26

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Desain Penelitian

Penelitian ini menggunakan true experimental laboratory secara in vivo

yang artinya bahwa pada penelitian ini semua variabel yang mempengaruhi

jalannya eksperimen akan dikontrol sehingga validitas internal (kualitas

pelaksanaan rancangan penelitian) ini akan meningkat. Desain penelitian

menggunakan pendekatan Randomized Post Test Only Controlled Group Design

untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol Tobacco nicotiana pada

nilai resistensi insulin. Penelitian ini dilakukan dengan cara menguji pengaruh dari

pemberian ekstrak etanol Tobacco nicotiana terhadap penurunan nilai resistensi

insulin pada model tikus Wistar (Rattus norvegicus) yang diinduksi HFD dan STZ

dosis rendah.

4.2 Sampel Penelitian

4.2.1 Pemilihan Sampel

Sampel penelitian adalah model tikus Wistar (Rattus norvegicus).

Pemilihan sampel penelitian untuk pengelompokan perlakuan menggunakan cara

acak karena hewan coba, bahan pakan, dan bahan penelitian lainnya dapat

dianggap homogen. Tikus diperoleh dan dipelihara di Laboratorium Farmasi

Fakultas kedokteran Universitas Brawijaya.

Kriteria inklusi untuk dijadikan sampel adalah sebagai berikut :

i. Tikus wistar (Rattus norvegicus)

27

ii. Umur 6-8 minggu

iii. Berat badan 150-200 gram

iv. Kondisi sehat, aktif dan tidak ada kelainan anatomis

Kriteria eksklusi adalah sebagai berikut :

i. Tikus wistar (Rattus norvegicus) yang tidak mau makan seterusnya

selama masa penelitian

ii. Tikus wistar (Rattus norvegicus) yang tidak bergerak aktif atau sakit

selama masa perlakuan

iii. Tikus wistar (Rattus norvegicus) yang mati selama masa perlakuan

4.2.2 Besar Sampel

Sampel penelitian adalah model tikus wistar (Rattus novergicus) jantan

berusia 6-8 minggu. Perhitungan besarnya pengulangan pada sampel adalah

sebagai berikut:

(t-1) (r-1) ≥ 15 [dengan: t = jumlah perlakuan, r = jumlah ulangan]

Pada penelitian ini t = 5 sehingga jumlah pengulangan adalah:

(5-1) (r-1) ≥ 15

r-1 ≥ 15:4

r = 3.75 + 1 = 4.75 (dibulatkan 5)

dari perhitungan tersebut banyaknya pengulangan minimal 5 kali untuk

setiap perlakuan. Pada masing-masing kelompok kontrol tikus diberikan 2 tikus

sebagai cadangan. Sehingga jumlah tikus yang digunakan pada penelitian ini

sejumlah 7x5 kelompok = 35 ekor hewan coba menggunakan simple random

sampling.

28

4.3 Variabel Penelitian

4.3.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah dosis ekstrak etanol Tobacco

nicotiana, yaitu 90 mg/kg BB, 180 mg/kg BB, 270 mgkg BB yang diberikan per oral

ke tikus wistar (Rattus norvegicus) yang diinduksi menjadi diabetes mellitus tipe 2

dengan injeksi STZ dan HFD.

4.3.2 Variabel Tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah pengukuran HOMA-IR

(mengukur tingkat resistensi terhadap insulin) yang dinilai dengan kalkulator

HOMA-IR.

4.4 Waktu dan Tempat Penelitian

4.4.1 Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan dalam rentang waktu 4 bulan (termasuk

penyusunan proposal) terhitung mulai bulan Februari 2016 sampai Juni 2016.

4.4.2 Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmasi, Laboratorium Farmakologi,

Laboratorium Faal, Fakultas Biologi Universitas Brawijaya Malang dan

Laboratorium Materia Medika Batu.

