Analisis Imunokimia Utk ASA

8/20/2019 Analisis Imunokimia Utk ASA

http://slidepdf.com/reader/full/analisis-imunokimia-utk-asa 1/53

Metode Imunokimia

untuk analisis senyawa aktif

Marlia Singgih WibowoSchool of Pharmacy

Institut Teknologi Bandung



Analisis Imunokimia Berdasarkan prinsip reaksi spesifik antara

Antigen-Antibodi

Penggunaan senyawa penanda (label) untuk

visualisasi reaksi Deteksi menggunakan metode fisiko-kimia



Prinsip Reaksi : meniru reaksi

imunologi dalam tubuh

Reaksi imunologi di dalam mamalia :

Ag Ab Reaksi primer

Reaksisekunder

Reaksi tersier(degranulasi,opsonisasi)

(Fiksasi komplemen,aglutinasi, presipitasi)

memicu



Mengapa reaksi Antigen-Antibodi?

Reaksi dan kekuatan

antibodi untuk “specific

and reproducible protein

binding”

Prinsip reaksi :

immunoassays



Antigen-Antibody Interaction foranalysis

SUBSRATE

PRODUCT(visualized)Complex

Ag-Ab-Label



Metode analisis berbasis

imunokimia Imunopresipitasi

Imunoaglutinasi

Imunokimia berlabel :

EIA/ELISA (Enzyme ImmunoAssay) RIA (Radio ImmunoAssay)

IFA (ImmunoFluorescence Assay)

LIA (Luminescence Immuno Assay)

dll



Antigen (antibody generator)

Senyawa atau kompleks senyawa yang dapat

menginduksi sistem imun mamalia Sifat : Imunogenik : induksi/stimulasi sistem imun

mamalia

Antigenik : bereaksi spesifik dengan antibodi Syarat antigen: High Molecular Weight (>5000),

chemical structure → Complex

Jika MW < 5000, supaya bersifat imunogenik danantigenik dapat dikonjugasi dengan suatu proteinuntuk meningkatkan immunogenicity



Yang dapat menjadi antigen Mikroba patogen dan atau toksin mikroba

Toksin tanaman, hewan

Protein spesifik atau senyawa lain yang

berstruktur spesifik Senyawa obat (narkotik, psikotropik), tidak

imunogenik, tetapi dapat dikonjugasi dengan

suatu protein carrier (contoh : BSA)

Senyawa pestisida, dll.



SIFAT UMUM ANTIBODI Antibodi memiliki spesifisitas dan aktivitas biologi

Struktur Antibodi : Dua fragmen tempat

berikatannya antigen secara spesifik, disebutsebagai fragmen Fab (fragment antigen binding)yang univalen, masing-masing memiliki satu situs

pengikatan dan identik satu sama lain dalam segalahal

Fragmen ketiga adalah Fc (Fragment crystallisable),

fragmen yang dapat dikristalkan, tidak berikatandengan antigen, tetapi bertanggung jawab untukfungsi biologik molekul antibodi setelah antigenberikatan dengan daerah Fab dari molekul utuh



Struktur Antibodi

Terdiri dari dua rantai berat (heavy chain = H) dan duarantai ringan (light chain = L).

Rantai H IgG (γ) memiliki massa molekul sekitar 50 –55 kDa, sementara rantai H IgM (μ) memiliki massamolekul sekitar 65 – 70 kDa.

Rantai L (dengan massa molekul 20 – 25 kDa)memiliki isotype kappa atau lambda dan ditemukanberikatan dengan seluruh kelas rantai H.

Rantai peptida ini berikatan melalui ikatan non-kovalendan jembatan kovalen disulfida. Ikatan disulfida inirelatif terekspos dan oleh karena itu dapat mudah direduksi atau oksidasi.



Domain konstan (Fc) IgG dan IgM dapat

berinteraksi dengan sel dan sistem efektordalam tubuh, dan domain variabel (Fab) nya

dapat berinteraksi dengan antigen.

