ANALISA PROFIL PROTEIN GELATIN BABI DAN … · lunak gelatin sapi, cangkang kapsul lunak Pharmaton,...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ANALISA PROFIL PROTEIN GELATIN BABI DAN GELATIN SAPI

CANGKANG KAPSUL LUNAK MENGGUNAKAN METODE SDS-PAGE

(SODIUM DODECYL SULPHATE POLY ACRYLAMIDE GEL

ELECTROPHORESIS)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

(S.Far)

CHANDRA LIDANSYAH HIDAYAT

NIM : 1110102000060

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

2015M/1435H

i

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA




ELECTROPHORESIS)

SKRIPSI

CHANDRA LIDANSYAH HIDAYAT

NIM : 1110102000060

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

2015M/1435H

ii


HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Chandra Lidansyah H.

NIM : 1110102000060

Tanda Tangan :

Tanggal : 28 oktober 2015

iii


HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama : Chandra Lidansyah Hidayat

NIM : 1110102000060

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Analisa Profil Protein Gelatin Babi dan Gelatin Sapi

Cangkang Kapsul Lunak Menggunakan Metode SDS-

PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel

Electrophoresis)

Disetujui Oleh

Pembimbing 1 Pembimbing 2

Drs. Umar Mansur, M.Sc., Apt. Zilhadia, M.Si., Apt.

NIP. 197308222008012007

Mengetahui,

Kepala Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan


Yardi. Ph.D., Apt.

Nip. 197411232008011014

iv


v


ABSTRAK


NIM : 1110102000060


Judul : Analisa Profil Protein Gelatin Babi dan Gelatin Sapi

Cangkang Kapsul Lunak Menggunakan Metode

SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Poly

Acrylamide Gel Electrophoresis)

Gelatin sebagai bahan utama pembuatan kapsul lunak menjadi permasalahan dari

aspek kehalalan karena sebagian besar diperoleh dari sumber non-halal. Sumber

utama penghasil gelatin adalah kolagen dari kulit dan tulang sapi atau babi.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui profil protein gelatin babi dan gelatin

sapi menggunakan metode SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide

Gel Electrophoresis). Tahap awal penelitian gelatin, dilakukan hidrolisis

menggunakan enzim pepsin pada pH 4,5 dengan suhu 60°C. Gelatin hidrolisat

dielektroforesis masing-masing sebanyak 10µl kedalam tiap sumuran gel.

Kemudian dilakukan analisis profil protein gelatin babi standar, gelatin sapi

standar, simulasi cangkang kapsul lunak gelatin babi, simulasi cangkang kapsul

lunak gelatin sapi, cangkang kapsul lunak Pharmaton, cangkang kapsul lunak

Omepros, cangkang kapsul lunak Obipluz dan cangkang kapsul lunak Nature-E.

Profil protein gelatin babi menunjukkan pita spesifik pada berat molekul 27,67 kDa,

20,65 kDa dan 10,35 kDa. Sedangkan untuk sapi 45,92 kDa dan 21,78 kDa.Dengan

membandingkan profil protein sampel dan standar berdasarkan bobot molekul

kolom 6 diduga bersumber dari selain kedua gelatin pembanding, sedangkan kolom

7, 8 dan 9 adalah gelatin sapi.

Kata kunci: Gelatin Sapi, Gelatin Babi, Protein, Bobot Molekul SDS-PAGE, Pita

Spesifik, Cangkang Kapsul Lunak.

vi


ABSTRACT

Name : Chandra Lidansyah Hidayat

NIM : 1110102000060

Major : Pharmacy

Title : Analysis of Protein Profile Pork Gelatin and Bovine

Soft Capsule shell by Using SDS-PAGE Method

(Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel

Electrophoresis)

Gelatin as an ingredient manufacture of soft capsule is still a problems of a halal

aspect because obtained from non-halal sources. The Main source of producing

gelatin is collagen from the skin and bones of bovine and pork. This study aims to

determine the protein profile pork gelatin and bovine gelatin using SDS-PAGE

(Sodium Dodecy Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) method. The early

stage of gelatine carried hydrolyzed using by pepsin at pH 4,5 with temperature

60°C. Gelatin hydrolizate were analyzed by SDS-PAGE respectively 10 µl into well

gel. Then analysis of protein profiles standard pork gelatin, bovine gelatin standard,

soft capsule pork gelatin shell simulation, soft capsule bovine gelatin shell

simulation, Pharmaton soft capsule shell, Omepros soft capsule shell, Obipluz soft

capsule shell and Nature-E soft capsule shell. Pork gelatine protein profile showed

specific band on the molecular weight 27,67 kDa, 20,65 kDa and 10,35 kDa. As for

the bovine gelatin 45,92 kDa and 21,78 kDa. Compared protein profiles of sample

and standard based on the molecular weigth of sixth column, asumption except for

bovine gelatin and pork gelatin comparators, while seventh, eigtht and ninth column

are bovine gelatin.

Key word: Bovine Gelatin, Pork Gelatin, Protein, Molecular Weight, SDS-PAGE,

Bond Specific, Soft Capsule Shell.

vii


KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kepada Allah SWT. Atas segala rahmat-Nya, penulis

dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Analisis Profil Protein Gelatin Babi

dan Gelatin Sapi Cangkang Kapsul Lunak Menggunakan Metode SDS-PAGE

(Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)”. Skripsi ini

disusun untuk memenuhi salah satu syarat menempuh ujian akhir guna memperoleh

gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Secara garis besar skripsi ini berisi tentang profil protein gelatin babi,

gelatin sapi, dan gelatin sampel cangkang kapsul lunak berdasarkan bobot

molekulnya. Dalam penyusunan skripsi ini, penulis dibantu oleh berbagai pihak.

Oleh karena itu, pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih sedalam-

dalamnya kepada:

1. Bapak Umar Mansur, M.Sc.Apt. dan Ibu Zilhadia, M.Si., Apt. selaku dosen

pembimbing 1 dan 2 yang telah memberi pengarahan, nasehat serta

dukungan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

2. Kedua Orang tua, (Alm) Bapak Suharna dan Ibu Rochajatin yang selalu

mendoakan dan mendukung penulis.

3. Dr. H. Arif Sumantri, SKM., M. Kes. sebagai dekan Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

4. Bapak Yardi, Ph.D., Apt. selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Dosen-dosen program studi Farmasi dan FKIK yang telah memberikan ilmu

yang bermanfaat kepada penulis.

6. Bapak Sandra Hermanto, M.Si., pihak Laboratorium Terpadu UIN Jakarta

serta laboran laboratorium pangan (kakak prita dan kakak pipit) yang telah

membantu dalam teknis penelitian.

7. Tasha Azizah Ulyanisa yang telah memberikan dukungan dan semangat

yang luar biasa besar sehingga penulis bisa menyelesaikan penelitian ini.

8. Papoy dan Ochim yang selalu menemani dan mendukung terselesainya

penelitian ini.

9. Sahabat-sahabat seperjuangan Farmasi angkatan 2010 yang sama-sama

berjuang untuk menyelesaikan pendidikan ini.

10. Sahabat penelitian Hafit Mustollah yang bersama-sama berjuang

menyelesaikan pendidikan ini.

11. Pihak-pihak lain yang terlibat langsung maupun tidak dalam penelitian ini

yang namanya tidak dapat disebutkan.

viii


Penulis menyadari bahwa masih banyak terdapat kesalahan dalam penyusunan

skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran demi hasil yang

lebih baik di lain waktu. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat untuk kita

semua.

Ciputat, Oktober 2015

Penulis

ix


HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS

AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini:


NIM : 1110102000060


Fakultas : Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/ karya ilmiah saya,

dengan judul :




ELECTROPHORESIS)

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada Tanggal : 28 Oktober 2015

Yang Menyatakan

x


(Chandra Lidansyah H.

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ...................................................................................... i

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ......................................... ii

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. iii

HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ iv

ABSTRAK ...................................................................................................... v

ABSTRACT .................................................................................................... vi

KATA PENGANTAR .................................................................................... vii

HALAMAN PEERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................. ix

DAFTAR ISI ................................................................................................... x

DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xiv

BAB I PENDAHULUAN ............................................................................... 1

1.1 Latar Belakang .................................................................................. 1

1.2 Perumusan Masalah .......................................................................... 3

1.3 Tujuan Penelitian .............................................................................. 3

1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................ 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 5

2.1 Kapsul ............................................................................................... 5

2.1.1 Jenis Kapsul ................................................................................... 5

2.1.1.2 Gelatin Cangkang Kapsul Keras ................................................. 5

2.1.1.3 Gelatin Cangkang Kapsul Lunak ................................................ 6

2.2 Formulasi Simulasi Gelatin Cangkang Kapsul Lunak...................... 7

2.3 Gelatin............................................................................................... 9

xi


2.3.1 Komposisi Gelatin ......................................................................... 9

2.3.2 Sifat Fisika Kimia Gelatin ............................................................. 10

2.3.3 Klasifikasi Gelatin ......................................................................... 13

2.4 Protein ............................................................................................... 14

2.4.1 Penggolongan Protein .................................................................... 14

2.4.2 Struktur Protein .............................................................................. 15

2.4.2.1 Struktur Protein Primer ............................................................... 16

2.4.2.2 Struktur Protein Sekunder........................................................... 17

2.4.2.3 Struktur Protein Tersier .............................................................. 17

2.4.2.4 Struktur Protein Kuartener .......................................................... 18

2.5 Asam Amino ..................................................................................... 18

2.5.1 Sifat-Sifat Asam Amino ................................................................ 18

2.5.2 Peptida ........................................................................................... 19

2.5.2.1 Sifat Peptida ................................................................................ 20

2.6 Enzim ................................................................................................ 20

2.6.1 Aktivitas Enzim ............................................................................. 21

2.7 Pepsin ................................................................................................ 21

2.8 Faktor yang Mempengaruhi Reaksi Enzimatik ................................ 22

2.8.1 Konsentrasi Enzim ......................................................................... 22

2.8.2 Konsentrasi Substrat ...................................................................... 23

2.8.3 Suhu ............................................................................................... 23

2.8.4 Pengaruh pH .................................................................................. 24

2.9 SDS-PAGE ....................................................................................... 24

2.9.1 Medium Penyangga ...................................................................... 28

2.9.2 Sampel ........................................................................................... 29

2.9.3 Buffer ............................................................................................. 30

xii


2.9.4 Medan Listrik................................................................................. 30

BAB III METODE PENELITIAN ............................................................... 31

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian ........................................................... 31

3.2 Bahan Penelitian ............................................................................... 31

3.3 Alat Penelitian .................................................................................. 32

3.4 Tahap Penelitian ............................................................................... 32

3.4.1 Pengambilan Sampel ..................................................................... 32

3.4.2 Preparasi Reagent SDS-PAGE ...................................................... 32

3.4.3 Pembuatan Gel Elektroforesis ....................................................... 32

3.4.4 Pembuatan Simulasi Gelatin Cangkang Kapsul Lunak ................. 33

3.4.5 Ekstraksi Gelatin ............................................................................ 33

3.4.6. Hidrolisis Enzimatik Gelatin ........................................................ 34

3.5 Elektroforesis .................................................................................... 34

3.6 Analisa Profil Gelatin Hasil Elektroforesis ...................................... 35

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 37

4.1 Analisis Profil Protein dengan SDS-PAGE ...................................... 37

4.2 Pembahasan ...................................................................................... 41

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 46

5.1 Kesimpulan ....................................................................................... 46

5.2 Saran ................................................................................................. 46

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 47

Lampiran 1 .................................................................................................... 51