29

4.5 Definisi Operasional

i. Ekstrak etanol berasal dari spesies Tobacco nicotiana, diperoleh dari

Bondowoso, Jawa Timur. Dosis ekstrak etanol Tobacco nicotiana

yang dipakai sebagai perlakuan adalah 90 mg/kg (kelompok

perlakuan 1), 180 mg/kg (kelompok perlakuan 2), dan 270mg/kg

(kelompok perlakuan 3), dengan pemberian ekstrak secara oral.

ii. Hewan coba tikus wistar (Rattus novergicus) yang diinduksi DM tipe

2 dengan diberikan HFD dan STZ. Tikus dinyatakan DM jika tingkat

glukosa darah puasa di atas 130 mg/dl dan glukosa darah acak di

atas 200 mg/dl (Pournaghi et al. 2012)

iii. Berat badan tikus yang diukur menggunakan timbangan digital setiap

minggu dengan satuan gram

iv. Pakan yang diberikan dihitung dengan cara dikurangi dengan sisa

pakan sebelumnya dengan satuan gram

v. High Fat Diet (HFD)

Adalah pakan yang diberikan dengan komposisi berupa pakan

standar (pakan ayam 57.3% dan tepung terigu 31.8%) ditambah

kolesterol 1.9%, asam kolat 0.1%, dan minyak babi 8.9% diberikan

selama 8 minggu.

vi. Glukosa darah

Kadar glukosa di dalam darah sebagai sumber utama energi untuk

sel tubuh. Darah whole blood untuk pemeriksaan menggunakan alat

Blood Glucose Test Meter dengan satuan mg/dl.

30

vii. C – peptide

Produk sampingan yang dibuat ketika insulin diproduksi. Darah whole

blood untuk pemeriksaan menggunakan metode ELISA dengan

satuan ng/ml. Normal range c-peptide dewasa adalah 0.4 sampai 2.1

ng/ml jika dihitung dalam keadaan puasa, sedangkan jika dihitung

dua jam postpradial adalah 1.2 sampai 3.4 ng/ml (Kumar et al. 2013).

viii. HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance

Index) adalah salah satu parameter diagnosis utama yang digunakan

untuk mengukur indeks resistensi insulin (Hermanto & Sony 2003).

HOMA-IR adalah nilai yang dihitung dengan rumus berdasarkan hasil

kadar C-peptide puasa dan kadar glukosa puasa dengan cut off 2.9,

yaitu dikatakan resistensi insulin jika HOMA-IR lebih besar dari 2.9

(Xia 2010; Matthews 1985)

HOMA-IR = 1.5 + 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 𝑝𝑢𝑎𝑠𝑎 𝑥 (𝐶−𝑝𝑒𝑝𝑡𝑖𝑑𝑒 𝑝𝑢𝑎𝑠𝑎

2800)

4.6 Alat dan Bahan Penelitian

4.6.1 Alat dan Bahan untuk Perawatan Tikus

Kandang hewan coba, tutup kandang dari anyaman kawat, botol minum,

tempat makan, batu besar, air minum, sekam, pakan standar dan HFD.

4.6.2 Alat dan Bahan untuk Induksi DM tipe 2

Streptozotocin (STZ), spuit 3cc, normal saline, alkohol 70%.

4.6.3 Alat dan Bahan untuk Ekstrak etanol Tobacco nicotiana

kertas whatman, filtering beaker glass, dan mesin rotary.

31

4.6.4 Alat dan Bahan untuk Pemeriksaan berat badan

Timbangan berat manual SF-400.

4.6.5 Alat dan Bahan Untuk Pemeriksaan Asupan Makanan Tikus

Timbangan berat manual SF-400.

4.6.6 Alat dan Bahan untuk Pemeriksaan Glukosa Darah

Kapas alkohol, lancet, POCT (point of care test), strip glukosa darah.

4.6.7 Alat dan Bahan untuk Pembedahan Tikus

Gunting bedah, steroform, pinset, kapas, jarum pentul, kloroform, spuit

insulin 1 ml, formalin 10%, wadah plastik dan tutup 25 buah, alkohol, vacutainer

35 buah.

