ANALISIS KIMIAPROGRAM DIPLOMAINSTITUT PERTANIAN BOGOR2013

PendahuluanMikroorganisme yag ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu juga dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasikan ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.( Volt W A. Dan Margaret F W 1989).Pewarna gram atau metode gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasikan bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah erfiksasi dikenai larutan-larutan berikut :zat pewarna kristal violet, larutan iodium, larutan alkohol, dan zat pewarna tandinganberupa zat warna safranin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuanDenmark Hans Christian Gram (1853- 1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884, untuk membedakan antarapneumokokusdanklebsiella pneumonieae. Bakteri yang terwarnaidengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri gram positig dan bakteri gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violetdan karenanya akan tampak berwarna ungu tua dibawah mikroskop. Adapun gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci denan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air safranin akan tampak berwarna merah. Perbedan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dindingselnya ( pelezar M J 1989).Spora dibentuk oleh jenis bakteri tertentu terutama genusbacillusdancostridium. Pada umumnya spora terdapat pada endospora dengan letak dan ukuran yang berbeda. Spora pada bakteri dibentuk pada kondisisecara kimiawi dan kondisi kimiawi yang kurang menguntungkan misalnya nutrisi, sinar panas dan kering. Macam-macam metode yang digunakan untuk melihat spora, yaitu Schaefferfulton, Bartolomew- Mitter, Klein dan Donner. Pewarnaan spora dapat digunakan untuk membantu identifikasi bakteri. Letak spora ada tiga macam, yaitu sentral ( letak spora berada ditengah- tengah sel), terminal ( letak spora ada diujung sel) dan sub terminal ( letak spora diantara ujung-ujung dan ditngah-tengah terminal) ( Dwidjoseputro, 2005).TujuanPraktikum bertujuan untuk mengetahui cara pewarnaan gram dan spora serta mengetahui jenis gram dan ada tidaknya spora padaEscherchia ColidanBacillus.Alat dan BahanAlat-alat yang digunakan pada praktikum ini ialah mikroskop, kaca objek, pipet tetes, kawat ose, pembakar spirtus, gelas piala, kasa asbes, botol semprot danhot plate.Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini ialah biakan bakteriEscherchia ColidanBacillus, alkohol, kristal ungu, larutan iodin, safranin,malacite green, kertas serap dan aquades.Prosedur kerjaPewarnaan Gram dilakukan dengan biakan bakteri diambil dengan kawat ose dan dioleskan di kaca objek, dan dibiarkan kering. Kemudian setelah kering difiksasi di atas pembakar spirtus hingga bakteri melekat pada kaca objek yang ditandai dengan bakteri yang berwarna keruh. Setelah itu bakteri ditetesi larutan kristal ungu selama kurang lebih satu menit, dan dicuci dengan aquades kemudian dikeringkan. Setelah kering bakteri kemudian ditetesi iodin kurang lebih 1 menit, dicuci dengan aquades kemudian dikeringkan. Setelah kering bakteri ditetesi alkohol selama kurang lebih 30 detik, dan dicuci kembali dengan aquades kemudian dikeringkan. Setelah dicuci dan dikeringkan,ditetesi safranin selama 30 detik, kemudian dicuci dan dikeringkan menggunakan kertas serap, setelah itu diamati dengan perbesaran 1000X.Pewarnaan spora dilakukan dengan biakan bakteri diambil dengan kawat ose dan dioleskan di kaca objek. Dan dibiarkan sampai kering, setelah keringkemudian difiksasi di atas pembakar spirtus hingga bakteri melekat pada kaca objek yang ditandai dengan bakteri yang berwarna keruh. Bakteri kemudian ditetesimalacite greendan diuapkan di atas penangas air 2 sampai 3 menit, setelah dingin dicuci dengan aquades. Kemudian bakteri ditetesi safranin selama kurang lebih 30 detik, setelah itu dibilas, dan dikeringkan dengan kertas serap, kemudian diamati dengan perbesaran 1000X.Data dan Hasil PembahasanBerdasarkan hasil pengamatan didapat data seperti yang terlihan pada tabel berikut ini :Tabel 1 Pewarnaan gram pada bakteriBakteriGram (+/-)Warna

Escherchia Coli-Merah muda

Bacillus+Ungu

Gambar 1 pewarnaan gram pada bakteribacillis sp

Gambar 2 pewarnaan gram pada bakteriEscherchia ColiTabel 2 Pewarnaan spora bada bakteriBacillusBakteriGram (+/-)Warna