Lampiran 2 ..................................................................................................... 52

Lampiran 3 ..................................................................................................... 54

xiii


DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Komposisi Asam Amino Gelatin ....................................................... 11

Tabel 2. Standar Mutu Gelatin di Indonesia .................................................... 11

Tabel 3. Sifat Fisika Kimia Gelatin Komersial ................................................ 12

Tabel 4. Persyaratan Gelatin ............................................................................ 12

Tabel 5. Sifat Gelatin Tipe A dan Tipe B ........................................................ 14

Tabel 6. pH Aktivitas optinum Enzim ............................................................. 24

Tabel 7. Formula Gel Elektroforesis ................................................................ 32

Tabel 8. Nilai Log BM dan Nilai RF Marker Protein ...................................... 40

Tabel 9. Bobot Molekul Pita Gelatin Babi, Gelatin Sapi, Simulasi Cangkang

Kapsul Gelatin Sapi, Simulasi Cangkang Kapsul Gelatin Babi

dan Sampel ......................................................................................... 41

xiv


DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur Primer Protein .................................................................. 17

Gambar 2. Struktur Sekunder Protein .............................................................. 17

Gambar 3 Struktur Tersier Protein ................................................................... 18

Gambar 4. Struktur Umum Asam Amino ........................................................ 18

Gambar 5. Skema Alur Elektroforesis ............................................................. 26

Gambar 6. Polimerisasi dan “crosslingking” dari Akrilamid dan N,N’-metilen-bis

akrilamid ........................................................................................ 27

Gambar 7 Pembentukkan Ikatan Peptida ......................................................... 37

Gambar 8. Gel Hasil Elektroforesis ................................................................ 39

Gambar 9. Kurva Regresi Linear Standar Marker Protein ............................... 40

Gambar 10. Pemotongan Pepsin ...................................................................... 42

Gambar 11. Pita Spesifik Gelatin Babi dan Gelatin Sapi................................ 43

1


BAB Ia

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sediaan kapsul merupakan jenis sediaan farmasi yang sangat banyak

digunakan karena alasan kepraktisannya dan dapat menutupi rasa yang tidak

menyenangkan dari obat. Selain itu juga berfungsi untuk menjaga bahan aktif

dari pengaruh lingkungan sehingga menjaga stabilitasnya (Gadri dan Ega

Priani, 2012). Sediaan obat vitamin dan mineral sebagian besar dalam bentuk

cangkang kapsul keras dan cangkang kapsul lunak (ISO, 2014). Umumnya

cangkang kapsul terbuat dari gelatin yang kebanyakan diproduksi dari babi

sehingga diragukan kehalalannya (Gadri dan Ega Priani, 2012). Adanya

gelatin pada komponen cangkang kapsul menyebabkan obat lebih mudah

larut dalam sistem pencernaan, dan lebih banyak disukai oleh

konsumen karena bentuknya yang lunak sehingga mudah ditelan (Reich,

2001).

Gelatin merupakan polipeptida yang diperoleh melalui hidrolisis

kolagen jaringan ikat hewan. Gelatin memiliki sifat yang unik yakni dapat

membentuk gel sehingga digunakan secara luas dalam industri makanan dan

industri farmasi (Hidaka dan Liu, 2003). Industri gelatin umumnya

menggunakan kulit dan tulang babi karena selain mudah dan murah untuk

didapatkan, proses pembuatan dari kulit babi lebih cepat dan tidak

memerlukan bahan yang banyak. Hal ini dikarenakan jaringan ikat pada kulit

babi tidak terlalu kuat dibandingkan sapi, sehingga proses hidrolisis lebih

mudah dan tidak membutuhkan zat penghidrolisis, zat penetral, dan zat

pencuci yang terlalu banyak (Hana, 2009).

Produsen Gelatin Eropa pada tahun 2011 menyatakan bahwa sumber

utama gelatin diekstrak dari kulit babi sebanyak 80%, kulit sapi sebanyak

15%, dan sebanyak 5% sisanya berasal dari tulang babi, tulang sapi serta

unggas dan ikan (Jamaludin et al., 2011). Pada tahun 2012 GMIA

menyatakan sebanyak 90% gelatin komersial diperoleh dari babi (GMIA,

2012).

2


Penggunaan gelatin sebagai salah satu bahan baku kapsul lunak

menimbulkan kontroversi karena adanya kekhawatiran konsumen mengenai

kehalalan sumber gelatin (Jamaludin et al., 2011). Sebagai negara dengan

mayoritas penduduk muslim maka perlu dilakukan analisis terhadap sumber

gelatin pada cangkang kapsul lunak yang beredar dipasaran sebagai

perlindungan terhadap masyarakat yang menjadi konsumen produk farmasi

berbasis gelatin (Riaz dan Chaudry, 2004).

Analisis terhadap sumber gelatin sendiri telah dilakukan dengan

berbagai metode diantaranya adalah Fourier Transform Infrared

Spectroscopy (Hashim et al., 2010), Chemical precipitation (Hikada and Liu,

2003) dan Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) (Venien and

Levieux, 2005). Metode diatas terbukti dapat menentukkan sumber

pembuatan gelatin, akan tetapi memerlukan hasil yang berulang dan

pengalaman karena penyiapan sampel yang sensitif dan sulit (Hermanto, et

al., 2013).

Metode SDS-PAGE merupakan salah satu metode yang mampu

menunjukkan profil protein pita yang terbentuk dari gelatin babi dengan

gelatin sapi berdasarkan tingkat migrasi molekul. Keunggulan metode ini

adalah sudah lazim digunakan untuk analisa protein, relatif murah, penyiapan

sampel sederhana dan hanya membutuhkan sedikit sampel untuk analisa.

Seperti penelitian yang telah dilakukan oleh Hermanto et al (2013), tentang

perbedaan gelatin sapi dan gelatin babi dengan metode SDS-PAGE dengan

terlebih dahulu menghidrolisis gelatin menggunakan enzim pepsin pada suhu

60°C dan pH 4,5 sebelum dianalisis. Hasil penelitian Hermanto et al (2013)

mendapati adanya pita spesifik pada gelatin babi pada bobot molekul 28,6

dan 36,8 kDa. Hasil ini dapat digunakan sebagai acuan pembeda gelatin sapi

dan gelatin babi. Namun penelitian diatas dilakukan terbatas pada gelatin

murni yang belum mengalami proses menjadi produk seperti cangkang kapsul

lunak. Berdasarkan ulasan yang telah dipaparkan diatas maka pada penelitian

digunakan metode SDS-PAGE dengan menghidrolisis sampel dengan pepsin

sebelum dianalisa.

3


Dalam penelitian ini dilakukan analisis profil protein gelatin babi

dan gelatin sapi pada cangkang kapsul lunak vitamin menggunakan metode

Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrilamide Gel Electrophoresis. Hasil penelitian

yang didapat diharapkan dapat menjadi acuan dalam analisis produk farmasi

berbasis gelatin lainnya terutama gelatin cangkang kapsul lunak.

Gelatin sapi, gelatin babi dan sampel dihidrolisis enzimatik

menggunakan enzim pepsin. Pemilihan pepsin dikarenakan pepsin memiliki

sisi pemotongan spesifik pada ikatan peptida fenilalanin dan glutamat dimana

komposisi asam amino ini pada gelatin babi dua kali lebih banyak

dibandingkan gelatin sapi (Mohd et al., 2011). Sehingga diharapkan dapat

menghasilkan fragmen gelatin dengan bobot molekul yang relatif berbeda.

1.2 Perumusan Masalah

1. Bagaimana profil protein gelatin babi dan gelatin sapi hasil hidrolisis

pepsin dapat dibedakan dengan metode SDS-PAGE?

2. Bagaimana profil protein hidrolisat gelatin sapi, gelatin babi dan gelatin

cangkang kapsul lunak hasil analisis SDS-PAGE berdasarkan

karakteristik bobot molekulnya?

3. Apakah metode SDS-PAGE mampu menentukkan sumber gelatin pada

cangkang kapsul lunak?

1.3 Tujuan Penelitian

Mengidentifikasi sumber gelatin yang digunakan sebagai bahan

pembuatan cangkang kapsul gelatin lunak berdasarkan perbedaan bobot

molekul dihidrolisis dengan enzim pepsin.

1.4 Manfaat Penelitian

1. Hasil penelitian ini adalah informasi ilmiah pendahuluan tentang

karakteristik profil protein gelatin babi dan gelatin sapi pada cangkang

kapsul lunak berdasarkan bobot molekul.

4


2. Informasi ilmiah yang didapat diharapkan dapat memberikan kontribusi

dan menjadi acuan dalam analisa produk farmasi berbasis gelatin

khususnya kapsul lunak.

5


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kapsul

Kapsul adalah sediaan padat yang terdiri dari obat dalam cangkang

keras atau lunak yang dapat larut. Kapsul dapat didefinisikan sebagai bentuk

sediaan padat, dimana satu macam bahan obat atau lebih dan bahan inert

lainnya dimasukkan ke dalam cangkang atau wadah kecil yang umumnya

dibuat dari gelatin yang sesuai (Ansel, 1989).

Cangkang kapsul umumnya terbuat dari gelatin, tetapi dapat juga

dibuat dari bahan lain yang sesuai. Berdasarkan konsistensinya kapsul dapat

dibagi menjadi kapsul keras dan kapsul lunak. Kapsul gelatin keras terbuat

dari gelatin berkekuatan gel relatif tinggi dibandingkan kapsul gelatin

cangkang lunak. Berbagai jenis gelatin dapat digunakan dalam proses

pembuatan kapsul, tetapi gelatin dari campuran kulit dan tulang sering

digunakan untuk mengoptimalkan kejernihan dan kekerasan cangkang

(Departemen Kesehatan RI, 1995).

Kapsul gelatin cangkang keras yang diisi di pabrik dapat ditutup

secara sempurna dengan cara dilekatkan. Kapsul cangkang keras biasanya

diisi dengan serbuk, butiran atau granul, butiran gula inert dapat dilapisi

dengan komposisi bahan aktif dan penyalut yang dapat memberikan profil

lepas lambat (Departemen Kesehatan RI, 1995). Kebanyakan kapsul–kapsul

yang diedarkan dipasaran adalah jenis kapsul yang dapat ditelan oleh pasien

untuk keuntungan pengobatan (Ansel, 1989).

2.1.1 Jenis Kapsul

2.1.1.2 Kapsul Gelatin Cangkang Keras

Kapsul gelatin cangkang keras adalah sediaan padat yang terdiri dari

obat dalam cangkang keras atau lunak yang dapat larut (Ansel, 1989). Kapsul

gelatin cangkang keras terbuat dari gelatin berkekuatan gel relatif tinggi

dibandingkan kapsul gelatin cangkang lunak (Departemen Kesehatan RI,

1995).

6


Kapsul gelatin keras dibuat melalui suatu proses dengan cara

mencelupkan pin (alat pembentuk kapsul) kedalam larutan gelatin, kemudian

lapisan gelatin dikeringkan, dirapikan dan dilepaskan dari pin tersebut, bagian

induk dan tutup kapsul tersebut dilekatkan (Departemen Kesehatan RI. 1995).

