IdentifikasiPolimorfisme Gen VEGF 936 C/T pada Penderita Kanker Payudara di RSUP Moh. Hoesin Palembang

Fajriani Kurnia Rosdi1, Ika Kartika2, Mgs. Irsan Saleh3, Chairil Anwar4

1Mahasiswa Fakultas Kedokteran Unsri, 2Departemen Patologi Anatomi RS.Moh. Hoesin, 3Departemen Farmakologi FK Unsri, 4Departemen Parasitologi FK Unsri

Tujuan.Penelitian ini dilakukan untuk mengidentifikasi polimorfisme gen VEGF 936 C/T pada Penderita Kanker Payudara di RSUP Moh. Hoesin Palembang.Metode.Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif dengan metode cross sectional. Penelitian ini dilakukan Laboratorium Mikrobiologi dan Biomolekuler Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya (FK UNSRI) pada bulan Juli hingga Desember 2011. Sampel diteliti dengan teknik PCR dan pemotongan enzim NlaIII dengan teknik RFLPHasil.Jumlah subjek dalam penelitian ini 25 orang. Rerata umur pada kelompok kasus dan kontrol adalah masing-masing 46,92 ± 15,08 tahun. Distribusi genotip TT, CT dan CC pada kasus masing-masing 0 (0%), 9 (36%) dan 16 (64%). Distribusi frekuensi Alel T sebesar 18% , sementara alel C sebesar 82%.Simpulan. penderita kanker pudara yang berobat di RSUP dr. Mohammad Hoesin Palembang ditemukan Genotip CC sebesar 64%, genotip CT sebesar 36%, dan, tidak ditemui genotip TT. Alel C sebesar 82%, dan Alel T sebesar 18%.

Kata kunci: polimorfisme, gen VEGF 936 C/T, kanker payudara, angiogenesis, genotip, alel

Kanker payudara merupakan gangguan sistem reproduksi dan masalah keganasan pada organ reproduksi tambahan yang banyak ditemukan, tetapi sampai saat ini etiologi dan patogenesisnya belum diketahui dengan pasti. Organisasi kesehatan dunia (WHO) menyatakan bahwa kanker payudara merupakan kanker dengan insidens tertinggi kedua di dunia setelah kanker paru-paru. Sementara data dari pemeriksaan patologi di Indonesia menyatakan bahwa kanker payudara pada wanita menduduki peringkat kedua tertinggi penyebab kematian setelah kanker leher rahim dan terdapat kecenderugan dari tahun ke tahun insidens penyakit ini meningkat.1

The National Breast Cancer Coalition (NBCC) memperkirakan akan ditemukan 230.840 kasus baru kanker payudara invasif dan 57.650 kasus baru kanker payudara insitu pada tahun 2011. Di Indonesia, berdasarkan

Patological Based Registration kanker payudara mempunyai insidens relatif 11,5%, artinya terdapat 11-12 kasus baru per 100.000 penduduk berisiko. Selain jumlah yang banyak, lebih dari 50% kasus masih berada dalam stadium lanjut.2,3

Salah satu faktor pertumbuhan kanker payudara tergantung pada kemampuan angiogenesis, yaitu kemampuan sel tumor untuk membentuk suatu pembuluh darah baru yang berasal dari endothelium vaskularisasi yang telah ada.4

Salah satu faktor angiogenik yang paling penting dan poten adalah Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) yang berikatan dengan reseptornya tyrosin kinase pada sel endothelial pembuluh darah.5

Berdasarkan studi in vitro dan in vivo, peningkatan ekspresi gen VEGF berhubungan dengan pertumbuhan tumor dan metastasis,

1

sedangkan inhibisi sinyal VEGF mengakibatkan penekanan pada angiogenesis dan pertumbuhan tumor.5,6

Salah satu penyebab peningkatan ekspresi gen VEGF adalah suatu polimorfisme, suatu istilah yang digunakan untuk menandakan bentuk yang beda dari struktur dasar yang sama. Polimorfisme pada gen VEGF 936 C/T pada daerah 3’V untranslated region memiliki kadar VEGF plasma yang lebih rendah pada orang sehat.7,8