Bacillus+Merah muda

Gambar 3 hasil pewarnaan spora pada bakteribacillus spPembahasanUmumnya bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa). Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak membiaskan cahaya hal tersebut menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna dapat mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Mengamati bakteri dalam kehidupan sangat sulit sehingga dikembangkan teknik pewarnaan sel bakteri agar sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati (Karmana 2007). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, pelunturan warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat pewarna penutup.Pada praktikum kali ini dilakukan dua teknik pewarnaan yaitu pewarnaan pada bakteri dan pewarnaan pada spora. Diawali dengan mengoleskan isolat bakteri (Bacillus SP) dengan tujuan agar isolat bakteri dapat merata dikaca preparat. Lalu dilakukan fiksasi untuk melekatkan mikroorganisme di kaca preparat. Pemberian Kristal ungu bertujuan untuk memberi warna pada bakteri. Sedangkan pemberian Iodium bertujuan untuk memperkuat warna pada bakteri. Alkohol 96% berfungsi sebagai pemucat atau peluntur warna pada bakteri. Dan tahap terakhir yaitu pemberian safranin yang berfungsi untuk memberi warna kembali pada bakteri yang telah kehilangan warna pada proses pemucatan dengan menggunakan alkohol.Pada bakteri di preparat menunjukkan warna ungu. Hal ini membuktikan bahwa bakteri di preparat merupakan bakteri gram positif dikarenakan pada bakteri ini mengandung banyak peptidogligan sehingga mudah berikatan dengan kristal ungu. Jika berwarna merah muda menunjukan bakteri gram negatif dikarenakan pada bakteri tersebut mengandung banyak lipid sehingga mudah berikatan dengan safranin.Hasil uji bakteriE-Collidanbakteri agar miring atauBacillus spdapat mempertahankan warna primernya walaupunmengalami dekolorisasi(pencucian) ketika ditambahkan alkohol sehingga bakteriE-Collidan bakteriBacillus spmerupakan kelompok bakteri gram positif.Prinsip pewarnaan gram didasarkanpada perbedaan struktur dinding sel sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan perbedaan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci (Dwidjosapuro 2005).Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat apusan preparat. Kemudian preparat diberikan malakit hujau yang berfungsi sebagai pewarna primer yang digunakan untuk melumuri fiksasi panas. Preparat diuapkan diatas air mendidih dengan tujuan untuk memperbesar pori-pori bakteri agar pada saat pewarnaandapat menembus dinding endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air dialirkan dari atas, yang bertujuanuntuk menghilangkan malacite green dari seluruh bagian sel endospora. Pewarnaan safranin bertujuan untuk counterstein yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang lain dari pada endospora.Hasil uji bakteriBacillus spmenghasilkan bakteri gram positif. Prinsip pewarnaan spora didasarkan pada penggunaan zat warnamalachite greendansafranindimana pada hasil pewarnaan akan menghasilkan warna hijau pada spora dan warna merah pada sel vegatitifnya (Lay 1994).SimpulanBerdasarkan hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa bakteri gram positif terdapat pada bakteriBacillus spkarena gram positif dapat mempertahankan warna awalnaya.sedangkan gram negatifnya terdapat pada bakteriE-Colli, karena gram negatif kehilangan kompleks ungu kristal pada waktu pembilasan dengan alkohol.Daftar pustakaDwidjoseputro.2005.Dasar-Dasar Mikrobiologi.Jakarta:PT GramediaKarmana.2007.Biologi.Jakarta:PT Grafindo Media PratamaLay.1994.Mikrobiologi Umum.Herna,Penerjemah.Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari:General Microbiology.Pelezar chan. 2008.Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI Press: JakartaMargareth F W. 1998.Mikrobiologi DasarJilid 1. Jakarta : Erlangga

Laporan pewarnaan gram

A.TujuanMengetahui bakteri gram positif dan bakteri gram negatif

B.Dasar TeoriPewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :1. Pewarnaan sederhanaPewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

a.pewarnaan asamMerupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

b.Pewarnaan BasaPewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

2. Pewarnaan Diferensial (Gram)Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.a. Bakteri Gram NegatifBakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak.b. Bakteri Gram PositifBakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.SifatBakteri garam (+)Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding selKandungan lipid rendah (1-4%)Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap penisilinLebih sensitifLebih tahan

Penghambatan oleh pewarna basa (VK)Lebih dihambatKurang dihambat

Kebutuhan nutrisiKebanyakan spesies relatif kompleksRelatif sederhana

Ketahanaa terhadapperlakuan fisikLebih tahanKurang tahan

(Manurung, 2010).