Cangkang kapsul kosong dibuat dari campuran gelatin, gula dan air jernih

tidak berwarna mengandung uap air Antara 9–12% (Ansel, 1989).

Cangkang gelatin kapsul keras dibuat dalam dua bagian yaitu badan

kapsul dan bagian tutupnya yang lebih pendek. Kedua bagian ini akan saling

menutupi saat di pasangkan. Umumnya kapsul gelatin keras dipakai untuk

menampung isi 65 mg–1 gram bahan serbuk, termasuk bahan obat dan bahan

tambahan lainnya (Ansel, 1989).

Kapsul gelatin tidak tepat diisi dengan cairan berair, karena air akan

melunakkan gelatin dan menimbulkan kerusakan bentuk sediaan kapsul.

Apabila disimpan dalam lingkungan dengan kelembapan yang tinggi,

penambahan uap air akan diabsorbsi oleh kapsul dan kapsul keras ini akan

mengalami perubahan bentuk sediaan. Sebaliknya dalam lingkungan udara

yang sangat kering, sebagian dari uap air yang terdapat dalam kapsul gelatin

akan berkurang atau hilang dan mengakibatkan kapsul ini menjadi rapuh

(Ansel, 1989).

2.1.1.3 Kapsul Gelatin Cangkang Lunak

Kapsul gelatin cangkang lunak dibuat dari gelatin atau bahan lain

yang sesuai. Kapsul gelatin lunak dapat diplastisasi dengan penambahan

senyawa poliol atau plasticizer seperti sorbitol atau gliserin. Perbandingan

bahan plastisasi kering terhadap gelatin kering menentukkan kekerasan

cangkang dan dapat diubah untuk penyesuaian dengan kondisi lingkungan

dan juga sifat isi kapsul (Departemen Kesehatan RI, 1995).

Untuk pembuatan kapsul lunak dalam skala industri, dilakukan

dengan cara rotary die process, yaitu suatu metode yang dikembangkan oleh

Robert P. Scherer pada tahun 1993. Dengan metode ini cairan gelatin yang

dituangkan dari tangki yang terletak diatas, dibentuk menjadi dua buah pita

yang berurutan oleh mesin rotary die. Dalam waktu yang bersamaan bahan

7


obat akan diisikan dan dimasukkan diantara kedua pita secara tepat. Ketika

itu dies membentuk kantung–kantung dari pita gelatin. Kemudian kantung–

kantung gelatin yang telah terisi, disegel dengan tekanan dan panas (Ansel,

1989).

Kapsul cangkang lunak dapat dibuat dengan berbagai macam bentuk

Antara lain, bundar, lonjong, bentuk pipa, membujur, dan lain–lainnya.

Kapsul–kapsul gelatin lunak dapat digunakan untuk mengisi macam–macam

jenis bahan, bentuk cair dan kering. Jenis cairan yang dapat dimasukkan ke

dalam kapsul gelatin lunak termasuk: Cairan yang tidak tersatukkan dengan

air, cairan yang mudah menguap dan tidak menguap, contohnya minyak

nabati, hidrokarbon aromatik dan hidrokarbon alifatik, eter, ester, alkohol,

dan asam organik. Cairan yang tersatukkan dengan air, cairan yang tidak

menguap seperti polietilen glikol dan surfaktan nonionik seperti polisorban

80. Cairan yang tersatukkan dengan air dan kelompok komponen yang tidak

menguap seperti propilen gllikol dan isopropil alkohol (Ansel, 1989).

Cairan yang mudah berpindah ke cangkang kapsul tidak dapat

dimasukkan kedalam kapsul gelatin lunak. Bahan–bahan ini termasuk air

diatas 5%, senyawa organik yang larut air dengan berat molekul rendah dan

senyawa yang mudah menguap seperti alkohol keton, asam amino dan ester–

ester (Ansel, 1989).

2.2 Formulasi Simulasi Pembuatan Cangkang Kapsul Gelatin Lunak

Pembuatan lembaran kapsul gelatin lunak dari standar gelatin sapi

dan babi dilakukan dengan tujuan untuk membuat produk kapsul lunak yang

serupa dengan produk yang beredar di pasaran sehingga hasil analisis

karakteristik protein menggunakan SDS-PAGE yang didapatkan diharapkan

tidak terlalu berbeda dengan produk yang diambil dari pasaran. Lembaran

kapsul gelatin lunak dalam penelitian ini dibuat dari gelatin, gliserin, air, dan

pewarna.

Bahan baku tipe cangkang kapsul gelatin lunak adalah gelatin,

plasticizer, dan material lainnya seperti pewarna. Plasticizer digunakan pada

formulasi ini untuk membuat cangkang kapsul menjadi elastis dan lunak.

8


Penggunaannya pada formulasi cangkang kapsul lunak berkisar antara 20–

30%. Plasticizer yang paling sering digunakan pada formulasi pembuatan

cangkang kapsul lunak adalah gliserin. Pemilihan dan jumlah plasticizer yang

digunakan mempengaruhi kekerasan kapsul. Plasticizer yang dipilih dalam

formulasi pembuatan cangkang kapsul lunak memiliki kompatibilitas dengan

bahan pengisi kapsul dan mudah proses penggunaannya (Bhatt dan Agrawal,

2007).

Gliserin ditambahkan dalam kapsul untuk mempertahankan elastisitas

selama proses pengeringan dan penyimpanan agar kapsul tidak rusak atau

rapuh. Gliserin secara umum lebih efektif daripada sorbitol. Gliserin dapat

berinteraksi secara langsung dengan gelatin membentuk gel yang stabil, akan

tetapi gliserin memberikan efek sedikit higroskopis sehingga membutuhkan

tambahan yang memberikan efek lembab secara tidak langsung. Sorbitol

merupakan plasticizer tidak langsung, bertindak sebagai agen pelembab dan

dengan adanya air akan menjadi plasticizer yang efektif (Reich, 2001).

Air berjumlah 20–30% dari formulasi gel basah dan air memiliki

peran penting untuk menjamin keberhasilan enkapsulasi. Kehilangan air

selama pengeringan akan menyebabkan gel gelatin menyusut sedikit demi

sedikit, akibatnya menjelang akhir proses pengeringan retakan mungkin

terjadi dan menyebabkan cangkang kapsul pecah. Kelebihan air akan dibuang

melalui proses pemanasan. Pengeringan dilakukan untuk menghilangkan

sebagian air dan didalam kapsul masih terdapat sekitar 5–8% air yang terikat

dalam gelatin (Bhatt et al, 2007).

Pewarna kapsul gelatin lunak digunakan untuk memberikan warna

pada kapsul gelatin lunak. Pewarna dapat berasal dari pewarna sintetik dan

alami. Pewarna dapat digunakan sebagai pelindung isi kapsul yang tidak

stabil dengan adanya cahaya (Bhatt dan Agrawal, 2007).

Kapsul gelatin cangkang lunak dapat dibentuk elips atau seperti bola.

Kapsul jenis ini dapat diisi cairan, suspensi, bahan berbentuk pasta atau

serbuk kering (Ansel, 1989). Untuk skala kecil, kapsul gelatin lunak dibuat

dengan cara proses lempeng dengan menggunakan seperangkat cetakan untuk

membentuk kapsul. Tahapan proses lempeng dimulai dengan menempatkan

9


selembar gelatin hangat yang tidak berwarna pada permukaan cetakan bagian

bawah, kemudian selembar gelatin lainnya diletakkan diatasnya kemudian

diberi tekanan. Gaya tekan ini bertindak sebagai pembuat kapsul. Pengisian

bahan obat dan pemasangan segelnya dilakukan dalam waktu yang

bersamaan dan serentak, kemudian kapsul yang sudah dicetak dipindahkan

dan dicuci dengan pelarut yang tidak mengganggu dan merusak kapsul

(Ansel, 1989).

2.3 Gelatin

Gelatin adalah produk alami yang diperoleh dari hidrolisis parsial

kolagen. Kolagen mengandung 14% hydroxyprolin, 16% prolin dan 26%

glisin. Rantai kolagen terdiri dari tiga rangkaian polipeptida dengan urutan

glisin (gly), prolin (pro) dan hidroksiprolin (hyp). Tiga rantai peptida tersebut,

masing–masing mempunyai struktur heliks dan bersama–sama membentuk

tiga untaian heliks. Tiga untaian tersebut membentuk gulungan yang

berikatan dengan atom hidrogen. Satu unit kolagen disebut tropokolagen,

dengan berat molekul ± 30 kda dengan panjang kira–kira 280 nm dan

diameter 1,4–1,5 nm (Jannah, 2008).

Gelatin merupakan sistem koloidal padat (protein) dalam cairan (air)

sehingga pada suhu dan kadar air yang tinggi gelatin mempunyai kemampuan

cairan yang disebut fase sol atau hidrosol, sebaliknya pada suhu dan kadar air

yang rendah gelatin mempunyai kemampuan yang lebih kasar atau lebih

pekat strukturnya, yang disebut fase gel. Pemanasan dan penambahan air akan

mengubah gelatin menjadi fase sol, sebaliknya pendinginan dan pengurangan

air akan mengubah gelatin menjadi fase gel (Jannah, 2008).

2.3.1 Komposisi Gelatin

Struktur umum gelatin adalah –Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-4Hyp-

Gly-Pro- (Jannah, 2008). Lima asam amino yang ada umumnya meliputi

glisin 26,4%-30,5%; prolin 14,8%-18%; hidroksiprolin 13,3%-14,5%; asam

glutamat 11,1%-11,7%; dan alanin 8,6%-11,3% (Grobben et al., 2004).

Kandungan Hidroksiprolin ini berpengaruh pada kekuatan gelatin. Semakin

10


tinggi kandungan Hidroksiprolin kekuatan gel gelatin akan semakin kuat

(Jannah, 2008). Asam amino penyusun protein dalam gelatin lain dalam

jumlah yang sedikit meliputi arginin, asam aspartat, lisisn, serin, leusin, valin,

fenilalanin, treonin, isoleusin, hidroksilisin, histidin, metionin dan tirosin

(Grobben et al, 2004).

2.3.2 Sifat Fisika Kimia Gelatin

Gelatin hampir tidak berasa dan tidak berbau, lembaran gelatin

bersifat rapuh, padat dan jernih kekuningan, gelatin memiliki kelembaban 8-

13% dan memiliki massa jenis 1,3-1,4 g/cm. Gelatin larut dalam gliserol,

propilen glikol, asam asetat, trifluoroethanol dan formamida. Gelatin tidak

larut dalam benzene, aseton, alkohol primer dan dimetilformamida (GMIA,

2012). Gelatin mengandung protein yang sangat tinggi dan rendah kadar

lemaknya. Gelatin kering dengan kadar air 8–12% mengandung protein

sekitar 84–86%, mineral 2%-4%, serta lemak dan hampir tidak ada vitamin

(Carr et al, 1995).

Gelatin dapat mengembang dalam air dingin, dapat membentuk film,

mempengaruhi viskositas suatu bahan dan dapat melindungi sistem koloid.