Polimorfisme suatu gen pada genom manusia sering disebabkan oleh adanya mutasi pada basa nukleotida tunggal atau single nucleotide polymorphisms (SNPs) pada gen tersebut.5

Untuk menguji hipotesis tersebut, The Shanghai Breast Cancer Study, telah melakukan penelitian case-control terhadap 1084 orang normal dan 1.193 penderita kanker payudara pada periode 1996-2000. Dari penelitian tersebut didapatkan hasil bahwa polimorfisme gen VEGF 936 C/T tidak berhubungan terhadap risiko untuk berkembangnya kanker payudara, hanya berhubungan terhadap prognosis penderita kanker payudara.5

Pada penelitian lainnya, Krippl et al (2002) melaporkan polimorfisme gen VEGF 936 C/T menurunkan risiko untuk terkena kanker payudara berdasarkan case-control study pada populasi wanita Austria terhadap 500 penderita kanker payudara dan 500 individu sehat.8 Wehrschuetz et al (2009) melaporkan polimorfisme gen VEGF 936 C/T berhubungan dengan peningkatan risiko berkembangnya kanker payudara berdasarkan pemeriksaan mammografi dengan menggunakan BI-RADS Score terhadap 54 wanita yang dicurigai terkena kanker payudara dan 52 wanita normal.6

Sejumlah penelitian yang telah dilakukan memiliki hasil yang tidak sama dan bertolak belakang. Sejauh ini, belum ada penelitian tentang identifikasi dan hubungan

polimorfisme gen VEGF terhadap kanker payudara di Indonesia, khususnya di Sumatera Selatan. Oleh karena itu, diperlukan suatu penelitian identifikasi dan hubungan polimorfisme gen VEGF pada penderita kanker payudara di RSUP dr. Mohammad Hoesin Palembang. Penelitian hubungan varian-varian gen VEGF pada penderita kanker payudara menjanjikan sarana baru bagi klinisi untuk mengevaluasi kerentanannya sebagai faktor predisposisi genetik dan menjadi salah satu acuan dalam menentukan modalitas terapi antiangiogenik.

MetodePasien

Populasi target dalam penelitian ini adalah penderita kanker payudara yang bertempat tinggal di Sumatera Selatan. Sedangkan populasi terjangkau dalam penelitian ini adalah penderita kanker payudara yang dirawat inap dan rawat jalan di bagian bedah RSUP dr. Mohammad Hoesin Palembang.

Kriteria Inklusi dalam penelitian ini adalah (1) Pasien yang telah didiagnosis kanker payudara oleh dokter spesialis patologi anatomi berdasarkan pemeriksaan histopatologi dan datang berobat ke RSUP dr. Mohammad Hoesin Palembang. (2) Ras Melayu yang berdomisili di wilayah Sumatera Selatan. (3) Kanker Payudara dengan diagnosis PA Invasive Ductal Carcinoma Mamma (IDCM). (4) Bersedia mengikuti penelitian yang dinyatakan dengan menandatangani surat persetujuan atas dasar kesadaran (informed consent).

Kriteria Eksklusi dalam penelitian ini adalah (1) Pasien yang tidak memiliki penyakit kanker payudara. (2 )Wanita hamil. Pasien yang (3) Lebih dari satu keganasan (neoplasma). (4) Pasien yang tidak bersedia atau menolak ikut serta dalam penelitianSampel darah diambil melalui punksi vena antecubiti sebanyak 3 ml, sebelumnya dilakukan tindakan antiseptik dengan alkohol

2

70%. Kemudian sampel darah dimasukkan ke tabung reaksi yang mengandung anti koagulan ethylene diamine tetraacetic (EDTA) dan disimpan pada suhu -200 Celcius hingga pemeriksaan PCR dilakukan.