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3% (hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).

4. Pewarnaan KhususPewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genusClostridium, Desulfomaculatum, danBacillusadalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)a.Pewarnaan kapsulPewarnaan ini menggunakan larutankristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakangyang berwana biru gelap.b. Pewarnaan sporaDinding spora relatiftidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat.c. Pewarnaan flagelPewarnaan flagel dengan memberi suspensikoloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.d. Pewarnaan nucleoidPewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA(Rudi, 2010).

A.Alat dan BahanNOAlatJumlahBahan

1Jarum ose1Biakan murniB. cereusdanE.colipada medium NA yang berumur 24 jam

2Pembakar spirtus1Aquades steril

3Kaca preparat1Larutanhuckers crystal violet

4Pipet tetes1Larutanmordan lugol iodine

5Mikroskop1Larutan alkohol 96%

6Gelas kimia3Larutansafranin

7Kaca objek1

8Tabung reaksi1

B.Kaca Objek

Cara Kerja

Dibersihkan dengan menggunakan alkoholDikeringkan dengan cara dianging-anginkan pada apiKaca objek yang telah steril

Ditetesi aquades

Jarum ose

Dibakar sampai merahDicelupkan pada alkoholJarum ose yang steril

Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan pada api

Sampel e.coli dan Bacillus

Diambil menggunakan jarum ose (medianya jangan sampai terambil).Disimpan di atas kaca objekAduk pelan-pelan sampai tercampur dengan aquades yang telah adapada kaca objekKaca objek yang telah berisi sampel

Dikeringkan dengan cara dipanaskan di atas api kecil.

Ditetesi violet sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)Dicuci dengan air yang mengalirDitetesi lugol sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)Dicuci dengan air yang mengalirDitetesi alkohol 96% ( diamkan selama 45 detik)Dicuci dengan air yang mengalirDitetesi safranin sampai sampel bakteri terendam (diamkan selama 1 menit)Dicuci dengan air yang mengalirDikeringkan pada udara terbukaHasil

Diamati dibawah mikrosko

A.Hasil Pengamatan dan PembahasanTabel pengamatanGambar 1. FiksasiSumber : dokumentasi PribadiBakteri yang telah di ambil kemudian di simpan pada kaca objek yang dicampur dengan setetes aquades. Setelah itu difiksasi di atas api sampai kering. Pemanasan tidak boleh terlalu panas karena bisa merusak sel bakteri.

Gambar 2. Pada saat ditetesi violetSumber : dokumentasi pribadiSetelah difiksasi, sampel ditetesi violet. Sampai bakteri terendam. Lalu biarkan selama 1 menit. Setelah itu, cuci di air yang mengalir. Hasilnya terdapat warna ungu pada kaca objek.

Gambar 3. Penambahan lugolSumber : dokumentasi pribadiKemudian bakteri ditetesi lugol sampai terendam lalu biarkan 1 menit dan cuci di air yang mengalir. Setelah dicuci, kaca objek tetap berwarna ungu akibat dari tetesan violet.

Gambar 4. Saat ditetesi alkohol 96%Sumber : dokumentasi pribadiSetelah ditetesi lugol dan dicuci, bakteri ditetesi alkohol 96% dan dibiarkan selama 45 detik. Setelah itu, cuci di air yang mengalir. Setelah dicuci, warna ungu pada kaca objek menghilang akibat penambahan dari alkohol.

Gambar 5. Pada saat ditetesi safraninSumber : dokumentasi pribadiSetelah warna ungu pada bakteri hilang, kemudian bakteri ditetesi safranin sampai terendam dan biarkan selama 1 menit. Kemudian cuci di air yang mengalir. Hasilnya, bakteri yang dihasilkan berwarna merah muda.Gambar 6. Hasil pewarnaanSumber :dokumentasi pribadi

Gambar 7. Hasil pengamatan pada mikroskop (pembesaran 40x10)Sumber : dokumentasi pribadi

Gambar B. cereus padapembesaran 16x10Sumber : Purna,2012.laporan praktikum mikrobiologi

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).

Penambahan violet pada bakteri.Kristal violet merupakan reagen yang berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama1 menitbertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri.

Penambahan lugol pada bakteri. Lugolmerupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberianlugolpada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zatlugolterperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel.Lugolyang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atasobjek glasstersebut kemudian didiamkan selama45detik. Setelah itu,kaca objekdibilas denganairhingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.

Selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di ataskaca objektersebut kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu,kaca objekdibilas dengan airhingga warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat.

Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadapkaca objekdengan menggunakan air. pembilasan ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan dari airdengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.

B.KesimpulanDari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa, bakteri e.coli yang berwarna merah merupakan gram negatif dan bacillus yang berwarna ungu merupakan gram positif.

Daftar PustakaAditya,Mushoffa.2010.TeknikPewarnaanBakteri.http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html. 11 November 2010

Fitria, Bayu. 2009.Pewarnaan Gram (Gram positif dan Gram Negatif).http://biobakteri.wordpress.com/2009/06/07/7-pewarnaan-gram-gram-positif-dan-gram-negatif.11 November 2010.

Hadioetomo, R. S. 1993.Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia.

Karuniawati, Risdiyani, S. Nilawati, Prawoto, Y. Rosana, B. Alisyahbana, I. Parwati, Wia Melia, dan T.M. Sudiro. 2005. Perbandingan Tan Thiam Hok, Ziehl Neelsen dan Fluorokrom sebagai Metode Pewarna Basil Tahan Asam untuk Pemeriksaan Mikroskopik Sputum.Makara Kesehatan Vol. 9 No. 1.

Manurung,Pebrin.2010.PengamatanBentukBakteri.http://pebrinmanurung.blogspot.com/2010/10/pengamatan-bentuk-bakteri.html. 11 November 2010.

Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010.Petunjuk Praktikum Mikrobiologi.Laboratorium Mikrobiologi UNS

DASAR TEORI LAPORAN PEWARNAANPEWARNAANI.PENDAHULUANA.Latar BelakangSel bakteri dan mikroorganisme lainnya diamati dengan bantuan mikroskop. Terutama sel bakteri selain selnya sangat kecil, juga transparan dan tidak berwarna. Setelah metode pewarnaan diketahui dan dikembangkan. Pengamatan bakteri menjadi lebih muda. Bahkan hasil pewarnaan itu dapat digunakan untuk pewarnaan lebih lanjut dan mendalam. Diantaranya digunakan dalam penentuan jenis atau identifikasi. Banyak metode pewarnaan yang dapat dilakukan dan setiap metode mempunyai tujuan-tujuan tertentu. (Mila Ermila, 2005, Penuntun Praktikum Mikrobiologi)B.Tujuan PraktikumMempelajari tehnik pewarnaan dan mengamati bentuk-bentuk bakteri dan reaksinya terhadap zat kimia (pewarna)II.TINJAUAN PUSTAKAPewarnaan gram menghasilkan 2 (dua) kelompok besar bakteri, yaitu gram positif yang berwarna ungu dan gram negatif yang berwarna merah. Adanya hram positif dan gram negatif disebabkan oleh perbedaan bandingan dinding sel bakteri. Kandungan senyawa peptidoglikan pada dinding sel gram positif lebih tebal dibandingkan pada dinding gram negatif. Beberapa cara pengecetan, yaitu :-Pengecetan negatif-Pengecetan sederhana-Pengecetan gram-Pengecetan ziehl nielsen-Pengecetan kapsul-Pengecetan spora-Pengecatan flagella(Ani Murniati, 2000. Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi)Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah memilen biru, krisdal violet dan karbol fuehsin.(Mila Ermila, 2005, Penuntun Praktikum Mikrobiologi)

TEKNIK PEWARNAAN MIKROORGANISMEA. PENDAHULUANMelihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basaPewarna asam dapat tejadi karena bila senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Pewarna asam ini disebut pewrna negatif. Contoh pewarna asam misalnya : tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, eosin dan lain-lain. Pewarnaan basa bisa terjadi biasenyawa pewarna bersifat positif, sehingga akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan lain-lain.Teknik pewarnaan asam basa ini hanya menggunakan satu jenis senyawa pewarna, teknik ini disebut pewarna sederhana. Pewarnaan sederhana ini diperlukan untuk mengamati morfologi, baik bentukmaupun susunan sel. Teknik pewarnaan yang lain adalah pewarnaan diferensial, yang menggunakan senyawa pewarna yang lebih dari satu jenis. Diperlukan untuk mengelompokkan bakteri misalnya, bakteri gram positif dan bakteri gram negatif atau bakteri tahan asam dan tidak tahan asam. Juga diperlukan untuk mengamati struktur bakteri seperti flagela, kapsula, spora dan nukleus.Teknik pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang belkau yakni sebagai berikut:mempersiapkan kaca obyek. Kaca obyek ini harus bersih dan bebas lemak, untuk membuat apusan dari bakteri yang diwarnai.mempersiapkan apusan. Apusan yang baik adalah yang tipis dan kering, terlihat seperti lapisan yang tipis.Apusan ini dapat berasal dari biakan cair atau padat.Biakan Cair. Suspensi sel sebanyak satu atau dua mata jarum inokulasi diletakkan pada kaca obyek. Lalu diapuskan pada kaca obyek selebar ... cm. Biarkan mengering diudaraata diatas api kecil dengan jarak 25 cm. Biakan Padat. Bakteri yang dikultur pada medium padat tidak dapat langsung dibuat apusan seperti dari biakan cair, tapi harus diencerkan dulu. Letakkan setetes air pada kaca obyek, lalu denganjarum inokulasi ambil bakteri dari biakan padat, letakkan pada tetesan air dan apusan. Biarkan mengering diudara. Fiksasi dengan pemanasan. Apusan bakteri pada akaca obyek bila tidak diletakkan secara kuat, dapat terhapus pada waktu proses pewarnaan lebih lanjut. Proses peletakan apusan pada kaca obyek dapat dilakukan diantaranyadengan cara memanaskan diatas api.B. DASAR TEORI-pewarnaan gramProses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna (Hadioetomo, 1990).Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :- Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.- Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.- Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.

Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) :- Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek.- Fiksasi olesan pada kaca objek.- Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial.Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :- Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.- Memperjelas ukuran dan bentuk jasad- Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.- Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985).Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005)).Pewarnaan Negatif. Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam (Campbell dan Reece, 2005).Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri (Anonim, 2008):

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Irawan, 2008).Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut (Irawan, 2008):a. Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.b. Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.Pewarnaan Endospora. Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas (Irawan, 2008).Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya (Irawan, 2008):

PEWARNAAN MAJEMUK (PEWARNAAN GRAM)

Hari / Tanggal:Jumat, 14 desember 2012Tempat:Laboratorium BiologiTujuan:Mampu melakukan pewarnaan bakteri dengan menggunakan beberapa macam zat warna dengan metode gram

A.Dasar TeoriPada tahun 1884, seorang bakteriologiwan Denmark secara kebetulan menemukan prosedur pewarnaan gram. Pewarnaan ini mungkin merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan paling banyak digunakan dalam klasifikasi bakteri. (Hadieotomo,1988).Adapun tujuan dari pewarnaan adalah :1. Memudahkan melihat mikroba dengan mikroskop2. Memperjelas ukuran dan bentuk mikroba3. Melihat struktur dalam bakteri , seperti dinding sel dan vakuola4. Menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia khas dari bakteri dengan zat warna. (Waluyo, 2008)Ada 5 macam pewarnaan, yaitu :1.Pewarnaan sederhana, memungkinkan untuk melihat bakteri dengan jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dalam morfologi yang sama,2.Pewarnaan tahan asam, untuk pewarnaan bakteri yang mengandung sejumlah besar besar zat lipoid (berlemak) didalam dinding selnya yang menyebabkan tidak permeabel terhadap zat warna yang umum,3.Pewarnaan spora, untuk pewarnaan bakteri yang membentuk endospora yang tahan terhadap kondisi ekstrim sehingga dibutuhkan perlakuan yang keras,4.Pewarnaan kapsul, dan5.Pewarnaa negative, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya hitam gelap.(Volk ,1992)Komposisi dinding sel bakteri gram positive berbeda dengan bakteri gram negative. Dinding sel yang lebih yang tebal pada bakteri gram positive menyusul oleh perlakuan alkohol karena terjadi dehidrasi. Sedangkan sel-sel gram negative mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Contoh dari gram positive adalahS.aureusdan gram negative adalahE.coli.(Hadioetomo,1988).Perbedaan struktur dinding sel bakteri gram positive dan gram negative sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pemucat. Sebagian besar dinding sel bakteri gram positive terdiri dari peptidoglikan, sedangkan dinding sel bakteri gram negative mempunyai kandungan lipida yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri gram negative (Lay,1994).Pewarnaan gram/diferensial memerlukansekurang-kurangnya tiga macam reagen bahan kimia yang dipakai pada film bakteri yang sudah difiksasi. Zat kimia pertama disebut zat warna utama. Fungsi zat ini adalah untuk memberikan warna pada semua sel bakteri. Agar diperoleh warna yang kontras, zat kimia kedua yang dipakai adalah zat penghilang warna (decolourizing agent). Berdasarkan komposisi kimia komponen sel bakteri, maka zat kimia yang kedua tersebut dapat atau tidak dapat menghilangkan zat warna yang pertama dari semua bagian sel atau hanya dapat menghilangkan zat warna yang pertama dari bagian sel tertentu dalam struktur bakteri. Zat kimia yangterakhir, yaitu lawan warna (counterstain) memiliki sifat warna yang kontras dengan zat warna yang pertama. (Subandi, 2010)Peluntur cat yang digunakan untuk mendapat kontras yang baik pada bayangan mikroskop antara lain:1.Bahan peluntur untuk lemak: air, aceton, alcohol2.Bahan peluntur untuk cat basa:HCl, H2SO4, HNO3, dsb.3.Bahan peluntur untuk cat asam: KOH encer, sabun4.Garam - garam logam berat:AgNo3,CuSo4, dsb.5.Garam- garam logam ringan: Na2SO4,MgSo4, dsb. (Tim bakteriologi umum, 2005)Sifat gram ditentukan oleh sifat- sifat fisik dan kimia dinding dan membran selnya. Selama proses pewarnaan, penambahan alcohol terhadap bakteri gram negative menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga memperbesar daya rembes/permeabilitas dinding sel gram negative. Jadi kompleks Kristal violet-Iodium (lugol) yang telah memasuki dinding sel selama langkah awal dalam pewarnaan dapat diekstraksi. Karena itu gram negative kehilangan warna tersebut. Karena kandungan lipidnya lebih rendah, dinding sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi selama perlakuan dengan alcohol. Ukuran pori-pori mengecil, permeabilitas berkurang dan kompleks Kristal violetiodium tidak dapat terekstraksi. Pada saat pemberian cat penutup (safranin), bakteri gram negative terwarnai sehingga berwarna merah, bakteri gram positif tidak terwarnai sehingga berwarna ungu. (Tim bakteriologi umum, 2005)Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu :1.Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm,berlapis tiga atau multilayer.2.Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikanterdapatdidalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.3.Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.4.Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.5.Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. (Hadiotomo, 1990)Sedangkan ciri-ciri bakteri gram positif yaitu :1.Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.Mengandung asam tekoat.3.Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.4.Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. (Hadiotomo, 1990)

