ANALISIS ASAM AMNIO

Abdul RohmanFakultas Farmasi UGMANALISIS ASAM AMNIO DAN PROTEIN

Bahan Pembelajaran Analisis asam amino dan ProteinPendahuluanAnalisis Asam aminoTitrimetriGasometriSpektrofotometriKromatografi

Asam aminoAA merupakan monomer penyusun protein. Kebanyakan protein disusun oleh 20 asam amino Sumber utama diet AA pada manusia berasal dari protein, yang secara enzimatis akan didigesti untuk membebaskan AA-nyaAA dapat berada dalam bentuk bebas atau terikat dalam peptida atau protein menentukan metode analisis dan penyiapan sampelnyaWhat is amino acid? What is amino acid?Amino Acid: aminated carboxylic acid (R-COOH)

R group

-amino acetic acid

-amino propanoic acid

,-2 amino caproic acidExamplesClassification of Amino Acid 1. By the location of Amino-group / / -AA2. By its acidity neutral/ acidic/ basic AA ratio of Amino-group to carboxylic group3. By whether containing phenyl group aromatic / non aromatic AA 4. By its occurrence in protein Protein / non protein AA5. By polarity of R group : polar / apolar side chain AA 6. By its nutrient value to human: Essential AA and non-essential AA

20 -AA commonly found in proteins-aa structureNameglycine

alanine

valine

leucine

isoleucine

Continued -aa structureNamemethionine

proline

phenylalanine

tryptophan

serine

continued-aa structureEn namethreonine

cystine

tyrosine

asparagine

glutamine

continued-aa structureEn nameAspartic acid

Glutamic acid

lysine

arginine

histidine

Titrasi Formol

Gasometri

Gugus alfa amino primer dari asam amino bereaksi dengan asam nitrit dan menghasilkan gas nitrogen (N2).

Asam nitrit ini dibuat dengan mereaksikan natrium nitrit dengan asam asetat.

Gas nitrogen yang terjadi dimurnikan dengan mengalirkannya pada kalium permanganat, untuk selanjutnya dikumpulkan dan diukur volumenya.Aromatic AAs absorb light in the near ultraviolet (230-300nm).

phenylalaninetyrosinetryptophanNote: This UV absorption property of protein is solely determined by the content of these 3 aromatic AAs. However, far ultraviolet (190nm)absorption of protein stems from the peptide bond. Spektrofotomeri UVUV Spectra

Derivative spectrophotometry

Spektroskopi visibelNinhidrinMetode yang dikembangkanNinhidryn

FRIEDMAN, M. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 385406

Contoh Metode yang dikembangkan

High performnce liquid Chromatography

DetektorDetektor UV-Vis merupakan detektor yang paling umum digunakan untuk analisis bahan makanan menggunakan KCKT. AA dapat dideteksi secara langsung dengan UV karena AA mampu menyerap di panjang gelombang antara 190 210. Meskipun demikian, karena kebanyakan pelarut dan juga komponen matriks sampel yang lain juga menyerap di daerah ini, maka AA harus diderivatisasi terlebih dahulu sebelum dianalisis dengan KCKT menggunakan detektor spektrofotometer UV-Vis. Derivatisasi AA dapat dilakukan sebelum pemisahan di kolom kromatografi (pre-column derivatization) atau dilakukan setelah AA keluar dari kolom (post-column derivatization).

Beberapa agen penderivat yang digunakan

Dideteksi di panjang gelombang 570 nmDansil klorida

Dansil-AA dideteksi dengan fluoresensi (eks 360 nm; emisi = 470 nm) dan dengan UV (maks 250 nm)Source: Snyder et al., 1997Dabsil klorida

Turunan dabsil menunjukkan serapan maksimal di 420 nm (daerah tampak), serta sangat stabil, dan batas deteksinya berada di level pmol. Turunan ini tetap stabil setelah penyimpanan selama 4 minggu di suhu ruang.1-fluoro-2,4-dinitrobenzena (FDNB)

Fenilisotiosianat

Karena hasil derivatisasi bersifat tidak berfluoresensi, maka teknik derivatisasi dengan PITC dideteksi dengan spektrofotometri UV-Vis, yang umumnya dilakukan di 254 nm (maks = 269 nm).

Meskipun derivatisasi ini tidak sepeka dibandingkan dengan teknik derivatisasi yang menghasilkan derivat yang dideteksi dengan fluoresen, akan tetapi produk PTC-AA bersifat sangat menyerap UV, sehingga AA dengan level pmol dapat dideteksi.

Batas sensitifitas agen penderivat ini adalah 50 pmol pada rasio sinyal/derau (S/N) 2,5orto-ftalaldehid

Derivat yang dihasilkan antara AA dengan OPA dapat dideteksi dengan UV pada panjang gelombang 330 nm, akan tetapi untuk menghasilkan sensitifitas yang tinggi, maka digunakan detektor fluoresen dengan eks = 330 nm dan em = 430 nm.

Dietil 2(etoksimetiliden)propandioat

Deteksi UV: 280 nm

Kromatogram standar AA (atas) dan AA dalam sampel madu (bawah). Deteksi UV = 280 nm). Konsentrasi standar AA (mg/kg) di berikan dalam tanda kurung.1 = histidin (6,4); 2 = arginin (15,4); 3= asparagin (20,8); 4 = glutamin (41,8); 5 = serin (9,9); 6 = asam aspartat (25,3); 7 = asam glutamat (12,7); 8 = treonin (8,0); 9 = glisin (5,1); 10 = -alanin (3,5); 11 = asam -aminobutirat (2,4); 12 = -alanin (7,0); 13 = prolin (948,3); 14 = tirosin (15,7); 15 = metionin (3,5); 16 = valin (4,7); 17 = cistein (15,1); 18 = triptofan (7,2); 19 = ornitin (2,11); 20 = fenilalanin (93,2); 21 = isoleusin (14,5); 22 = leusin (15,5); 23 = lisin (7,8) Source: Rebane, R. and Herodes, K. 2010. Analytica Chimica Acta 672: 7984Gas ChromatographyPrinciple:

Non-volatile AAVolatile AA-derivate

Automatic AA analyzerFrom pH2.2 to pH 6.4