4.7 Prosedur Kerja Penelitian

4.7.1 Pengurusan Etik

Dilakukan sebelum melakukan penelitian, untuk memenuhi kelayakan etik

penelitian di Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.

4.7.2 Perawatan Tikus

Dilakukan persiapan pemeliharaan hewan coba mulai dari kandang

pemeliharaan hewan coba, penutup kandang dengan jaring-jaring kawat, sekam,

botol minum, tempat makan, pakan dan pengecekan awal berat badan tikus. Tikus

diadaptasikan di dalam Laboratorium Farmasi selama 2 minggu dan dibagai

menjadi lima kelompok, yaitiu kontrol negatif (-), kontrol positif (+), perlakuan 1,

perlakuan 2, perlakuan 3.

32

4.7.3 Pembuatan Pakan Tikus Standar dan HFD

Pakan yang diberikan selama masa aklimatisasi atau adaptasi adalah

pakan standar yang terdiri dari pakan ayam/PARS 20 gram, air 10 cc, tepung terigu

10 gram, total pakan standar pertikus 40 gram untuk setiap tikus perharinya. Pakan

standar diberikan kepada semua kelompok, yaitu kontrol negatif (-), kontrol positif

(+), perlakuan 1, perlakuan 2, perlakuan 3 selama 2 minggu. Setelah masa

aklimatisasi atau adaptasi, kelompok kontrol negatif (-) diberikan pakan standar

seberat 40 gram perhari. Untuk kelompok kontrol positif (+), kelompok perlakuan

1, perlakuan 2, dan perlakuan 3 diberikan HFD yang terdiri dari pakan ayam/PARS

20 gram dan tepung terigu 10 gram yang ditambahkan kuning telur bebek 2 gram,

asam kolat 0,05 gram, minyak babi 3,55 gram, lemak kambing 4 gram (4cc),

minyak kelapa 0,4 gram (0,4cc), air 25 ml (25cc). Total HFD pertikus 65 gram untuk

setiap tikus perharinya. Selanjutnya setelah 28 hari pemberian HFD dilanjutkan

pemberian pakan standar.

4.7.4 Pembuatan Tikus model DM tipe 2

Tikus wistar (Rattus norvegicus) dibuat DM tipe 2 menggunakan HFD dan

injeksi STZ. Tikus dipilih berdasarkan kriteria inklusi sebanyak 35 ekor umur 6-8

minggu dengan berat 150-200 gram. Kemudian dikondisikan di kandang tempat

pemeliharaannya selama 2 minggu dengan diberikan pakan standar pada

kelompok kontrol negatif (-), sedangkan pada kelompok kontrol positif (+) diberikan

HFD dengan komposisi pakan (80%), lemak babi (15%) dan kuning telur bebek

(5%). Pemberian HFD dilakukan selama 28 hari, kemudian diinjeksi dengan STZ

low dose 22.5 mg/kgBB intraperitonial (Laboratorium Farmako FKUB). Sebelum

diinjeksi STZ, kadar glukosa darah tikus diukur untuk menentukan apakah tikus

33

tersebut tidak menderita DM sebelum diinduksi. Dosis STZ dihitung untuk setiap

tikus (22.5 mg/kgBB) dan diencerkan dalam aquades. Tingkat pH larutan STZ

harus antara 3.5-4.5. jika tingkat pH larutan STZ belum tercapai maka perlu

ditambahkan asam sitrat hingga tercapai pH larutan 3.5-4.5. (Lenzen 2008; Zhang

et al. 2008).