Analisa Genotipa. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Genom diisolasi dari limfosit. Selanjutnya gen VEGF diperbanyak melalui PCR. Primer (rantai RNA yang telah ada yang terikat dengan cetakan DNA ke mana nukleotida ditambahkan selama sintesis DNA) yang digunakan adalah 5’-AAGGAAGAGGAGACTCTGCGC-3’ untuk primer VEGF F (forward) dan 5-TATGTGGGTGGGTGTGTCTACAGG-3’ untuk primer VEGF R (reverse). Selanjutnya produk PCR dideteksi dengan elektroforesis dan divisualisasi dengan sinar UV.Amplifikasi dilakukan pada DNA Thermal cycle merk Icycler BIO-RAD Laboratories GB yang diprogram untuk siklus 2 langkah berdasarkan metode Yaich yang dimodifikasi, yaitu denaturasi pada suhu 950C selama 4 menit,

diikuti 30 siklus denaturasi pada suhu 950C selama 60 detik, annealing pada suhu 580C selama 60 detik dan extension pada suhu 720C selama 60 detik. Siklus terakhir dilakukan final extension selama 4 menit pada suhu 720C.b. RFLP (restriction fragment length polymorphism)

Deteksi polimorfisme gen VEGF 936 C/T dilakukan dengan memotong DNA produk PCR menggunakan enzim restriksi NlaIII. Pada saat divisualisasi, adanya polimorfisme pada promoter 3’V untranslated region akan menyebabkan pita basa DNA terlihat terpotong menjadi 2 bagian. Produk PCR yang sudah ditambahkan dengan enzim restriksi akan diinkubasi pada suhu 370C selama 180 menit. Proses tersebut menggunakan campuran reaksi sebanyak 30 μl yang terdiri dari buffer 1,2μl, amplicon 8μl, enzim 0,2μl dan ddH2O 2,6μl. Semua produk PCR-RFLP divisualisasi setelah dilakukan elektroforesa pada agarose 2,5% dengan pengecatan ethidium bromide.

Denaturasi Ekstensi

1. Denaturasi Awal 2 Siklus 30x 3 Ekstensi tambahan

Gambar 1. Kondisi mesin PCR untuk amplifikasi gen VEGF 936 C/T

3

950C 950C 720 C 720 C

04.00 01.00 Annealing 01.0004.00

580C

01.00

-40C00.00

Hasil

Genotipe gen VEGF 936 C/T posisi 3’V Unstralated Region

Setelah tahapan ekstraksi/isolasi DNA selesai dilakukan dilanjutkan dengan Restriction Fragment Length Polimorphism (RFLP) yaitu tahapan restriksi menggunakan enzim NlaIII, dengan cara mencampur produk hasil PCR dengan enzim restriksi NlaIII pada suhu 370C selama 2 jam.

Setelah selesai dilanjutkan dengan elektroforesis menggunakan gel agarose 2,5% yang mengandung ethidium bromide. Polimorfisme gen VEGF 936C/T akan tervisualisasi dengan menggunakan sinar ultra violet, terlihat 3 variasi genotip hasil pemotongan enzim restriksi NlaIII terhadap produk ekstraksi / isolasi DNA, yaitu:

1) Gambaran 1 pita yaitu pada 198 bp berarti amplikon (hasil isolasi DNA yang sudah di PCR) tidak terjadi pemotongan oleh enzim NlaIII pada kedua alel berarti amplikon tersebut mengandung genotip homozigot CC.

2) Gambaran 2 pita yaitu pada 114 bp dan 84 bp berarti amplikon yang direstriksi terjadi pemotongan oleh enzim NlaIII pada kedua alel berarti genotip homozigot TT.

3) Gambaran 3 pita yaitu pada 198 bp, 114 bp dan 84 bp berarti amplikon yang direstriksi terjadi pemotongan pada satu alel dan tidak terjadi pemotongan pada alel pasangannya berarti genotip yang terkandung adalah heterozigot CT.

Gambar 2. Polimorfisme gen VEGF 936C/T setelah dilakukan RFLP. M = marker DNA penanda, Uc= uncut, alel T (114bp, dan 84bp) dan alel C (198bp=C). Genotip CT pada lajur 2 dan Genotip CC pada lajur 1, 3, 4, dan 5.

Keterangan: Sampel nomor 1, 3, 4, 5 genotip heterozigot (terpotong dan memiliki dari tiga pita, pada 198 bp, 114 bp dan 84 bp). Sampel nomor 2 genotip wild type (tidak terpotong dan hanya memiliki satu pita pada 198 bp).