Pada suhu 71ºC gelatin mudah larut dalam air dan membentuk gel pada suhu

35-50ºC. Gelatin mempunyai kemampuan menyerap air 5–10 kali dan

menjadi swelling dalam air dingin. Gelatin bersifat termal reversible yaitu

setelah gel dipanaskan dan selanjutnya didinginkan dapat membentuk gel

kembali. Gelatin yang dipanaskan diatas suhu 45°C secara bertahap akan

kehilangan kemampuan untuk mengembang. Gelatin terdiri dari banyak

polipeptida atau formasi heliprolin panjang yang masing–masing terdiri dari

3000–4000 asam amino (Jannah, 2008).

Gelatin merupakan turunan kolagen yang merupakan protein dengan

komponen dasar 50,5% karbon, 6,8% hidrogen, 17% nitrogen dan 25,2%

oksigen. Gelatin merupaka protein, gelatin akan mengalami reaksi yang sama

seperti protein jika berinteraksi dengan enzim-enzim proteolitik (GMIA,

2012).

11


Tabel 1. Komposisi Asam Amino Gelatin (Sumber : GMIA)

Type A (Pork

Skin)

Type B (Calf

Skin)

Type B (Bone)

Alanine 8,6 10,7 9,3 11,0 10,1 14,2

Arginine 8,3 9,1 8,55 8,8 5,0 9,0

Aspartic Acid 6,2 6,7 6,6 6,9 4,6 6,7

Cystine 0,1 Trace Trace

Glutamic Acid 11,3 11,7 11,1 11,4 8,5 11,6

Glycine 26,4 30,5 26,9 27,5 24,5 28,8

Histidine 0,9 1,0 0,74 0,8 0,4 0,7

Hydroxylycine 1,0 0,91 1,2 0,7 0,9

Hydroxyproline 13,5 14,0 14,5 11,9 13,4

Isoleucine 1,4 1,7 1,8 1,3 1,5

Leucine 3,1 3,3 3,1 3,4 2,8 3,5

Lysine 4,1 5,2 4,5 4,6 2,1 4,4

Methionine 0,8 0,9 0,8 0,9 0,0 0,6

Phenylalanine 2,1 2,6 2,2 2,5 1,3 2,5

Proline 16,2 18,0 14,8 16,4 13,5 15,5

Serine 2,9 4,1 3,2 4,2 3,4 3,8

Threonine 2,2 2,2 2,0 2,4

Tyrosine 0,4 0,9 0,2 1,0 0,0 0,2

Valine 2,5 2,8 2,6 3,4 2,4 3,0

Gelatin memiliki sifat amfoterik, gelatin akan menjadi kation dalam

larutan asam dan menjadi anion dalam larutan basa. Gelatin tipe A memiliki

titik isoelektrik 4,7-5,4 dan gelatin tipe B memiliki titik isoelektrik 4,6-9.

Pada titik isoelektriknya partikel gelatin tidak memiliki muatan dan tidak

terjadi perpindahan partikel gelatin.

Sifat fisika, kimia dan fungsional gelatin merupakan sifat yang

sangat penting untuk menentukkan mutu gelatin. Sifat yang bisa dijadikan

parameter dalam menentukkan mutu gelatin antara lain, kekuatan gel,

viskositas dan rendemen.

Tabel 2. Standar Mutu Gelatin di Indonesia (Sumber: Jannah, 2008)

Karakteristik Syarat

Warna

Bau, rasa

Kadar air (%)

Kadar abu (%)

Logam berat (mg/ kg)

Arsen (mg/ kg)

Tembaga (mg/ kg)

Tidak berwarna

Normal

Normal Maksimal 16

Maksimal 3,25

Maksimal 50

Maksimal 2

Maksimal 30

12


Seng (mg/ kg)

Sulfit (mg/ kg)

Maksimal 100

Maksimal 1000

Tabel 3. Sifat Fisika Kimia Gelatin Komersial (Sumber: Jannah, 2008)

Parameter Gelatin Standar

(SIGMA)

Gelatin komersial

(tulang sapi)

Viskositas (cP)

Kekuatan gel (Bloom)

Titik Gel (º)

Ttitik Leleh (º)

Titik Isoelektrik Protein

Kadar air (%)

Kadar Abu (%)

Kadar Lemak (%)

Kadar Total Protein (%)

Ph

4,17

279,10

8,20

24

8

9,26

2,26

1,95

5,91

4,61

7

328,57

19,5

29,6

7

12,21

1,66

0,23

85,99

5

Tabel 4. Persyaratan Gelatin (Sumber: FAO)

Parameter Persyaratan

Kadar Abu

Kadar Air

Belerang Dioksida

Arsen

Logam Berat

Timah Hitam

Batas Cemaran Mikroba

Standar Plate Count

E. Coli

Streprococci

<2%

<18%

< 40 mg/ kg

< 1 mg/ kg

<50 mg/ kg

<5 mg/ kg

<104/ gr

<10/ gr

<102/ gr

13


2.3.3 Klasifikasi Gelatin

Berdasarkan proses pembuatannya (perendaman) gelatin dapat

diklasifikasikan menjadi gelatin tipe A dan gelatin tipe B. Gelatin tipe A

adalah gelatin yang dihasilkan melalui proses perendaman menggunakan

asam. Pada gelatin tipe A biasanya bahan yang digunakan adalah kulit babi

dan sapi muda. Kulit binatang tersebut tidak memiliki ikatan yang kuat. Pada

dasarnya kolagen yang berada pada kulit atau tulang direndam dengan pelarut

pada pH 4 dan kemudian dipanaskan bertahap pada suhu 50ºC sampai

mendidih untuk mendenaturasi dan melarutkan kolagen. Setelah itu kolagen

yang telah berubah sifat disaring untuk memperoleh kemurnian yang tinggi.

Peningkatan konsentrasi gelatin dilakukan dengan evaporasi vakum atau

membran ultrafiltrasi. Kemudian dilakukan proses pengeringan dengan cara

melewatkan udara kering diatas gel. Akhir proses dengan melakukan

penggilingan dan pengemasan. Gelatin yang dihasilkan mempunyai pH

isoelektrik antara 7–9 tergantung dari bahan baku dan pelarut asam yang

digunakan untuk memproses kolagen yang menyebabkan hidrolisis terbatas

pada sisi rantai asam amino asparagin dan glutamin. Penggunaan asam yang

berlebih berfungsi untuk menetralisir garam–garam yang tersisa (Jannah,

2008).

Gelatin B jika proses pembuatannya menggunakan basa. Gelatin tipe

ini diproduksi menggunakan larutan alkali seperti soda kaustik atau larutan

kapur untuk mendapatkan kolagen dengan waktu perendaman yang lama

sebelum ekstraksi gelatin. Pada proses alkali biasanya menggunakan bahan

baku kulit sapi dan babi atau sumber kolagen dari binatang lain yang sudah

tua (Cole, 2002). Proses alkali ini menghidrolisis asparagin dan glutamin

menjadi asam aspartat dan asam glutamat relatif cepat (Veis, 1964), yang

menghasilkan gelatin dengan titik isoelektrik 4,8–5,2, meskipun dengan

memperpendek waktu perendaman alkali (7 hari atau lebih sedikit) akan

menghasilkan gelatin dengan titik isoelektrik setinggi 6. Setelah proses alkali,

kolagen dicuci dengan asam untuk membebaskan alkali dan untuk

penyesuaian pH ekstraksi (yang mempunyai efek pada kekuatan gel pada

perbandingan viskositas produk akhir yaitu gelatin). Kolagen ini kemudian

14


didenaturasi dan dikonversi menjadi gelatin dengan pemanasan seperti pada

proses asam (Jannah, 2008).

Tabel 5. Sifat Gelatin Tipe A dan Tipe B (Sumber: Jannah, 2008)

Sifat Tipe A Tipe B

Kekuatan gel (g

bloom)

Viskositas (cp)

Kadar abu (%)

pH

Titik isoelektrik

75 – 300

2,0 – 7,5

0,3 – 2,0

3,8 – 6,0

9,0 – 9,2

75 – 275

2,0 – 7,5

0,05 – 2,0

5,0 – 7,1

4,8 – 5,0

2.4 Protein

Kata protein berasal dari protos atau proteos yang berarti pertama

atau utama. Protein memiliki beberapa fungsi, lima diantaranya sebagai

biokatalisator (enzim), protein cadangan, biomol transfor bahan, struktur dan

protektif (Martoharsono, 2006). Protein adalah polimer dari asam amino yang

dihubungkan dengan asam amino. Komposisi rata–rata unsur kimia dalam

protein adalah karbon 50%, Hidrogen 7%, oksigen 23%, nitrogen 16%,

belerang 0-3%, dan fosfor 0-3% (Poedjiadi, 1994).

Protein memiliki berat molekul bervariasi dengan cara hidrolisis

oleh asam atau oleh enzim protein akan menghasilkan asam asam amino. Ada

20 jenis asam amino yang terdapat dalam molekul protein. Asam amino ini

terikat satu sama lain oleh ikatan peptida. Beberapa faktor yang dapat

mempengaruhi protein adalah suhu tinggi, pH, dan pelarut organik (Poedjiadi,

1994).

2.4.1 Penggolongan Protein

Ditinjau dari strukturnya protein dapat dibagi dalam dua golongan

besar yaitu, golongan protein sederhana dan protein gabungan. Protein

sederhana adalah protein yang hanya terdiri atas molekul–molekul asam

amino. Sedangkan protein gabungan adalah protein yang terdiri atas protein

15


dan gugus bukan protein. Gugus ini disebut dengan gugus prostetik dan terdiri

atas karbohidrat, lipid, atau asam nukleat (Poedjiadi, 1994).

Protein sederhana dapat dibagi dalam dua bagian menurut bentuk

molekulnya, yaitu protein fiber dan protein globular. Protein fiber

mempunyai bentuk molekul panjang seperti serat atau serabut, sedangkan

protein globular berbentuk bulat. Protein fiber terdiri atas beberapa rantai

polipeptida yang memanjang dan dihubungkan satu dengan yang lain oleh

beberapa ikatan silang hingga berbentuk serat atau serabut yang stabil. Sifat

umum protein fiber adalah tidak larut dalam air dan sukar diuraikan oleh

enzim (Poedjiadi, 1994).

Protein dapat diklasifikasikan berdasarkan kelarutan, bentuk fungsi

biologi atau struktur tiga dimensinya. Berdasarkan fungsi biologisnya,

protein dapat diklasifikasikan sebagai enzim (dehidrogenase kinase). Protein

penyimpanan (ferritin dan myoglobin), protein pengikat–DNA, hormon

peptida, protein struktural (kolagen dan proteoglikan), protein pelindung

(faktor pembekuan darah dan imunoglobin), protein pengangkut (hemoglobin

dan lipoprotein plasma) dan protein kontraktil atau motil (aktin dan tubulin)

(Murray et al., 2006).

2.4.2 Struktur Protein

Ada empat tingkat struktur dasar protein, yaitu struktur primer,

sekunder, tersier dan kuartener. Untuk mengetahui jumlah, jenis, dan urutan

asam amino dalam protein dapat dilakukan analisis yang terdiri dari beberapa

tahap, penentuan jumlah rantai polipeptida yang berdiri sendiri, pemecahan

ikatan antara rantai polipeptida tersebut, pemecahan masing–masing rantai

polipeptida, dan analisis urutan asam amino pada rantai polipeptida

(Poedjiadi, 1994).