Lokasi pada struktur antigen tempat berikatan

dengan antibodi disebut ‘epitope’ atau disebut

‘antigenic determinant’, sedangkan lokasi pada

struktur antibodi yang dapat berikatan dengan

antigen disebut ‘paratop’.



IgG and IgM

IgG IgM



Specificity and Selectivity

Monoclonal Antibody Polyclonal Antibody

Recombinant Monoclonal Antibody



KELEBIHAN ANTIBODI MONOKLONAL

DIBANDINGKAN POLIKLONAL

Dapat menjamin keseragaman kandungan antibodi yangdihasilkan karena berasal dari satu jenis klon saja yang diproduksi

secara berulang dari suatu kumpulan sel hibrid yang telahdiseleksi sebelumnya.

Mengurangi kemungkinan terjadinya reaksi silang atau reaksi non-spesifik seperti yang dapat terjadi pada penggunaan antibodi

poliklonal. Kekuatan atau afinitas kecepatan reaksi antigen-antibodi

monoklonal umumnya lebih kuat dibandingkan dengan ikatanantigen-antibodi poliklonal.

Proses pemurnian lebih mudah karena relatif lebih sedikit jenis

kandungan antibodinya. Dapat digunakan untuk tujuan terapi yaitu antara lain untuk

perbaikan overdosis obat, mengurangi resiko transplantasi organ,deteksi tumor metastasis, dan sebagai obat target sitotoksik.



Teknik lain untuk produksi

antibodi monoklonal Teknologi Antibody Expression Libraries, yaitu konstruksi

cDNA dari mRNA yang diisolasi dari sel B manusia atau

murine Gen IgG diamplifikasi dengan cara PCR, lalu rantai berat dan

ringan nya dikonstruksi dengan cara digesti dan insersi kedalam bakteriofaga atau plasmid yang sesuai.

Rekombinasi random terjadi , lalu diekspresi di dalam bakteri,skrining dengan western blot

Klon yang positif diisolasi dan diperbanyak untuk menghasilkan

antibodi Fab yang murni Mudah melakukan kimerisasi, perubahan afinitas,dan

modifikasi fungsi efektor



Penggunaan Prinsip reaksi

Antigen-Antibodi di bidang

Farmasi

Clinical Diagnosis , misalnya Serodiagnosisuntuk Penyakit Infeksi

Drug Monitoring and Toxicology Cancer Research

Proteomic Study



KINETIKA INTERAKSI

ANTIGEN-ANTIBODI



Antigen-Antibody Interaction



Prinsip ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbent Assay)

Antigen

Antibodi KompleksAg-Ab

Konjugat

enzim pada

Ag-Ab

Substrat

Produk

berwarna

Reaksi

enzimatik



Kinetika reaksi Antigen-Antibodi

Reaksi reversibel

Ag + Ab Ag-Ab

k1

k2

k1 dan k2 adalah konstanta laju asosiasi dan disosiasi



Laju pembentukan kompleks Ag-Ab :

d (Ag-Ab)dt

= k1(Ag) (Ab) – k2 (Ag-Ab)

k1/k2 =(AgAb)

(Ag) (Ab)= K (konstanta kesetimbangan)

Bila antibodi memiliki aviditas atau afinitas tinggi, maka K tinggi,

demikian sebaliknya



B (terikat)

B/F (rasio terikat

dan bebas)

0

5.00

5.00

Bila F adalah antigen bebas, dan B

adalah antigen yang terikat, Abx

adalah konsentrasi awal Ab,maka

pada kesetimbangan :

K = k1/k2 = (Ag-Ab)/(Ag)(Ab)

= B / F [(Abx)-B]

Jadi B/F = K [(Abx)-B]

