Analisis Keragaman DNA

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu reaksi in vitro untuk menggandakan molekul

DNA pada target tertentu dengan cara mensintesa molekul DNA baru yang berkomplemen

dengan molekul DNA tersebut dengan enzim polymerase dan oligonukleotida pendek sebagai

primer dalam mesin Thermal Cycler. Teknik ini berjalan secara enzimatik melalui

mekanisme perubahan suhu.

Proses yang terjadi dalam mesin PCR meliputi tiga tahap utama yaitu denaturasi (pemisahan

untai ganda DNA), annealing (penempelan primer) dan ekstensi (pemanjangan primer).

Proses dari mulai denaturasi, penempelan hingga pemanjangan disebut sebagai satu siklus.

Produk PCR dapat langsung divisualisasikan melalui proses elektroforesis dan dapat

digunakan untuk analisis lebih lanjut (Muladno, 2002). Keragaman DNA amplikon atau

produk PCR dapat dilakukan dengan berbagai cara, antara lain RFLP, SSCP, TGGE dan

sequencing.

Restriction FragmentLength Polymorphism(RFLP)

PCR-RFLP  merupakan teknik analsis  lanjutan dari produk PCR. Teknik PCR

memanfaatkan perbedaan pola pemotongan enzim restriksi atau enzim pemotong yang

berbeda pada tiap-tiap mikroorganisme. Analisis RFLP sering digunakan untuk mendeteksi

lokasi genetik dalam kromosom yang menyandikan penyakit yang diturunkan (Orita et al.,

1989) ataupun untuk mendeteksi adanya keragaman gen yang berhubungan dengan sifat

ekonomis, seperti produksi dan pertumbuhan.

Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)a merupakan suatu teknik yang digunakan untuk

memperbanyak segmen DNA secara in vitro (Ausubel, 1995). Segmen DNA tersebut

kemudian dapat diketahui runutan nukleotidanya, salah satunya yaitu dengan menggunakan

enzim restriksi. Enzim restriksi dapat memotong DNA secara spesifik dan terbatas pada situs

yang dikenalinya (Lewin, 1994). Perbedaan pola pemotongan DNA dari jenis gen yang sama

antara beberapa ternak disebut Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP).

Pada prinsipnya, RFLP merupakan semua mutasi yang menghilangkan atau menciptakan

sekuen rekognisi baru bagi enzim restriksi. Penyisipan (inersi),penghilangan (delesi), maupun

subtitusi nukleotida yang terjadi pada daerah rekognisi suatu enzim restriksi menyebabkan

tidak lagi dikenalinya situs pemotongan enzim restriksi dan terjadinya perbedaan pola

pemotogan DNA (Lewin,1994).

Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)

PCR-RFL P merupakan salah satu metode analisis lebih lanjut yang memanfaatkan produk

PCR. Metodeini didasarkan pada asumsi bahwa perubahan yang terjadi pada fragmen DNA

akan mempengaruhi bentuk dari fragmen DNA untai tunggalnya yang terlihat dari perubahan

pola migrasi pada gel poliakrilamida non-denaturasi. Metode SSCP dapat mendeteksi adanya

mutasi pada fragmen DNA, akan tetapi tidak dapat memberikan informasi tentang posisi

dimana terjadinya mutasi pada fragmen DNA, dan memiliki keterbatasan dalam menentukan

jumlah alel (Barroso et al., 1999).

TemperatureGradient Gel Electrophoresis (TGGE)dan Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis(DGGE)

Polymerase Chain Reaction-Temperature Gradient Gel Electrophoresis (PCR-TGGE) adalah

suatu metode analisis keragaman yang mendeteksi adanya mutasi menggunakan gel yang

memiliki perbedaan suhu (Jasik dan Reichert, 2006). Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis (DGGE) merupakan salah satu metode yang dapat membedakan adanya

mutasi berdasarkan berat molekul fragmen DNA pada gel yang memiliki perbedaan

konsentrasi bahan untuk menyamakan bera tmolekul (denaturing) (Liu et al.,2008).

Sequencing

Sequencing merupakan satu terobosan utama dalam genetika molekuler untuk menganalisis

keragaman molekul DNA. Sequencing merupakan proses penentuan urutan nukleotida pada

suatu fragmen DNA atau RNA. Sequencing menghasilkan penggambar linear simbolik yang

disebut sekuen yang meringkas sebagian besar struktur tingkat atom atas molekul yang

disekuensing. Sequencing DNA akan menghasilkan sekuen DNA yang digambarkan sebagai

untaian abjad lambang nukleotida-nukleotida penyusun DNA (Muladno,2002).

Tipe polimorfisme yang dideteksi yaitu pertukaran satu basa dan menghasilkan informasi

sekuen yang dibutuhkan. Proses Sequencing dapat dilakukan dengan secara cepat dan hasil

yang diperoleh tinggi (akurat),akan tetapi biaya yang dibutuhkan cukup besar (Gupta et al.,

2002).

Sumber:

Barroso, A., S. Dunner, dan J. Canon. 199. Technical note: use PCR-single strand

           conformation polymorphism analysis for detection of Bovine ?-casein variants A1,

A2,

           A3, and B.J. Anim. Sci. 77:2629-2632.

Gupta, P.K., R.K. Varshneydan M. Prasad. 2002. Molecular Markers: Principles and

            Methodology. Dalam: Jain, S.M., D.S. Brar, dan B.S.Ahloowalia (Eds.). Molecular

            Techniques in Crop Inprovement. P.9-54.

Liu, G., T. Amemiya, dan K.Itoh. 2008. Two-dimensional DNA gel electrophoresis mapping:

a novel approachto diversity analysis of bacterial communities in environmental soil. J.

ofBioscience and Bioengineering, 105:127-133.

Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka WirausahaMuda dan USESE

Foundation. Bogor.

Orita, M., H. Iwahana, H.Kanazawa, K. Hayashi, dan T. Sekiya. 1989. Detection of

            polymorphisms of humanDNA by gel electrophoresis as a single-strand conformation

            polymorphism. Proc.Natl. Acad. Sci. 86:2766-2770.