Pada rantai polipeptida terdapat banyak gugus >C=O dan gugus >N-

H. Kedua gugus ini dapat berikatan satu dengan yang lain karena

terbentuknya ikatan hidrogen antara atom oksigen dari gugus >C=O dengan

atom hidrogen dari gugus >N-H. Apabila ikatan hidrogen ini terbentuk antara

16


gugus–gugus yang terdapat dalam satu rantai polipeptida, maka akan

terbentuk struktur heliks (Poedjiadi, 1994).

Ikatan hidrogen ini dapat pula terjadi antara dua rantai polipeptida

atau lebih dan akan membentuk konfigurasi α yaitu bukan bentuk heliks tetapi

rantai sejajar yang berkelok–kelok dan disebut struktur lembaran berlipat

(pleated sheet structure). Ada dua bentuk lembaran berlipat, yaitu bentuk

paralel dan bentuk anti paralel. Bentuk paralel terjadi apabila rantai

polipeptida yang berikatan melalui ikatan hidrogen itu sejajar dan searah,

sedangkan bentuk anti paralel terjadi apabila rantai polipeptida berikatan

dalam posisi sejajar tetapi berlawanan arah (Poedjiadi, 1994).

Struktur tersier, menunjukkan kecenderungan polipeptida

membentuk lipatan atau gulungan, dan dengan demikian membentuk struktur

yang lebih kompleks. Struktur ini dimantapkan dengan oleh adanya beberapa

ikatan Antara gugus R pada molekul asam amino yang membentuk protein

(Poedjiadi, 1994).

Struktur kuartener menunjukkan derajat persekutuan unit–unit

protein. Sebagian besar protein globular terdiri atas beberapa rantai

polipeptida yang terpisah. Rantai polipeptida ini saling berinteraksi

membentuk persekutuan.

2.4.2.1 Struktur Protein Primer

Struktur primer menunjukkan jumlah, jenis dan urutan asam amino

dalam molekul protein (Poedjiadi, 1994). Struktur primer protein

menggambarkan urutan linear residu asam amino dalam suatu protein. Urutan

asam amino selalu dituliskan dari gugus terminal amino ke gugus terminal

karboksil. Struktur 3 dimensi protein tersusun dari struktur sekunder, tersier

dan kuartener. Faktor yang menentukkan untuk menjaga atau menstabilkan

ketiga tingkat struktur tersebut adalah ikatan kovalen yang terdapat pada

struktur primer (Fatchiyah et all., 2011).

17


Gambar 1. Struktur Primer Protein

(Sumber: http://sciencebiotech.net)

2.4.2.2 Struktur Protein Sekunder

Struktur sekunder dibentuk karena adanya ikatan hidrogen antara

hidrogen amida dan oksigen karbonil dari rangka peptida. Struktur sekunder

utama meliputi α – heliks dan β – sheet (Fatchiyah et al., 2011).

Gambar 2. Struktur Sekunder Protein


2.4.2.3 Struktur Protein Tersier

Struktur tersier menggambarkan rantai polipeptida yang mengalami

folded sempurna. Beberapa polipeptida folded terdiri terdiri dari beberapa

protein globular yang berbeda yang digabungkan oleh residu asam amino.

Unit tersebut dinamakan domain. Struktur tersier distabilkan oleh interaksi

antara gugus R yang terletak tidak bersebelahan pada rantai polipeptida.

Pembentukkan struktur tersier membuat struktur primer dan sekunder

menjadi saling berdekatan (Fatchiyah et al., 2011).

http://sciencebiotech.net/


18


Gambar 3. Struktur Tersier Protein


2.4.2.4 Struktur Kuartener

Struktur kuartener melibatkan asosiasi dua atau lebih rantai

polipeptida yang membentuk multisubunit atau protein oligomerik. Rantai

polipeptida penyusun protein oligomerik dapat berbeda atau sama (Fatchiyah,

2011).

2.5 Asam Amino

Asam amino adalah asam karboksilat yang mempunyai gugus

amino. Asam amino yang terdapat sebagai komponen protein mempunyai

gugus –NH2 pada atom karbon α dari posisi gugus –COOH. (Poedjiadi, 1994).

Gambar 4. Struktur Umum Asam Amino

(Sumber, Poedjiadi, 2009)

2.5.1 Sifat–Sifat Asam Amino

Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam

pelarut organik non polar seperti eter, aseton, dan kloroform. Sifat asam

amino ini berbeda dengan asam karboksilat maupun dengan sifat amina.


19


Asam karboksilat alifatik maupun aromatik yang terdiri atas beberapa atom

karbon umumnya kurang larut dalam air tetapi larut dalam pelarut organik.

Demikian pula amina pada umumnya tidak larut dalam air, tetapi larut dalam

pelarut organik (Poedjiadi, 1994).

Perbedaan sifat antara asam amino dengan asam karboksilat dan

amina terlihat pula pada titik leburnya. Asam amino mempunyai titik lebur

yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan asam karboksilat atau amina.

Kedua sifat fisika ini menunjukkan bahwa asam amino cenderung

mempunyai struktur yang bermuatan dan mempunyai polaritas tinggi, hal ini

tampak pada sifat asam amino sebagai elektrolit (Poedjiadi, 1994).

Apabila asam amino larut dalam air, gugus karboksilat akan

melepaskan ion H+, sedangkan gugus amina akan menerima ion H+.

-COOH -COO- + H+

-NH2 + H+ -NH3+

Oleh adanya kedua gugus tersebut asam amino dalam larutan dapat

membentuk ion yang bermuatan positif dan juga bermuatan negatif (zwitter

ion) atau ion amfoter. Keadaan ion ini sangat tergantung pada pH larutan.

Apabila larutan asam amino dalam air ditambah dengan basa, maka asam

amino akan terdapat dalam bentuk (I) karena konsentrasi ion OH- yang

mampu mengikat ion – ion H+ yang terdapat pada gugus –NH3+ (Poedjiadi,

1994).

2.5.2 Peptida

Beberapa molekul asam amino dapat berikatan satu dengan yang

lain membentuk suatu senyawa yang disebut peptida. Apabila jumlah asam

amino yang berikatan tidak lebih dari sepuluh molekul disebut oligopeptida.

Peptida yang dibentuk oleh dua molekul asam amino disebut dipeptida.

Selanjutnya tripeptida dan tetrapeptida adalah peptida yang terdiri atas tiga

molekul dan empat molekul asam amino. Polipeptida adalah peptida yang

molekulnya terdiri dari banyak molekul asam amino. Protein adalah suatu

polipetida yang terdiri atas lebih dari seratus asam amino (Poedjiadi, 1994).

20


2.5.3 Sifat Peptida

Peptida diperoleh dengan cara hidrolisis protein yang tidak

sempurna. Apabila peptida yang terjadi dihidrolisis lebih lanjut, akan

dihasilkan asam–asam amino. Sifat peptida ditentukkan oleh gugus –COOH

dan gugus R. Sifat asam dan basa pada peptida ditentukkan dengan gugus –

COOH dan –NH2, namun pada peptida rantai panjang, gugus –COOH dan –

NH2 yang terletak diujung rantai tidak lagi berpengaruh. Suatu peptida juga

mempunyai titik isoelektrik seperi pada asam amino (Poedjiadi, 1994).

Untuk memperoleh informasi tentang peptida tidak cukup dengan

mengetahui jenis dan banyaknya molekul asam amino yang membentuk

peptida, tetapi diperlukan keterangan tentang urutan asam amino ini adalah

degradasi Edman yang terdiri atas dua tahap reaksi, yaitu pertama reaksi

peptida dengan fenilisotianat dan reaksi kedua adalah pemisahan asam amino

ujung yang telah bereaksi dengan fenilisotiosianat. Cara degradasi Edman

hanya digunakan untuk menentukkan peptida yang tidak terlalu panjang.

Untuk peptida yang panjang digunakan cara penguraian oleh enzim–enzim

tertentu (Poedjiadi, 1994).

2.6 Enzim

Enzim merupakan protein biokatalisator. Sejak tahun 1926

pengetahuan tentang enzim atau enzimologi berkembang dengan cepat. Hasil

penelitian para ahli biokimia ternyata banyak enzim mempunyai gugus bukan

protein, dan termasuk golongan protein majemuk. Enzim semacam ini

(holoenzim) terdiri atas protein (apoenzim) dan suatu gugus bukan protein.

Contohnya enzim katalase terdiri atas protein dan ferriprotorfirin. Ada juga

enzim yang terdiri atas protein dan logam, misalnya askorbat oksidase adalah

protein yang mengikat tembaga (Poedjiadi, 1994).

Gugus bukan protein ini dinamakan kofaktor ada yang terikat kuat

pada protein, ada pula yang tidak begitu kuat ikatannya. Gugus yang terikat

kuat pada bagian protein disebut gugus prostetik. Sedangkan yang tidak kuat

ikatannya, jadi yang mudah dipisahkan secara dialisis disebut koenzim. Baik

gugus prostetik maupun koenzim merupakan bagian enzim yang

21


memungkinkan enzim bekerja terhadap substrat, yaitu zat yang akan diubah

oleh enzim (Poedjiadi, 1994).

Suatu enzim bekerja secara khas terhadap suatu substrat tertentu.

Kekhasan inilah merupakan ciri suatu enzim. Ini sangat berbeda dengan

katalis lain (bukan enzim) yang dapat bekerja terhadap berbagai macam

reaksi (Poedjiadi, 1994).

2.6.1 Aktivitas Enzim

Aktivitas biologis enzim adalah sebagai biokatalis, yang

mempermudah perubahan substrat menjadi produk. Dengan demikian,

adanya enzim akan mengurangi jumlah substrat dan bersamaan dengan itu

menambah konsentrasi produk (Sadikin, 2002).

𝐸 + 𝑆 ↔ 𝐸𝑆 → 𝐸 + 𝑃

Dalam reaksi ini, jumlah S (substrat) akan turun dan bersamaan

dengan itu, jumlah P (Produk) akan naik. Kecepatan perubaan ini dipengaruhi

oleh jumlah E (Enzim). Untuk mengukur laju reaksi ini, dapat dilakukan

pengukuran konsentrasi S dalam dua waktu yang berbeda. Laju reaksi juga

dapat diukur dengan dengan mengukur kenaikan konsentrasi P, juga dalam

dua waktu yang berbeda.

Satuan untuk aktivitas enzim dinamai unit. Satu unit internasional

(UI) enzim sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk mengubah 1 mmol

substrat stau menghasilkan 1 mmol produk dalam waktu 1 menit, dalam suhu

dan pH lingkungan yang tertentu (Sadikin, 2002).

Satuan internasional lain untuk aktivitas enzim yaitu katal (singkatan

dari katalitik). Dalam sistem SI ini, 1 katal adalah jumlah enzim yang

diperlukan untuk mengubah 1 mol substrata tau menghasilkan 1 mol produk

dalam waktu 1 detik, dalam suhu dan pH lingkungan tertentu (Sadikin, 2002).

