 M1 = V2 M2

X . 1mg/mL = 2 mL . 0,02 mg/mL

X = 0,04 mL

2.2 Untuk standar 0,04 mg/mL

V1 M1 = V2 M2

X . 1mg/mL = 2 mL . 0,04 mg/mL

X = 0,08 mL

2.3 Untuk standar 0,06 mg/mL

V1 M1 = V2 M2

X . 1mg/mL = 2 mL . 0,06 mg/mL

X = 0,12 mL

2.4 Untuk standar 0,08 mg/mL

V1 M1 = V2 M2

X . 1mg/mL = 2 mL . 0,08 mg/mL

X = 0,16 mL

2.5 Untuk standar 0,10 mg/mL

V1 M1 = V2 M2

X . 1mg/mL = 2 mL . 0,10 mg/mL

X = 0,20 mL

2.6 Untuk standar 0,12 mg/mL

V1 M1 = V2 M2

X . 1mg/mL = 2 mL . 0,12 mg/mL

X = 0,24 mL

3. Penentuan kadar protein

Persamaan garis dari kurva diatas diperoleh y = 4013x – 640 sehingga, dapat

digunakan untuk menentukan kadar protein dalam sampel :

y = 4013x – 640

0,02 = 4013x – 640

640,02 = 4013x

x = 0,16 mg/mL

jadi, kadar protein dapat diketahui berdasarkan rumus = x . FP

= 0,16 mg/mL x 100

= 16 mg/mL

LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 17 Maret 2014

ASISTEN PRAKTIKAN

AGUSTIANA YENNI OCTAVIANA

LAMPIRAN 3 :

FOTO PERCOBAAN

1. Masing-masing larutan setelah ditambahkan larutan Lowry B.

2. Masing-masing larutan setelah ditambahkan Lowry A.