Setelah semua subyek penelitian menjalani proses isolasi DNA, PCR dan RFLP, maka didapatkan distribusi frekuensi genotip gen VEGF 936C/T Pada penelitian ini, yaitu distribusi genotip TT, CT, dan CC dan masing-masing 0(0%), 9(36%) dan 16(64%) . (Tabel 1)

Tabel 1. Distribusi Frekuensi Genotip Gen VEGF 936C/T

(n=25).

4

Genotip Jumlah Persentase (%)

CC

CT

TT

9

16

0

64

36

0

Total 25 100

Diskusi

Polimorfisme adalah suatu istilah yang digunakan untuk menunjukkkan adanya bentuk yang berbeda dari struktur dasar yang sama. Suatu lokus gen dikatakan polimorfik jika alel yang sering ditemukan frekuensinya tidak lebih besar dari 99% pada lokus yang bersangkutan. Salah satu contoh polimorfisme yang telah dikaji dengan baik pada manusia adalah polimorfisme golongan darah ABO.

Polimorfisme suatu gen pada genom manusia disebabkan adanya mutasi pada basa nukleotida tunggal atau single nucleotide polymorphisms (SNPs) pada gen tersebut. SNPs merupakan varian genetik yang paling banyak dijumpai pada individu dalam suatu spesies. SNPs tidak bermanifestasi klinis, tetapi bisa menentukan kerentanan terhadap penyakit.

Polimorfisme pada gen VEGF tidak menyebabkan perubahan struktur, tetapi dapat menyebabkan perubahan fungsi VEGF. Sampai saat ini telah ditemukan 30 SNP pada gen VEGF. Tetapi, terdapat tiga SNP yang dikenal secara umum berhubungan produksi protein VEGF, yaitu SNP +405 C/G pada 5’ untranslated region, -460 T/C pada promoter region, dan +936 C/T pada 3’ untranslated region yang dilaporkan berhubungan dengan protein VEGF.7,8 Polimorfisme gen VEGF 936 C/T akan dianggap positif jika gen yang mengkode asam amino pada urutan 936 C berubah menjadi T yang dapat diidentifikasi dan divisualisasi melalui metode PCR-RFLP.

Terdapat enam jenis kelainan fisiologis sel untuk dapat timbulnya suatu keganasan yaitu: (1) kemampuan untuk menghasilkan sinyal pertumbuhan (growth signal); (2) kemampuan untuk menghambat sinyal penghambat pertumbuhan (growth-inhibitory signal); (3) kemampuan menghindari apoptosis; (4) kemampuan untuk mengadakan replikasi yang tidak terbatas; (5) kemampuan

angiogenesis; serta (6) kemampuan invasi dan metastasis.9,10

Beberapa penelitian menunjukkan bahwa polimorfisme pada gen VEGF 936 C/T dapat meningkatkan risiko terjadinya kanker payudara akibat adanya proses angiogenesis yang diinisiasi oleh gen VEGF.

Angiogenesis adalah pembentukan pembuluh kapiler baru yang berasal dari pembuluh darah yang telah ada. Angiogenesis terjadi secara fisiologis selama masa embriogenesis, siklus menstruasi wanita, dan proses penyembuhan luka.11 Peningkatan respons angiogenesis abnormal dapat ditemukan pada kasus rheumatoid arthritis, retinopati diabetik, dan selama pertumbuhan tumor.

Sel tumor meregulasi proses angiogenesis melalui faktor proangiogenik yang disekresikan oleh sel kanker. Kanker payudara merupakan pertumbuhan baru yang ganas, terdiri dari sel-sel epitelial yang cenderung menginfiltrasi jaringan sekitarnya dan menimbulkan metastasis. Sebagian besar kanker pada manusia tumbuh secara lambat dan tetap terlokalisasi (in situ) selama beberapa tahun sebelum menjadi invasif dan metastatik. Perubahan dari carcinoma in situ menjadi kanker malignan invasif membutuhkan neovaskularisasi tumor. Jarak maksimum dari pembuluh darah yang dapat ditempuh oleh oksigen dan nutrient melalui proses difusi diperkirakan pada zona 1-2 mm (garis tengah atau ketebalan). Tumor yang berukuran di atas zona 1-2 mm akan sulit membesar akan sulit membesar tanpa vaskularisasi karena hipoksia memicu apoptosis dengan mengaktifkan gen penekan tumor. Pada keadaan suplai difusi tidak mencukupi kebutuhan nutrisinya, sel tumor akan menstimulasi pelepasan faktor angiogenetik yang menginduksi pertumbuhan kapiler dari jaringan sehat sekitarnya sehingga