2.7 Pepsin

Pepsin merupakan enzim golongan hidrolase. Pepsin bekerja sebagai

pemutus ikatan peptida dan disebut sebagai peptidase (Poedjiadi, 2002). Ada

dua macam peptidase, yaitu endopeptidase dan eksopeptidase. Endopeptidase

22


memecah protein pada tempat–tempat tertentu dalam molekul protein dan

tidak mempengaruhi gugus yang terletak diujung molekul. Sebagai contoh

adalah enzim pepsin yang terdapat dalam usus halus dan papain, suatu enzim

yang terdapat dalam pepaya. Eksopeptidase bekerja pada kedua ujung

molekul protein. Karboksipeptidase dapat melepas asam amino yang

memiliki gugus –COOH bebas pada ujung molekul protein. Sedangkan

aminopeptidase dapat melepas asam amino pada ujung lain yang memiliki

gugus –NH2 bebas, dengan demikian eksopeptidase melepas asam amino

secara berurutan dimulai dari asam amino ujung pada molekul protein hingga

seluruh molekul terpecah menjadi asam amino (Poedjiadi, 1994).

Pepsin merupakan enzim yang dikeluarkan dalam bentuk prekursor

enzim berupa pepsinogen. Pepsin merupakan enzim yang berfungsi

mendegradasi protein dalam sistem pencernaan makanan. Pepsin merupakan

enzim yang memecah ikatan antara peptida hidrofobik dan asam amino

aromatik, seperti fenilalanin, triptofan dan tirosin. Pepsin diekspresikan

sebagai pepsinogen. Aktivasi pepsinogen terjadi ketika pH larutan

pepsinogen diturunkan. Penurunan pH diyakini membuka rantai samping

karboksilat pepsin yang menyebabkan kompleks memecah dan mengarah

pada pembentukkan enzim aktif (James dan Sielecki, 1986).

Pepsin akan memecah molekul protein menjadi polipeptida yang lebih

kecil dengan memutus ikatan peptida yang ada pada sisi NH2 bebas dari asam-

asam amino aromatik (fenilalanin, tirosin dan triptofan), hidrofobik (Leusin,

isoleusin dan metionin), atau dikarboksilat (glutamat dan aspartat).

2.8 Faktor yang Mempengaruhi Reaksi Enzimatik Pepsin

2.8.1 Konsentrasi Enzim

Makin besar konsentrasi enzim makin banyak pula produk yang

terbentuk dalam tiap waktu pengamatan. Pada awal pengamatan, kesan

tersebut berbanding lurus. Dengan bertambahnya waktu, pada tiap

konsentrasi enzim pertambahan jumlah produk akan menunjukkan defleksi,

tidak lagi berbanding lurus sejalan dengan berjalannya waktu tersebut, karena

setelah beberapa waktu, jumlah substrat yang tersedia sudah mulai berkurang,

23


sehingga dengan sendirinya produk olahan enzim akan berkurang (Sadikin,

2002).

2.8.2 Konsentrasi Substrat

Peningkatan konsentrasi substrat akan meningkatkan kecepatan

reaksi. Akan tetapi pada batas konsentrasi tertentu tidak terjadi kenaikan

kecepatan reaksi walaupun konsentrasi substrat diperbesar. Agar terjadi

kompleks enzim substrat, diperlukan adanya kontak antara enzim dengan

substrat. Kontak ini terjadi pada suatu tempat atau bagian enzim yang disebut

bagian aktif. Pada konsentrasi substrat rendah, bagian aktif enzim ini hanya

menampung substrat sedikit. Bila konsentrasi substrat diperbesar, makin

banyak substrat yang dapat berhubungan dengan enzim pada bagian aktif

tersebut. Dengan demikian konsentrasi kompleks enzim substrat makin besar

dan hal ini menyebabkan makin besarnya kecepatan reaksi. Pada suatu batas

konsentrasi substrat tertentu, semua bagian bahan aktif telah dipenuhi oleh

substrat atau telah jenuh oleh substrat. Dalam keadaan ini, bertambah

besarnya konsentrasi substrat tidak menyebabkan bertambah besarnya

konsentrasi kompleks enzim substrat, sehingga jumlah hasil reaksinya pun

tidak bertambah (Poedjiadi, 1994).

2.8.3 Suhu

Pada suhu rendah reaksi kimia berlangsung lambat, sedangkan pada

suhu yang lebih tinggi reaksi kimia berlangsung lebih cepat. Enzim adalah

suatu protein, kenaikan suhu dapat menyebabkan terjadinya proses

denaturasi, maka bagian aktif enzim akan terganggu dan dengan demikian

konsentrasi efektif enzim menjadi berkurang dan kecepatan reaksinya pun

akan menurun (Poedjiadi, 1994).

Kenaikan suhu, sebelum terjadinya proses denaturasi dapat

menaikkan kecepatan reaksi. Koefisien suhu suatu reaksi diartikan sebagai

kenaikan kecepatan reaksi sebagai akibat kenaika suhu 10ºC. Koefisien suhu

ini diberi simbol Q10. Untuk reaksi yang menggunakan enzim, Q10 ini berkisar

antara 1,1 hingga 3,0 artinya setiap kenaikan suhu 10ºC, kecepatan reaksi

24


mengalami kenaikan 1,1 hingga 3,0 kali. Namun kenaikan suhu pada saat

mulai terjadinya proses denaturasi akan mengurangi kecepatan reaksi. Oleh

karena ada dua pengaruh yang berlawanan, maka akan terjadi suatu titik

optimum, yaitu suhu yang paling tepat bagi satu reaksi yang menggunakan

enzim tertentu (Poedjiadi, 1994).

Tiap enzim memiliki suhu optimum tertentu. Pada umumnya enzim

yang terdapat pada hewan memiliki suhu optimum antara 40ºC-50ºC,

sedangkan pada tumbuhan antara 50ºC-60ºC. Sebagian besar enzim

terdenaturasi pada suhu diatas 60ºC (Poedjiadi, 1994).

2.8.4 Pengaruh pH

Struktur ion enzim tergantung pada pH lingkungannya. Enzim dapat

berbentuk ion positif, ion negatif atau ion bermuatan ganda (zwitter ion).

Dengan demikian perubahan pH lingkungan akan berpengaruh terhadap

efektivitas bagian aktif enzim dalam membentuk kompleks enzim substrat.

Nilai pH tertentu dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi dan ini

akan menyebabkan terjadinya proses denaturasi dan mengakibatkan

menurunnya aktivitas enzim.

Tabel 6. Beberapa enzim dengan nilai optimum

Enzim pH Optimum

Sukrase

Amilase

Lipase

Pepsin

Tripsin

6,2

5,6 – 7,2

7,0

1,5 – 2,5

8 - 11

(Sumber: Poedjiadi, 1994)

2.9 SDS-PAGE

Elektroforesis merupakan suatu cara untuk memisahkan fraksi-

fraksi campuran berdasarkan atas pergerakan partikel–partikel koloid yang

bermuatan, dibawah pengaruh medan listrik. Cara elektroforesis banyak

25


digunakan untuk analisa asam nukleat, virus, enzim, dan protein (Bintang,

2010).

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga

untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik

yang digunakan. Gel poliakrilamid merupakan matriks penyanga yang

banyak dipakai untuk memisahkan protein (Fatchiyah, 2011).

Dalam larutan, protein enzim akan bermuatan yang tergantung pada

pH larutan dan titik isoelektrik (PI) enzim. Pada titik isoelektriknya, protein

tidak akan bergerak dibawah pengaruh medan listrik. Pada keadaan pH

dibawah PI, protein bergerak sebagai kation dimana kecepatannya naik

bersamaan dengan turunnya pH, kation ini akan bergerak kearah elektroda

negatif. Pada keadaan pH diatas PI, protein akan bergerak sebagai anion dan

kecepatannya akan naik bersamaan dengan meningkatnya pH, anion ini akan

bergerak ke arah elektroda positif. Elektroforesis pada umumnya digunakan

untuk menentukkan berat molekul (BM), mendeteksi kemurnian dan

kerusakan protein atau asam nukleat, menetapkan titik isoelektrik, serta

memisahkan spesies–spesies yang berbeda secara kualitatif dan kuantitatif

(Bintang, 2010).

Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis

(SDS–PAGE) merupakan elektroforesis gel untuk memisahkan molekul

protein dengan metode two-dimensional gel electroforesis yaitu

menggunakan dua macam gel dengan masing-masing buffer yang berbeda.

Gel yang digunakan pada SDS-PAGE adalah running gel dan stacking gel

(Alberts et al., 2002).

26


Gambar 5. Skema Alur Elektroforesis

(Sumber: www.siumed.edu)

Protein didalam larutan membawa muatan elektrik tertentu pada

semua nilai pH kecuali pada titik isoelektriknya sehingga protein dapat

bermigrasi dalam suatu daerah elektrik. Elektroforesis gel memisahkan

protein dengan lebih baik dibandingkan dibandingkan dengan elektroforesis

didalam larutan bebas. Gel tersebut memisahkan protein dengan matriks yang

mirip jala dengan variasi ukuran pori. Pemisahan dapat dioptimasi dengan

mengubah derajat cross-linking gel. Pada sebagian besar aplikasi, gel

dijalankan dengan nilai pH netral atau sedikit basa, dimana sebagian besar

protein bermigrasi kearah anoda. Sistem gel dapat meminimalisasi konveksi

dan difusi protein sehingga pita protein pada gel akan terpisah dan terlihat

jelas (Rybicki dan Purves, 2008).

Medium penyangga dibuat dari reaksi polimerasi akrilamid dan bis–

akrilamid yang dikatalisis oleh ammonium persulfat dan tetrametilendiamin

(TEMED). SDS bersama merkaptoetanol digunakan untuk merusak struktur

tiga dimensi protein. Hal ini terjadi akibat reduksi ikatan disulfida

membentuk gugus sulfidril yang dapat mengikat SDS sehingga protein

bermuatan sangat negatif dan bergerak kearah kutub positif. Gel

poliakrilamid bersifat porous dengan ukuran lubang berkisar dari 0,6–4,0 nm

(diameter molekul protein globular 1,6–8,0 nm) dan ditentukkan dari persen

http://www.siumed.edu/

27


total akrilamid ditambah bis–akrilamid didalam campuran gel, serta

perbandingan relatif akrilamid dan bis–akrilamid. Migrasi protein didalam

gel poliakrilamid terutama ditentukkan oleh muatan molekul dan juga

dipengaruhi oleh ukuran molekul (Bintang, 2010).

Gambar 6. Polimerisasi dan “crosslinking”

dari akrilamida dan N,N’-metilen-bis-akrilamida

(Sumber: Burden & Whitney, 1958)

Gel poliakrilamid dalam dibentuk sebagai sebagai lembaran dalam

lempengan kaca. Dalam perangkat elektroforesis, gel diletakkan diantara dua

buffer chamber sebagai sarana untuk menghubungkan kutub negatif dan

kutub positif. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya

tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut

terlarut. Bila berada dalam satu medan listrik, molekul biologi yang

bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif, dan demikian

sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk

memisahkan molekul–molekul berdasarkan muatannya (Fatchiyah, 2011).

28


Gel poliakrilamid dapat digunakan tidak hanya untuk pemisahan

dari berbagai protein, tetapi juga untuk membandingkan berat molekulnya.

Teknik ini dapat digunakan baik untuk tujuan preparatif maupun pemisahan

analitik dari sampel protein. Teknik elektroforesis ini hanya diperlukan

beberapa mikrogram sampel saja (Bintang, 2010).