4.7.5 Prosedur Pengukuran Kadar Glukosa Darah

Kondisi DM dapat dikonfirmasi dengan menggunakan pengecekan glukosa

darah puasa menggunakan alat POCT (point of care test). Setelah 3 hari paska

induksi STZ dilakukan pemeriksaan glukosa darah setelah dipuasakan selama 8

jam. Pemeriksaan kadar glukosa darah melalui pengambilan darah dari vena di

ekor tikus dengan cara melukai sedikit ujung ekor. Kemudian tetesan darah yang

pertama dibuang, tetesan darah berikutnya diperksa dengan menggunakan alat

POCT (point of care test). Reagen strip yang telah ditetesi darah vena dimasukan

ke alat pemeriksa, kemudian hasilnya dibaca pada layar dalam waktu kurang dari

30 detik. Nilai yang tertera pada layar adalah nilai konsentrasi glukosa darah dalam

mg/dl. Tikus dinyatakan DM jika tingkat glukosa darah puasa di atas 130 mg/dl dan

glukosa darah acak di atas 200 mg/dl (Pournaghi et al. 2012). Jika nilai glukosa

darah belum memenuhi kriteria akan diinjeksi ulang dengan STZ dua hari

kemudian.

4.7.6 Persiapan Ekstrak Etanol Tobacco nicotiana

Bahan utama yang digunakan adalah daun tembakau yang sudah

dikeringkan yang berasal dari Bondowoso, Jawa Timur. Daun tembakau kemudian

dipotong tipis-tipis dan digiling kemudian di maserasi dengan etanol selama sehari.

Hasil maserasi kemudian disaring menggunakan kertas whatman filtering. Filtrat

34

kemudian diletakkan di dalam beaker glass dan dirotasi ketika sedang dipanaskan

di mesin rotary sampai semua etanol selesai diuapkan. Ekstrak etanol diperoleh

dari sisa filtrat yang diuapkan. Ekstrak etanol kemudian dianalisis menggunakan

Gas Chromatography Mass Spectometry (GCMS) untuk menentukan substansi

pada ekstrak. Dari analisis didapatkan ekstrak etanol mengandung 57.23% nikotin

dalam 120 gram daun tembakau kering.

4.7.7 Pemberian dan Dosis Ekstrak Etanol Tobacco nicotiana

Dosis Ekstrak Etanol Tobacco nicotiana yang digunakan dalam penelitian

ini adalah 90 mg/kgBB untuk tikus perlakuan 1, 180 mg/kgBB untuk tikus perlakuan

2, dan 270 mg/kgBB untuk tikus perlakuan 3. Penentuan dosis didapatkan dari

hasil eksplorasi dosis dari penelitian tentang penggunaan ekstrak nikotin.

Penggunaan 12 mg/kg/hari ekstrak nikotin dapat memberikan signifikansi

penurunan glukosa darah sebesar 30% dan berat badan tikus sebesar 2% melalui

metode osmitic minipumps. Ekstrak etanol Tobacco nicotiana diberikan secara oral

dengan metode sonde langsung menuju ke lambung tikus. Ekstrak diberikan

setiap satu kali sehari selama 30 hari.

4.7.8 Pengecekan Efek Ekstrak Etanol Tobacco nicotiana terhadap Berat

Badan Tikus

Berat badan tikus diukur secara rutin dalam 3 kondisi, yaitu sebelum

induksi diabetes mellitus, sebelum diberikan ekstrak etanol Tobacco nicotiana, dan

setiap minggu setelah diberikan ekstrak etanol Tobacco nicotiana. Pengukuran

berat-badan tikus dilakukan selama 28 hari.

35

4.7.9 Pembedahan Tikus

Tikus diberi anestesi per inhalasi dengan kloroform dalam wadah tertutup.

Taruh tikus yang sudah diberi anestesi di atas steroform, fiksasi, lalu bedah mulai

dari perut. Ambil darahnya terlebih dahulu dengan spuit 1 ml melalui jantung.

Setelah itu, ambil aortanya dan fiksasi ke dalam formalin 10%.

4.7.10 Prosedur Pengukuran Kadar C-Peptide

Pengukuran kadar insulin plasma dilakukan dengan cara tikus dipuasakan

selama 2 jam karena kadar insulin plasma yang diukur adalah kadar insulin puasa.