PembahasanBakteri yang termasuk gram positif antara lain:1.Staphylococus aureusStaphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentukseperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu:Staphylococcusaureusyang berwarna kuning danStaphylococcus albusyang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimilikiStaphylococcusaureusdiantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepaskan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008).PeranS. aureus, diantaranya penyebab bisul, jerawat, pneumonia, meningitis, dan arthritits. Sebagian besar penyakit yang disebabkan oleh bakteri ini memproduksi nanah, oleh karena itu bakteri ini disebut piogenik.S. aureusjuga menghasilkan katalase, yaitu enzim yang mengkonversi H2O2 menjadi H2O dan O2, dan koagulase, enzim yang menyebabkan fibrin berkoagulasi dan menggumpal. Koagulase diasosiasikan dengan patogenitas karena penggumpalan fibrin yang disebabkan oleh enzim ini terakumulasi di sekitar bakteri sehingga agen pelindung inang kesulitan mencapai bakteri dan fagositosis terhambat.

2.Bacillus subtilisBacillus subtilismerupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi.Bacillus subtilistumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).

3.Sarcina luteaSarcina lutea, merupakan bakteri nonmotile, gram positif, aerob (fakultatif anaerobik), Micrococcus penghasil pigmen, dapat ditemukan di udara, tanah, dan air di seluruh bumi. Bakteri ini sensitive terhadap penisilin. Koloni berwarna kuning.Sedangkan bakteri yang termasuk gram negative adalah:1.Escherichia coliEscherichia coli, atau biasa disingkatE. coli, adalah salah satu jenisspesiesutamabakterigram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan olehTheodor Escherichini dapat ditemukan dalamusus besarmanusia. KebanyakanEscherichia colitidak berbahaya, tetapi beberapa, sepertiEscherichia colitipeO157:H7, dapat mengakibatkan keracunan makanan yang serius pada manusia yaitudiareberdarah karenaeksotoksinyang dihasilkan bernamaverotoksin. Toksin ini bekerja dengan cara menghilangkan satu basaadenindari unit 28SrRNA, sehingga menghentikan sintesisprotein. Sumber bakteri ini contohnya adalah daging yang belum masak, seperti daging hamburger yang belum matang.Escherichia coliyang tidak berbahaya dapat menguntungkan manusia dengan memproduksivitamin K2, atau dengan mencegah baketi lain di dalam usus.Escherichia colibanyak digunakan dalam teknologirekayasa genetika. Biasa digunakan sebagaivektoruntuk menyisipkangen-gentertentu yang diinginkan untuk dikembangkan.Escherichia colidipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya.