Poliakrilamid dapat memisahkan protein dengan kisaran berat 500–

250.000 bp atau polinukleotida dengan kisaran 5–2000 bp. Pori matriks ini

terbentuk dari ikatan silang Antara akrilamid dan bis–akrilamid. Ukuran pori

pada gel poliakrilamid dapat dikecilkan dengan cara meningkatkan

persentase total akrilamid (%T) atau dengan meningkatkan banyaknya ikatan

silang (%C) dengan bis – akrilamid (Fatchiyah, 2011).

Gel 20%T %%C bis berarti bahwa kandungan total akrilamid dan

bis–akrilamid sebesar 20% (w/ v) dimana kandungan bis–akrilamid 5% dari

total akrilamid dan bis–akrilamid. Pada % T yang sama, 5%C menghasilkan

ukuran pori terkecil. Diatas dan dibawah 5%C, besarnya pori bertambah.

Untuk mendapatkan hasil pemisahan protein yang diinginkan, diperlukan %T

tertentu yang sesuai. %T yang terlalu tinggi akan menghalangi bergeraknya

protein, sedangkan %T yang terlalu rendah akan menyebabkan protein

protein kurang atau tidak memisah karena protein bergerak sangat cepat pada

gel (Fatchiyah, 2011).

Polimer yang terbentuk menyebabkan gel berpori–pori. Besarnya

pori–pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi akrilamid dan bis–

akrilamid. Jika diameter pori gel sama dengan X, maka protein dengan ukuran

lebih kecil dari X akan mudah dan cepat bergerak kedalam gel, sedangkan

molekul berukuran lebih besar dari X juga akan bergerak tetapi lebih lambat

(Fatchiyah, 2011).

2.9.1 Medium Penyangga

Teknik elektroforesis dapat dibagi menjadi dua bagian, yaitu

elektroforesis free boundary dan elektroforesis zona. Elektroforesis free

boundary merupakan pemisahan parsial dalam tabung gelas vertikal dari

campuran protein yang membentuk suatu boundary dengan bufer yang sesuai.

29


Penerapan arus listrk menghasilkan pergerakan protein, karena terjadi migrasi

dengan laju yang berbeda maka protein akan terpisah (Bintang, 2010).

Pada elektroforesis zona, dengan melakukan pemisahan pada

medium penyangga seperti gel poliakrilamid, akan diperoleh pita protein

yang lebih stabil. Konsentrasi gel harus disesuaikan agar tidak terlalu encer

dan juga tidak terlalu padat (bintang, 2010). Pada elektroforesis dalam

matriks gel poliakrilamid, protein memisah ketika protein bergerak melalui

matriks tiga dimensi dalam medan listrik. Matriks poliakrilamid berfungsi

untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran dan menstabilkan pH buffer

agar muatan protein tidak berubah (Fatchiyah, 2011).

2.9.2 Sampel

Larutan yang dipisahkan mempengaruhi laju migrasi termasuk

muatan, ukuran, dan bentuk molekul terlarut. Muatan total akan meningkat

apabila laju migrasi meningkat, besarnya muatan biasanya tergantung pada

pH. Ukuran molekul yang lebih besar menyebabkan migrasi menurun dan

kekuatan elektrostatika disekitar larutan meningkat, sedangkan bentuk

molekul yang berbeda dengan ukuran yang sama seperti protein globular dan

fibrous dikarakteristik menghambat migrasi, karena perbedaan bentuk

molekul dapat mempengaruhi pergerakan molekul dan kekuatan elektrostatik

(Bintang, 2010).

Protein merupakan molekul amfoter karena mempunyai gugus

amino positif dan karboksil negatif. Dengan demikian, protein dapat

mengion, baik pada pH basa maupun pada pH asam. Pada pH rendah, protein

bersifat sebagai kation (bermuatan positif) yang cenderung bergerak kearah

katoda (elektroda negatif). Pada pH tinggi, protein bersifat sebagai anion

(bermuatan negatif) yang cenderung bergerak kearah anoda (elektroda

positif). Nilai diantara kedua pH tersebut dinamakan titik isoelektrik

(isoelectric point atau pI) yaitu nilai pH dimana protein menjadi tidak

bermuatan. Pada pH tersebut, jumlah muatan negatif yang dihasilkan dari

proteolisis sebanding dengan jumlah muatan positif yang diperoleh dari

30


penangkapan proton. Protein yang tidak bermuatan tidak dapat bergerak pada

medan listrik (Fatchiyah, 2011).

Hampir semua protein mempunyai pH kurang dari 8,0. Oleh karena

itu, pH buffer elektroforesis yang berkisar 8–9 akan menyebabkan sebagian

besar protein bermuatan negatif yang akan bergerak ke anoda (Fatchiyah,

2011).

2.9.3 Buffer

Sistem buffer digunakan untuk mempertahankan pH didalam

reservoir dan didalam medium penyangga, disamping itu sistem buffer

berfungsi sebagai elektrolit pembawa aliran listrik. Buffer yang digunakan

harus berinteraksi dengan molekul yang dipisahkan dan pH yang digunakan

harus sesuai sehingga campuran molekul dapat dipisahkan satu sama lain

tetapi tidak mengakibatkan denaturasi. pH dipilih berdasarkan jenis campuran

yang akan dipisahkan, umumnya pemisahan maksimal dapat dicapai pada

titik isolistrik (Bintang, 2010).

2.9.4 Medan Listrik

Sumber arus listrik yang stabil diperlukan untuk menghasilkan aliran

listrik dengan voltase yang konstan. Kekuatan ionik medan listrik pada

kisaran 2–8 V/ cm sesuai untuk suhu ruang. Apabila kekuatan medan magnet

lebih besar dari 10 V/ cm, maka akan terjadi kehilangan air yang besar karena

proses penguapan akibat dari panas yang ditimbulkan. Larutan buffer

kemudian dialirkan kedalam tangki penyangga untuk menggantikan air yang

hilang, dan ini mengakibatkan pergeseran pita–pita. Pemanasan yang berlebih

menyebabkan senyawa senyawa terdenaturasi. Metode–metode pendinginan

medium pemisahan dapat dilakukan, sehingga kekuatan medan 100V/ cm

dapat digunakan. Keuntungan elektroforesis pada voltase tinggi adalah

terjadinya pemisahan yang cepat (Bintang, 2010).

31


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Pusat Laboratorim Terpadu (PLT) UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta, selama 4 bulan, terhitung bulan Desember 2014-

Maret 2015.

3.2 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelatin babi

(technical) dan gelatin (technical) yang didapatkan dari PT. EMS Indonesia,

sampel kapsul lunak Pharmaton Formula, Obipluz, Omepros dan Nature E

yang didapat dari Apotek Kimia Farma, jalan Ir. H. Juanda No. 111

Situgintung-ciputat, Tangerang Selatan, Banten.

Bahan kimia yang digunakan larutan Akrilamid/ Bis (30%;

2,67%C); SDS 10% (w/ v), sampel buffer (Tris HCl 0,5 M; Glycerol; SDS dan

Bromophenol Blue), Tris HCl 0,5 M pH 6,8, gliserin, enzim pepsin (from

porchine gastric mucosa, P7000-25G Sigma-aldrich), SDS (Sodium Dodecyl

Sulphate) 10%, aquades, Bromophenol Blue, 2-merkaptoethanol, Natrium

asetat, asam asetat (glacial), Ammonium persulfate for electroforesis 98%

sigma-ald A3678-25G, Coomasie Briliant blue R250 (Bio-Rad), asam asetat

pekat, TEMED (N,N,N;,N’ –tetra metil etilen diamin) (E.Merc), HCl 6N,

protein standar (prestained broad range) catalog # 161-0317 Bio-Rad,

Larutan Running buffer (Tris basa, Glycerol dan SDS), larutan pewarna (0,1%

commasie blue dalam larutan metanol : air : asam asetat (5:5:2)), marker

protein (prestained SDS-PAGE standar broad range) dari Bio-Rad dengan

ukuran 14,5 kDa–200 kDa. larutan pembilas (metanol 30% dan asam asetat

10%), gliserol, larutan buffer asetat 0,1N pH 5, air deionisasi dan aseton.

32


3.3 Alat Penelitian

Alat–alat yang digunakan dalam penelitian adalah tabung eppendorf

2 mL, mikro tip, mikropipet (P2, P10, P200 dan P1000) sentrifus, timbangan

digital, votex, pH meter, Waterbath, hotplate stirer, alumunium foil, pinset,

tabung reaksi, gelas beaker (50 mL, 100 mL, dan 250 mL), lemari pendingin,

pengaduk kaca, wadah pencetak gelatin, label penanda, Printer scan Canon

PIXMA MG2920, tissue, sarung tangan, shaker, Power Supply, dan Mini

Protean Gel Electrophoresis BioRad.

3.4 Tahap Penelitian

3.4.1 Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel diambil secara simple random sampling dari

daftar vitamin softgel yang terdapat pada ISO indonesia volume 46. Teknik

sampling didasarkan pada tujuan yang ingin dicapai, biaya yang tersedia,

jumlah sampel yang diperlukan dan kemudahan untuk memperoleh sampel

tersebut. Sampel dibeli di apotek kimia farma, jalan Ir. H. Juanda No. 111

Situgintung – ciputat, Tangerang Selatan, Banten .

3.4.2 Preparasi Reagent SDS-PAGE

Tahap preparasi reagent terdapat pada lampiran 3.

3.4.3 Pembuatan Gel Elektroforesis

Medium gel elektroforesis dibuat dengan konsentrasi stacking gel

4% dan resolving gel 12% denga formulasi seperti tabel

Tabel 7. Formula gel elektroforesis (Sumber : BioRad)

Persen

Gel

Air deionisasi

(ml)

Akrilamid/bis

(ml)

Gel buffer*

(ml)

10% w/v SDS

(ml) 4% 6,1 1,3 2,5 0,1

12% 3,4 4,0 2,5 0,1 *Resolving Gel Buffer – 1,5M tris-HCL; pH 8,8

*Stacking Gel Buffer – 0,5 M tris-HCL; pH6,6

33


3.4.4 Pembuatan Simulasi Gelatin Cangkang Kapsul Lunak

Gelatin babi dan gelatin sapi masing-masing ditimbang sebanyak 25

g. Masing-masing gelatin dimasukkan kedalam beaker glass dan dibasahi

dengan 25 mL air hangat. Campuran gelatin dan air hangat ditambahkan

gliserin sebanyak 7mL yang berfungsi sebagai plasticizer kemudian

ditambahkan 4 tetes pewarna. Gelatin yang telah ditambahkan plasticizer dan

tetesan pewarna diaduk sampai semua gelatin larut sempurna menggunakan

pengaduk kaca. Setelah tercampur secara merata, larutan tersebut dituangkan

kedalam cetakan untuk membentuk lembaran gelatin. Larutan dikeringkan

hingga lembaran glatin terbentuk dan mengeras dan didinginkan dalam

kulkas untuk mengurangi kadar airnya (Widyaninggar et al, 2012). Berat

akhir gelatin simulasi yang terbentuk masing-masing untuk gelatin sapi 2,51

g dan berat gelatin simulasi babi 2,12 g.

3.4.5 Ekstraksi Gelatin

Sampel gelating cangkang kapsul lunak terdiri dari 4 merk berbeda.

Isi kapsul lunak dikeluarkan. Masing-masing cangkang kapsul kosong

kemudian ditimbang masing-masing. Ditimbang berat kosong cangkang

kaspul lunak pharmaton formula 0,62 gram, Obipluz 0,55 gram, 0,61 gram,

dan Nature-E 0,47 gram.