Slope = -K, potongan dgn

x adalah b, potongan dgn y

adalah Kb



Reaksi pada permukaan bahan padat

dan cair

Kebanyakan metode imunokimia yang ada

dibuat dalam media/fase padat (solid phase)

untuk memudahkan proses pemisahan dalam

percobaan yang heterogen

Ketika antigen diimobilisasi pada fase padat,ikatan antibodi tergantung pada laju difusi dan

ikatan pada konsentrasi diatas 1 pmol/cm2

dipengaruhi oleh interaksi sterik



Reaksi pada fase padat memiliki laju reaksi

intrinsik dan reaksi balik yang lebih kecildibandingkan reaksi di dalam larutan

Oleh karena itu reaksi Ag-Ab pada fase padat-

cair secara praktis merupakan reaksi

irreversibel



Parameter analisis Sensitivitas

Spesifisitas

Selektivitas

Hal yang mempengaruhi parameter : Reaksi silang

Adanya senyawa yang mempengaruhiaviditas reaksi Ag-Ab, misalnya garam, urea

Bagaimana menentukan jenis



Bagaimana menentukan jenis

analisis imunokimia berlabel? Reaktan apa yang akan diberi label, antigen

(analit) atau antibodi? Apakah antigen atau antibodi yang akan

ditentukan?

Apakah analisis kompetitif atau non-

kompetitif?

Apakah sistem analisis homogen atauheterogen?

Pengelompokkan jenis analisis



Pengelompokkan jenis analisis

imunokimia

1. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengananalit yang diberi label

2. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten denganantibodi yang diberi label

3. Analisis imunokimia yang tergantung pada deteksilangsung kompleks imun

4. Analisis imunokimia dengan melibatkan label danreaksi khusus yang berlebih

5. Analisis imunokimia untuk mengukur antibodispesifik

6. Analisis imunokimia yang melibatkan pereaksiberlabel dimana hasil reaksi Ag-Ab merupakan

penguatan sinyal



1. Analisis kompetitif untuk antigen/haptendengan analit yang diberi label : Analisis inimirip dengan analisis radiokimia klasik, melibatkanpenggunaan sejumlah terbatas antibodi. Analit dapatdilabel dengan senyawa radioaktif, fluoresensi,

luminesensi atau enzim.2. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten

dengan antibodi yang diberi label : analisisini berguna ketika antigen atau hapten yg dilabel

memiliki sifat yang kurang menguntungkan, misalnyakelarutan yang rendah dalam medium reaksi. Dalamreaksi digunakan analit imobilisasi dengan jumlahtetap dan terbatas. Sensitivitas reaksi tergantung

pada afinitas antibodi berlabel



3. Analisis imunokimia yang tergantung

pada deteksi langsung kompleks imun:analisis yang dilihat langsung yaitu presipitasi,

turbidimetri, aglutinasi, perhitungan partikel

4. Analisis imunokimia dengan melibatkanlabel dan reaksi khusus yang berlebih:analisis sandwich seperti 2-site immunometric

assay, dan ELISA. Analit diinkubasi dengan

antibodi berlabel dalam jumlah berlebih, antibodi

yang tidak berikatan akan dibuang



1. Analisis imunokimia untuk mengukur

antibodi spesifik : analisis ini melibatkanantigen amobil berlebih pada fase padat untukmenangkap antibodi spesifik di dalam sampel.

2. Analisis imunokimia yang melibatkanpereaksi berlabel dimana hasil reaksi Ag- Ab merupakan penguatan sinyal: analisis

ini termasuk imunokimia homogen untukmemberikan efek 100% modulasi sinyal dari labelyang digunakan

Reaksi Imunokimia dengan jumlah




antibodi berlebih (tipe I) Analit + antibodi → kompleks Ag-Ab → sisa antibodi

Sensitivitas maksimum dicapai pada jumlah antibodiyang tidak terhingga

Sensitivitas adalah 1 molekul analit (teoritis)

Antigen yang dapat bereaksi silang berpotensireaksi seimbang dengan sistem antibodi berlebih