Sampel darah yang dipakai untuk pengukuran kadar insulin plasma adalah darah

dari jantung tikus yang diambil pada saat pembedahan tikus. Pengukuran kadar

insulin plasma menggunakan metode ELISA dari Boehringer-Mannheim kit. Darah

yang sudah diambil diberi antikoagulan/EDTA lalu diputar dengan menggunakan

sentrifugator dengan kecepatan 3000 rpm selama 7 menit, nilai normal untuk kadar

insulin plasma <2500 picogram/ml.

4.7.11 Prosedur Perhitungan Nilai Resistensi Insulin

Perhitungan nilai resistensi insulin dilakukan dengan menggunakan

HOMA-IR dengan aplikasi kalkulator HOMA-IR dari Harvard. Untuk mengetahui

nilai HOMA-IR tikus maka diperlukan kadar glukosa puasa yang dihitung

menggunakan alat POCT dan kadar insulin puasa yang dihitung dengan metode

ELISA. Pengukuran nilai HOMA-IR dilakukan setelah prosedur pembedahan tikus

selesai. Perhitungan dapat dilakukan sebagai berikut :

HOMA-IR = 1.5 + 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 𝑝𝑢𝑎𝑠𝑎 𝑥 (𝐶−𝑝𝑒𝑝𝑡𝑖𝑑𝑒 𝑝𝑢𝑎𝑠𝑎

2800)

36

4.8 Analisis Data

Hasil data pengukuran Homa-IR dari perlakuan dianalisis secara statistik

dengan menggunakan program SPSS versi 23 dengan tingkat signifikansi 0,05 (p

= 0,05) dan taraf kepercayaan 95% (α = 0,05). Langkah-langkah uji hipotesis

komparatif adalah uji normalitas data, uji homogenitas varian, uji One-way ANOVA

dan Post hoc Tukey. Namun apabila syarat One-way ANOVA tidak terpenuhi

karena data tidak normal dan homogen, maka analisa data dapat dilakukan

dengan Uji Kruskal Wallis dan Post hoc Mann Whitney (Dahlan, 2004).

4.9 Alur Penelitian

Gambar 4.1 Alur Penelitian

Keterangan : Kontrol Negatif (Tikus sehat tanpa diberikan perlakuan apapun), Kontrol Positif (Tikus diinduksi menjadi DM tipe 2 tanpa pemberian ekstrak etanol Tobacco nicotiana), Perlakuan 1 (Tikus diinduksi DM tipe 2 dan diberikan ekstrak etanol Tobacco nicotiana 90 mg/kg), Perlakuan 2 (Tikus di induksi menjadi DM tipe 2 dan diberikan ekstrak etanol Tobacco nicotiana 180 mg/kg), Perlakuan 3 (Tikus di induksi menjadi DM tipe 2 dan diberikan ekstrak etanol Tobacco nicotiana 270 mg/kg)

Pengumpulan tikus wistar (Rattus norvegicus)

↓

Seleksi sesuai kriteria inklusi dan eksklusi, randomisasi ke dalam 5 kelompok, aklimatisasi selama 14 hari

↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓

Kontrol negatif

Kontrol Positif

Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3

↓ ↓ ↓ ↓

Induksi T2DM Induksi T2DM Induksi T2DM Induksi T2DM

↓ ↓ ↓

Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3

↓

Pembedahan dan pengambilan serum tikus setelah 28 hari perlakuan

↓

Pengukuran nilai resistensi insulin melalui metode HOMA-IR

↓

Analisis Data

37

4.10 Jadwal Kegiatan

Gambar 4.2 Jadwal Kegiatan

No Kegiatan Bulan1 Bulan2 Bulan3 Bulan 4

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

Tahap Persiapan 1. Mengurus ethical clearance &

perijinan laboratorium

2. Belanja alat dan bahan penelitian 3. Aklimatisasi Hewan Coba Tahap Pelaksanaan 1. Induksi Hewan Coba menjadi DM

tipe 2

2. Pemberian Ekstrak Etanol 3. Pengambilan aorta dan serum 4. Pengukuran kadar HOMA-IR Tahap Penyelesaian 1. Analisis data 2. Penyusunan Laporan akhir