2.Proteus vulgarisProteus Vulgarisberbentuk batang, bakteri gram negatif yang menghuni saluran usus manusia dan hewan.Bakteriini dapat ditemukanditanah, air dan tinja.Bakteriini dikelompokkan dengan Enterobacteriaceae dan merupakan patogen oportunistik manusia.Bakteriini diketahui menyebabkan infeksi saluran kemih dan infeksi luka.Peran:Proteus mirabilis menyebabkan 90% dari infeksiProteus.Proteus vulgarisdanProteus pennerimudah diisolasi dari individu dalam jangka panjang fasilitas perawatan dan rumah sakit dan dari pasien dengan penyakit yang mendasari atau sistem kekebalan tubuh dikompromikan.Pasien dengan infeksi berulang, orang-orang dengan kelainan struktural dari saluran kemih, mereka yang memiliki instrumentasi uretra, dan mereka yang diperoleh infeksi di rumah sakit mengalami peningkatan frekuensi infeksi yang disebabkan oleh Proteus dan organisme lain (misalnya,Klebsiella, Enterobacter, Pseudomonas , enterococci, staphylococci)DAFTAR PUSTAKA

Hadioetomo. 1988.Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia:Jakarta.Lay dan Hartono.1992.Mikrobiologi. Jakarta : Rajawali Pers.Subandi. 2010.Mikrobiologi.Bandung : PT Remaja Rosda KaryaTim Bakteriologi Umum. 2005.Diktat Penuntun Praktikum Mikroskop Dan Bakteriologi Umum. Tasik: Akademui Analis Kesehatan Bakti Husada.Volk, Wheter. 1992.Mikrobiologi Dasar. University Of Southern Maine.

I.PENDAHULUAN A.Latar BelakangBakteri yang memiliki ciri-ciri berantai karbon (C) yang panjangnya 8 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel disebut bakteri tahan asam (BTA). Bakteri ini ada 41 spesies yang telah diakui oleh ICSB (International Committee on Systematic Bacteriology) yang sebagaian besar sudah saprofit dan sebagaian kecil lainnya patogen untuk manusia diantaranya Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leparae dan lain-lainnya yang dapat menyebabkan infeksi kronik. Golongan saprofit dikenal juga dengan nama atipik (Syahrurachman, 1994).Bakteri ini membutuhkan bahan tambahan makanan seperti darah egg yolk, serum dan sel yang tebal yang terdiri dari asam lemak mivolet untuk pertumbuhannya. Mycobacterium tuberculose merupakan bakteri gram positif (+), batang sedikit bengkok, panjang atau pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat 2 8 minggu, suhu optimal 37 38oC. Mycobacterium tahan terhadap asam dan alkali dibanding dengan kuman lain sehingga apabila bahan spesimen mengandung kuman lain dapat dibunuh dengan mudah sehingga spesimen menjadi lebih murni (Staff pengajar FKUI, 1994).Mycobacterium tuberculose terdapat pada manusia yang mengidap penyakit TBC dan penularannya terjadi melalui jalan pernafasan, tetapi spesies Mycobacterium bovis biasanya terdapat pada lembu dan dapat ditemukan pula pada manusia di usus (Syahrurachman, 1994).B. Tujuan1.Untuk mengetahui teknik pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA).2.Mengetahui tingkat infeksi dari sputum.II.MATERI DAN METODEA.MateriAlat yang digunakan dalam praktikum Bakteri Tahan Asam (BTA) adalah pipet tetes, mikroskop, objek glass, jarum ose dan pembakar spirtus. Bahan yang digunakan adalah sputum (dahak), alkohol asam 3%, carbol fuchsin 0,3%, aquades dan methylen blue.B.Metode1.Preparat dibuat secara langsung kemudian difiksasi, yaitu dengan membersihkan kotoran dengan alkohol pada objek glass lalu sputum diletakkan di atasnya dengan menggunakan jarum ose (dalam keadaan aseptis) setipis mungkin kemudian dilakukan pengeringan, setelah kering kemudian difiksasi.2.Objek glass yang kering ditetesi carbol fuchsin 0,3% dan dipanaskan selama 5 menit tetapi jangan sampai mendidih.3.Cuci dengan aquades mengalir dan dikeringkan.4.Tetesi dengan alkohol asam 3%, lalu cuci dengan aquades mengalir dan dikeringkan.5.Tetesi dengan methylen blue, didiamkan selama 20 30 detik kemudian dicuci dengan menggunakan aquades mengalir, keringkan dan amati dibawah mikroskop.Skema kerja