Reaksi antigen-antibodi hanya sedikit dipengaruhi

oleh senyawa seperti garam atau urea

Waktu analisis relatif cepat dengan antibodi berlabel

2-site immunometric sandwich assay



(non-kompetitif untuk Ag polivalen)

Ukur aktivitas labelnya

Ab1 Ag

pencucian

Ab2 berlabel

ditambahkan

berlebih

inkubasi

Pencucian

dan inkubasi




Analit + antibodi → kompleks Ag-Ab → sisa antigen

Sensitivitas maksimum dicapai ketika konsentrasiantibodi mendekati 0

Penjenuhan ini diatur oleh konstanta kesetimbangan

Sensitivitas tergantung pada konstanta afinitas

antibodi Sensitivitas maksimum 10-14 mol/liter (teoritis)

Antigen yang dapat bereaksi silang akan

menunjukkan kekuatan relatifnya tergantung padalaju konstanta kesetimbangan antara analit danantigen cross-reactant tersebut

Reaksi dalam percobaan lambat karenakesetimbangan harus tercapai

g j

antigen berlebih (tipe II)

Imunokimia kompetitif dengan



Imunokimia kompetitif dengan

analit berlabel

+ +

Ag Ag-berlabel Ab

+

Analit berlabel berkompetisi dengan antigen tidak berlabel untuk

berikatan dengan antibodi.Aktivitas spesifik dari fraksi analit berlabel

yang terikat dgn antibodi berbanding terbalik dengan konsentrasi analit

bebas



Sensitivitas metode Kesalahan eksperimen paling besar kira-kira

17% Konstanta kesetimbangan antibodi kira-kira

10-11 liter/mol

Sensitivitas tertinggi (limit deteksi) kira-kira

10-13 mol/liter (kira-kira 108 molekul per mL)



ANALISISIMUNOKIMIA

DENGAN LABELNON-RADIOAKTIF



Karakteristik suatu label untuk

analisis imunokimia

Memiliki aktivitas spesifik

Mudah dideteksi

Tidak berbahaya



Aktivitas spesifik labelberhubungan dengan :

Fraksi pada label yang akan digunakan untuk

deteksi

Derajat amplifikasi Efisiensi deteksi

Syarat Enzim yang ideal



y y g

sebagai label Memiliki aktivitas tinggi pada konsentrasi (Km

rendah)

Stabil pada kondisi reaksi (biasanya pH netral)

Mudah dikonjugasi ke molekul lain untuk reaksilanjutan atau dalam penyimpanan

Tersedia dalam keadaan murni (high purity)

Harga murah

Mudah dideteksi dengan cara yang sederhana Tidak terdapat di dalam cairan sampel biologi yang

akan diuji

Contoh enzim sebagai label



Contoh enzim sebagai label

Enzim dan

sumber

pH optimum Aktiv.spes

(U/mg, 37 C)

BM

Alkalinfosfatase

(usus sapi)

8-10 1000 100.000

β-galaktosidase(E.coli) 6-8 600 540.000

HRP (lobak) 5-7 4500 40.000

Enzim lain : amilase, katalase, urease, xantin-oksidase, heksokinase, adenosin

deaminase, invertase, β-laktamase, dll.



Enzim dan sumbernya B-galaktosidase

Peroksidase

Glukosa oksidase

A-amilase

G6PDH

MDH Heksokinase

Propionil-CoA-karboksilase

Lisozim

Escherichia coli

Lobak

Aspergillus sp.

Bacillus subtilis

Leoconostoc mesenteroides

Lactobacillus arabinosusSaccharomyces sp.

Saccharomyces sp.