5

terbentuklah vaskularisasi yang secara anatomi dan fisiologis tidak normal.

Rerata umur sampel pada penelitian ini berbeda dari literatur, contoh penelitian Krippl et al (2002)8 melaporkan hasil rerata umur yang lebih tinggi yaitu 56,4 + 11,0 tahun, begitu juga Wehrschuetz et al (2009) dengan rerata 54.5 + 11.8 tahun.6 Usia merupakan faktor resiko terjadinya kanker payudara, yaitu insidens akan meningkat setelah usia 50 tahun. Lebih dari 90% kanker payudara terdiagnosis pada usia lebih dari 50 tahun walaupun dapat terjadi pada semua usia.18 Kemungkinan, perbedaan rerata umur ini dapat terjadi karena jumlah sampel yang lebih sedikit sehingga tidak bisa mewakili seluruh populasi penderita kanker payudara.

Untuk menghindari bias yang diakibatkan oleh jenis kanker payudara, maka penelitian ini hanya mengikutkan subjek kasus yang menderita Invasive Ductal Carcinoma Mamma. Selain itu, pengaruh khemoterapi terhadap stabilitas materi genetik juga dicoba untuk dihindari dengan mengeluarkan subjek kasus yang pernah mendapat khemoterapi. Kiranya dengan usaha tersebut di atas dapat meminimalkan bias pada penelitian ini.

Setelah semua subyek penelitian menjalani proses isolasi DNA, PCR dan RFLP, maka didapatkan distribusi frekuensi genotip gen VEGF 936C/T Pada penelitian ini, yaitu distribusi genotip TT, CT, dan CC dan masing-masing 0(0%), 9(36%) dan 16(64%) . Pada penelitian ini didapatkan distribusi frekuensi alel polimorfisme Gen VEGF 936C/T, yaitu alel T berjumlah 9 (18%) dan distribusi alel C berjumlah 41 (82%).

Distribusi frekuensi genotip dan alel gen VEGF 936 C/T pada penelitian ini

berbeda dengan literatur, yaitu penelitian penelitian Krippl et al di Austria (2002). Penelitian Krippl et al, terhadap 500 subjek penelitian penderita kanker payudara, melaporkan bahwa distribusi frekuensi genotip CC, CT, dan TT adalah 82,4%, 15,8%, dan 1,8%. Distribusi frekuensi alel C dan T pada penelitian Krippl et al adalah 90,3% dan 9,7%. Perbedaan perlakuan antara penelitian ini dan literatur adalah pada kriteria inklusi, yaitu penelitian ini memasukkan etnis melayu dan pembatasan hasil PA Invasive Ductal Carcinoma Mamma sebgai kriteria inklusi, sedangkan pada literatur tidak. Selain itu, jumlah subjek penelitian yang jauh lebih sedikit juga berpengaruh terhadap persentase hasil yang mewakili seluruh populasi.

Mutasi yang terjadi pada promotor gen VEGF 936 C/T yang dipotong dengan enzim NlaIII yaitu perubahan basa C (sitosin) menjadi basa T (timin). Dengan teknik RFLP, maka mutasi tersebut dapat diidentifikasi. Genotip wild type (CC) saat divisualisasi akan terlihat pita dengan berat basa 198 bp. Genotip heterozigot (CT) saat divisualisasi akan terlihat 3 pita yaitu pada daerah marker 198 bp, 114 bp, dan 84 bp. Sedangkan genotip homozigot mutan (TT) saat divisualisasi akan terlihat 2 pita pada daerah marker 114 bp dan 84 bp.5,6,7