III.HASIL PRAKTIKUM DAN PEMBAHASANA.Hasil Praktikum

Praktikum pewarnaan BTA pada sampel sputum menghasilkan BTA positif 1 dan BTA positif 2 (5 BTA / 1 lapang pandang).B.PembahasanBakteri tahan asam (BTA) merupakan bakteri yang memiliki ciri-ciri yaitu berantai karbon (C) yang panjangnya 8 95 dan memiliki dinding sel yang tebal yang terdiri dari lapisan lilin dan asam lemak mikolat, lipid yang ada bisa mencapai 60% dari berat dinding sel. Bakteri yang termasuk BTA antara lain Mycobacterium tuberculose, Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae, Nocandia meningitidis, dan Nocandia gonorrhoeae. Mycobacterium tuberculose adalah bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit tuberculose, dan bersifat tahan asam sehingga digolongkan sebagai bakteri tahan asam (BTA). Penularan Mycobacterium tuberculose terjadi melalui jalan pernafasan (Syahrurachman, 1994).Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan pemucat (alkohol asam). Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat (alkohol asam) akan melakukan reaksi dengan carbol fuchsin dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna (Lay, 1994).Uji bakteri tahan asam (BTA) pada praktikum kali ini menggunakan prosedur pewarnaan Ziehl Neelson yaitu dengan memberi larutan pewarna carbol fuchsin, alkohol asam, dan methylen blue. Hasil yang diperoleh saat praktikum yaitu positif 1 dan positif 2 yang dilaporkan secara kuantitatif menurut IUAT, yaitu:Negatif: apabila tidak ditemukan BTA.Positif: apabila terdapat 1 9 BTA / 100 lapang pandang.Positif 1: apabila terdapat 10 90 BTA / 100 lapang pandang.Positif 2: apabila terdapat 1 9 BTA / 1 lapang pandang.Positif 3: apabila terdapat > 10 BTA / 1 lapang pandang.Tujuan pemberian carbol fuchsin 0,3% adalah untuk mewarnai seluruh sel bakteri. Tujuan pemberian alkohol asam 3% adalah meluruhkan warna dari carbol fuchsin, tetapi pada golongan BTA tidak terpengaruh pemberian alkohol asam 0,3% karena memiliki lapisan lipid yang sangat tebal sehingga alkohol sukar menembus dinding sel bakteri tersebut dan warna merah akibat pemberian carbol fuchsin tidak hilang. Tujuan pemberian methylen blue adalah memberi warna background (Pelczar dan Chan, 1986).Mewarnai bakteri yang tahan terhadap asam digunakan cara pewarnaan Ziehl Neelson. Pewarnaan Ziehl Neelson terdapat beberapa perlakuan dan zat kimia yang diberikan. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri tetapi tidak mengubah struktur sel bakteri. Perlakuan pencucian dengan menggunakan aquades mengalir bertujuan untuk menutup kembali lemaknya (Pelczar dan Chan, 1986).IV.KESIMPULAN DAN SARANA.Kesimpulan1.Pewarnaan Ziehl Neelson atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok Mycobacterium dan Nocandia dengan bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (carbol fuchsin) sewaktu dicuci dengan larutan alkohol asam. Larutan asam terlihat berwarna merah, sebaliknya pada bakteri yang tidak tahan asam karena larutan pemucat akan melakukan fuksin karbol dengan cepat, sehingga sel bakteri tidak berwarna. Setelah penambahan cat warna kedua bakteri tidak tahan asam berwarna biru.2.Hasil yang diperoleh saat praktikum yaitu positif 1 dan positif 2B.Saran1.Praktikum pewarnaan BTA tidak hanya dilakukan oleh asisten tetapi juga dapat dilakukan oleh praktikan.2.Praktikum pewarnaan BTA akan lebih baik jika menggunakan sputum yang bervariasi dari negatif, positif, positif 1, positif 2, dan positif 3 sehingga praktikan dapat mengetahui seberapa banyak BTA pada masing-masing kondisi.DAFTAR REFERENSIJutono, dkk. 1980. Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum Untuk Perguruan Tinggi. Yogyakarta: Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM.Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo Persada.Pelczar, M. J. And E. C. S. Chan. 1986. Elements of Mycrobiology. New York : Mc grow-Hill Book Company.Sechlegel, H. G. And Schimt, K. 1994. Mikrobiologi Umum. Yogyakarta : UGM Press.Staf pengajar FKUI, 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta : Binawa Aksara.Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta: UI Press.