Egg-white

Senyawa berfluoresensi



y

sebagai label Pada saat molekul fluoresensi dieksitasi oleh sinar

terpolarisasi, polarisasi sinar yang teremisi

tergantung pada rotasi acak yang terjadi selamaproses eksitasi

Semakin kecil molekul, makin cepat rotasi yg terjadi

dan sinyal semakin kecil Pada IFA, senyawa fluoresensi sebagai label yang

terkonjugasi dengan Ag atau Ab, akan tereksitasi,lalu setelah ikatan Ag-Ab, rotasi diperlambat, dan

polarisasi meningkat Oleh karena itu, untuk label ukuran dan rotasi label

bebas menjadi hal yang penting, karena akan

mempengaruhi polarisasi label yang terikat

Syarat ideal Senyawa



y y

Fluoresensi sebagai label Memiliki intensitas fluoresensi yang tinggi

(absorptivitas molar tinggi) Stoke shift > 50 nm untuk mengurangi

pengaruh “latar belakang” (background)

akibat scattering

Larut dalam air

Mudah dikonjugasi dengan molekul lain

Harga murah



Contoh label fluoresensiFluorofor Quantum

yield

Lifetime (ns) Emisi/eksita

si (nm)

Absorptivitas

(liter/mol)

Dansil

klorida

0,3 14,0 480-520/340 3,4x10 3

Fluoresein

isotiosianat

0,85 4,5 520/492 7x10 4

Rhodamin B

isotiosianat

0,7 3,0 585/550 1,2x10 4



Senyawa kelat dari logam lantanida saat ini

banyak digunakan untuk label fluoresensi Europium, terbium, samarium, memiliki emisi

fluoresensi yang panjang (mikrodetik sampai

milidetik)

Dapat menghilangkan pengaruh background



Reaksi silang (cross-reaction) Ketepatan suatu analisis tergantung pada

spesifisitas nya Reaksi Antigen-Antibodi bersifat spesifik,

namun dapat pula terjadi reaksi silang, yaitu

reaksi dengan sebagian atau seluruh struktur

kimia dari analit lain

Reaksi silang dievaluasi dengan caramembandingkan kemampuan masing-masing

analit terhadap ikatan dengan label



B (%)

Cross-reactant

Std

50

x1 x2

100

Log konsentrasi

% reaksi silang = konsentrasi Std (x1) / konsentrasi cross-reactant (x2) x 100%

Perkembangan metode



Imunokimia Penggunaan sintetik peptida untuk epitop spesifik

pada Ag virus

Metode Scintillation Proximity : Radioimunokimiamenggunakan fluomicrosphere yang dilapisi dengan Ab atau reseptor. Fluomicrosphere ini akan

menghasilkan sinyal bila Ab atau molekul reseptor berikatan dengan ligand yang dilabel denganradioaktif (3H atau 125I)

Metode Idiometrik (Idiometric assay) : non-kompetitif untuk pengukuran senyawa molekuler yang kecil

Ultrasensitive two-site enzyme immunoassay



Metode Scintillation Proximity

FI A + L* FI A L*

sinar

Radiasi

Suatu Ligand radioaktif berikatan dengan molekul akseptor (A)yang terikat pada molekul fluomikrosfer, yang setelah diradiasi

akan memancarkan sinar



Metode Idiometrik

Pada metode ini digunakan tambahan dua jenisantibodi “anti-idiotipik” (anti-idiotypic antibody) selain

antibodi utama

Antibodi anti-idiotipik alfa dan beta

Alfa akan mengenali epitop dalam daerah variabel Ab utama, dan tidak sensitif terhadap ada atautidaknya analit pada situs ikatannya

Beta akan berkompetisi dengan analit pada bagian

paratop (daerah ikatan Ag pada Ab) Biasanya digunakan untuk antigen kecil , misalnya

estradiol

Ultrasensitive two-site enzyme



immunoassay

Untuk mengukur kadar antigen yang sangat

kecil : Chorionic gonadotropin dalam serum atau plasma

(pada kasus tumor)

Thyrotropin dalam serum darah

Luteinizing hormon dalam serum darah anak-

anak

Growth hormon

Analisis Imunokimia Utk ASA

Documents

Transcript of Analisis Imunokimia Utk ASA