Mutasi alel (TT) pada genotip promotor gen VEGF 936 C/T pada individu berhubungan dengan peningkatan ekspresi gen ini dalam proses angiognesis, sehingga meningkatkan faktor risiko terjadinya kanker dan memperparah prognosis, contohnya kanker payudara. 5,6,7,12

6

Berdasarkan analisis data dan pembahasan yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa pada penderita kanker paudara yang dijadikan subjek penelitian didapatkan hasil sebanyak 9 orang (18%) yang mengalami polimorfisme heterozigot dan homozigot (mutan). Sedangkan 16 orang lainnya (82%) tidak terbukti mengalami polimorfisme (wild type).

DAFTAR PUSTAKA

1. Anonimus. 2011. Jurnal Kedokteran Tumor Mammae. Artikel Kedokteran.Net:Bedah [Online]. Tersedia http://artikelkedokteran.net/jurnal-kedokteran-tumor-mamae.html [diakses tanggal 10 Agustus 2011].

2. National Breast Cancer Coalition. 2011. Facts and Statistics about Breast Cancer in the United States. The Breast Cancer Deadline 2020 [Online].Tersedia http://www.breastcancerdeadline2020.org/know/analyses-factsheets--other/ [diakses tanggal 10 Agustus 2011].

3. Anonimus. 2011. Kanker Payudara, Tumor. Kumpulan Artikel Bedah [Online]. Tersedia: http://ilmubedah.info/kanker-payudara-definisi-etiologi-patofisiologi-klasifikasi-diagnosis-pengobatan-kemoterapi-20110204.html [diakses tanggal 10 Agustus 2011].

4. Devita VT, Lawrence TS, Rosenberg SA. 2008. Cancer Principles & Practice of Oncology: Ed 8 Vol 2. Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia.

5. Lu H, Shu XO, Cui Y, Kataoka N, Wen W, Cai Q, Ruan ZX, Gao YT, Zheng W. 2005. Association of

Genetic Polymorphisms in the VEGF Gene with Breast Cancer Survival. Cancer Research; 65:5015-5019 [Online]. Tersedia: http://cancerres.aacrjournals.org/content/65/12/5015.long [diakses tanggal 9 Agustus 2011]

6. Wehrschuetz M, SchÖllnast H, Wehrschuetz E. 2009. VEGF 936C / T Polymorphism and Association of BI-RADS Score in Women with Syspected Breast Cancer. Breast Cancer: Basic and Clinical Research in Libertas Academica Freedom to Research [PDF Online]. Austria. Tersedia http://www.lapress.com/redirect_file.php?fileId=2383&filename=BCBCR-3-Wehrschuetz-et-al&fileType=pdf [diakses tanggal 9 Agustus 2011]

7. Watson CJ, Webb NJA, Bottomley MJ, Brenchley PE. 2000. Cytokine 12:1232-1235 [Pubmed Online]. Austria. Tersedia http://www.mendeley.com/research/identification-polymorphisms-within-vascular-endothelial-growth-factor-vegf-gene-correlation-variation-vegf-protein-production/ [diakses tanggal 9 Agustus 2011].

8. Krippl P, Langsenlehner U, Renner W. 2003. A Common 936 C/T Gene Polymorphisms of Vascular Endothelial Growth Factor is Associated with Decreased Breast Cancer Risk. Int. J. Cancer; 106: 468-471.

9. Kumar, V., Ramzi S. Cotran, Stanley L. Robbins. 2007. Buku Ajar Patologi Robbins; Ed.7 Vol 2. Jakarta.

10. Brunicardi FC, Andersen DK, Billiar TR. 2010. Schwart’s Principles of Surger; Ed 9. McGraw-Hill [ebook]. Houston.

7

11. Ruddon RW. 2007. Cancer Biology. Ed 4. [Ebook] Oxford University Press. New York.

12. Ferrara N. 2004. Vascular Endothelial Growth Factor: Basic Science and Clinical Progress. Endocrine Reviews; 25(4):581-611 [Online]. San Fransisco.

Tersedia http://edrv.endojournals.org/content/25/4/581.abstract [Diakses Tanggal 15 Agustus 2011].

8