Sebanyak 500 mg masing-masing cangkang kapsul lunak dan

simulasi cangkang kapsul lunak ditimbang dan ditambahkan 5 mL aquadest

dalam taung reaksi kemudian dipanaskan dalam waterbath pada suhu 60°C.

Setelah larut kemudian simulasi dan sampel disentrifus pada 6000 rpm selama

30 menit. Supernatant yang terbentuk dipipet dan dipindahkan pada tabung

reaksi baru dan ditambahkan aseton dengan perbandingan 1:4 (v: v), gelatin

praktis tidak larut dalam aseton, supernatan akan menggumpal dengan

penambahan aseton. Kemudian simulasi dan sampel yang telah ditambahkan

aseton disentrifus kembali pada 6000 rpm selama 30 menit. Gumpalan gelatin

yang terbentuk diambil dan disimpan dalam cawan penguap dengan label dan

ditutup alumunium foil, kemudian dioven pada suhu 50 °C selama 1 jam.

Endapan kering kemudian ditimbang dan disimpan dalam suhu ruang (Azira

34


et al., 2012 dengan modifikasi). Gelatin hasil ekstraksi yang didapatkan

adalah simulasi gelatin babi 312 mg, simulasi gelatin sapi 305 mg, pharmaton

175 mg, Obipluz 148 mg, Omeproz 188 mg dan Nature-E 165 mg.

3.4.6 Hidrolisis Enzimatik Gelatin

Gelatin standar, sampel dan simulasi kering ditimbang sebanyak 100

mg secara akurat dan dimasukkan kedalam centrifuge tube 50 mL dan

ditambahkan 5 mL buffer asetat 0,1 N pH 4,5. Kemudian dibuat larutan

pepsin dengan cara ditimbang sebanyak 2 mg enzim pepsin dan dilarutkan

dalam 1 mL buffer dalam tabung reaksi. Sebanyak 1 mL masing-masing

gelatin standar, sampel dan simulasi yang telah ditambahkan buffer asetat

dimasukkan kedalam tabung eppendorf 2 mL, kemudian masing-masing

tabung ditambahkan 20 µL larutan pepsin. Sebagai kontrol digunakan

larutan gelatin standar (sapi) tanpa penambahan enzim. Selanjutnya masing-

masing tube diinkubasi pada suhu 60ºC selama 1 jam. Setelah diinkubasi

kemudian gelatin sampel dan simulasi didinginkan pada suhu ruang dan

ditambahkan NaOH 0,01 M sebanyak 200 µL pada masing-masing gelatin

standar, sampel dan simulasi. Gelatin siap dielektrorofsis (Hermanto et al,

2013 dengan modifikasi).

3.5. Elektroforesis

Elektroforesis dilakukan berdasarkan metode Laemmli. Gel

poliakrilamid dicetak diantara dua buah lempengan kaca. Kemudian

resolving gel (lampiran 3) yang telah disisapkan dimasukkan kedalam

cetakan gel dengan menggunakan mikropipet sampai tanda batas. Kemudian

ditambahkan aquadest pada permukaan gel agar gel memiliki permukaan

yang rata. Setelah rata aquadest dibuang dengan cara diserap menggunakan

tisu. Gel membeku dalam waktu 60 menit. Setelah gel membeku atau

mengeras, kemudian disiapkan larutan stacking gel (Lampiran 3). Larutan

stacking gel dimasukkan kedalam cetakan dan permukaan gel ditutup

menngunakan sisir dan dibiarkan sampai gel mengeras. Setelah gel mengeras,

cetakan gel dimasukkan kedalam wadah elektroforesis. kemudian

35


dimasukkan running buffer ke tengah ruang antara 2 plat gel sampai penuh

dari sisi luar (sampai merendam bagian bawah gel). Pada saat penambahan

running buffer dilakukan secara hati-hati untuk mencegah terbentuknya

gelembung udara. Larutan sampel disiapkan untuk di elektroforesis.

Larutan sampel dan simulasi cangkang kapsul lunak yang telah

dihidrolisis masing-masing dipipet menggunakan mikropipet sebanyak 10µl

dan dimasukkan kedalam tabung effendorf. Kedalam masing-masing tabung

ditambahkan buffer sample sebanyak 10µl, tabung kemudian dipanaskan

dalam waterbath pada suhu 60°C selama 5 menit, kemudian dipipet

menggunakan mikropipet sebanyak 10 µl dan dimasukkan kedalam sumuran

gel elektroforesis. (Hames, 1998).

Peralatan elektroforesis disambungkan pada power pack. Anoda

(kutub positif) dihubungkan dengan reservoir atas dan katoda (kutub negatif)

dihubungkan dengan reservoir bawah, elektroforesis pada 150 volt dengan

arus 40 mA, Running dilakukan sampai batas gel, 1 cm dari batas bawah

resolving gel. Proses elektroforesis berlangsung selama 60 menit.

Setelah proses elektroforesis selesai, gel dilepaskan dari cetakan,

kemudian dilakukan visualisasi gel menggunakan comassie blue. Gel

diwarnai dengan 0,05% (w/v) comassie blue R-250 dalam methanol 15%

(v/v) dan asam asetat 5% (v/v) pewarnaan dilakukan diatas shaker selama

semalaman, gel kemudian gel kemudian dicuci menggunakan larutan

destaining diatas shaker selama 15 menit (Hames, 1998). Setelah pita terlihat

gel dicuci menggunakan aquadest.

3.6 Analisa Profil Gelatin Hasil SDS-PAGE

Analisis pola SDS-PAGE dilakukan dengan membandingkan pita

protein gelatin standar, protein simulasi cangkang kapsul lunak dan protein

sampel dengan protein standar. Bobot molekul dari masing-masing protein

ditentukkan dengan cara menghitung RF dari masing-masing pita protein

yang tampak pada gel. Kemudan dibuat kurva standar hubungan antara log

BM dengan Rf dari protein standar sehingga BM protein sampel dapat

dihitung

36


Analisis data dilakukan dengan perhitungan berat molekul (BM) dari

masing-masing protein yang didasarkan pada marker yang tersedia.

Perhitungan dilakukan dengan mengukur total jarak tracking dari stacking gel

ke separating gel (a), dilanjutkan dengan mengukur jarak tracking dari

stacking gel ke masing-masing pita protein yang terbentuk (b), kemudian

dicari retardation factor (Rf) dengan membagi jarak masing-masing pita

dengan jarak tracking total (b/a), selanjutnya dihitung nilai log BM dari

masing-masing BM pita marker. BM pita polipeptida pada sampel dihitung

dengan persamaan linear {Y = a + bX} dimana nilai RF sebagai sumbu X dan

Log BM sebagai sumbu Y (Mahasri, 2010).

37


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Analisa Profil Protein dengan SDS-PAGE

Protein dibentuk dari susunan asam amino yang dihubungkan oleh

ikatan peptida.

Gambar 7. Pembentukan ikatan peptida

Ikatan peptida terbentuk oleh asam amino yang berikatan dengan asam amino

lainnya. Atom H dari gugus amina berikatan dengan atom OH dari gugus

hidroksil menghasilkan air.

Enzim pepsin sebagai biokatalisator akan mengkatalis pemotongan

ikatan peptida tersebut. Pepsin akan memecah molekul protein menjadi

polipeptida yang lebih kecil dengan memutus ikatan peptida yang ada pada

sisi NH2 bebas dari asam-asam amino aromatik (fenilalanin, tirosin dan

triptofan), hidrofobik (Leusin, isoleusin dan metionin), atau dikarboksilat

(glutamat dan aspartat). Kondisi lingkungan kerja enzim dibuat sedemikian

dengan tujuan mendapatkan kinerja optimal dari enzim tersebut.

Analisa profil protein dilakukan menggunakan SDS-PAGE (Sodium

Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) berdasarkan

pemisahan protein yang telah dihidrolisis pada kondisi pH 4,5 dan temperatur

60°C selama 1 jam. Metode ini akan memisahkan protein sesuai dengan berat

molekulnya. Metode elektroforesis tidak mempengaruhi struktur biopolimer

dan sensitif terhadap perbedaan muatan dan berat molekul yang cukup kecil.

(Hammes, B. D. 1998). Protein akan bergerak dalam satu medium yang

mengandung medan listrik dan menyebabkan protein bermuatan tersebut

38


bergerak dalam medium yang disebabkan perbedaan polaritas. Mobilitas

molekul protein dipengaruhi beberapa faktor diantaranya bentuk molekul,

ukuran molekul, konsentrasi gel, waktu elektroforesis dan voltase

elektroforesis yang digunakan dalam gel.

Elektroforesis diatur dengan tegangan 150 v dengan arus sebesar 40

mA. Pengaturan ini dapat dimodifikasi sesuai dengan keperluan. Pengaturan

tersebut dipilih karena memberikan hasil yang paling baik diantara

percobaan-percobaan yang telah dilakukan. Sumber arus listrik yang stabil

diperlukan untuk menghasilkan aliran listrik dengan voltase yang konstan.

Larutan buffer kemudian dialirkan kedalam tangki penyangga untuk

menggantikan air yang hilang, dan ini mengakibatkan pergeseran pita–pita.

Pemanasan yang berlebih menyebabkan senyawa-senyawa terdenaturasi.

Metode–metode pendinginan medium pemisahan dapat dilakukan, sehingga

kekuatan medan 100V/ cm dapat digunakan. Keuntungan elektroforesis pada

voltase tinggi adalah terjadinya pemisahan yang cepat (Bintang, 2010).

Setelah marker, standar dan sampel dielektroforesis didapatkan

hasil berupa lembaran gel, kemudian lembaran gel tersebut diwarnai dengan

Bromophenol Blue dan diinterpretasikan dengan scaner. Setelah didapatkan

hasil gambar dalam bentuk soft copy, kemudian diukur panjang tracking pita

dari atap sumuran sampai dasar sumuran, jarak tracking tiap band dari atap

sumuran sampai tiap-tiap pita yang terdeteksi dihitung dengan rumus

persamaan regresi linear untuk mengetahui berat molekul pada masing-

masing band/ pita protein.

Pada penelitian ini sampel terdiri dari empat produk vitamin yang

berbeda, marker protein serta gelatin standar dan simulasi. Untuk marker

disebutkan selanjutnya kolom satu, standar gelatin sapi kolom dua, standar

gelatin babi kolom tiga, simulasi cangkang kapsul gelatin sapi kolom 4,

simulasi cangkang kapsul gelatin babi kolom 5, sampel Pharmaton kolom 6,

sampel Omepros kolom 7, sampel Obipluz kolom 8, sampel Nature E kolom

9 dan standar gelatin sapi tanpa enzim kolom 10.

Dari hasil penelitian diperoleh pita dari masing-masing sampel

gelatin cangkang kapsul dan gelatin simulasi. Kemudian dilakukan skrining

39


pita-pita protein untuk ditentukan nilai faktor retensi (Rf) dan berat

molekulnya (BM). Penentuan nilai Rf dari pita marker protein dihitung

dengan cara membagi jarak pita (jarak dari sumuran sampai ke pita) dengan

batas akhir garis elektroforesis. Terbentuk 9 pita marker protein dengan berat

molekul 200 KDa, 116 KDa, 97,4 KDa, 66 KDa, 45 KDa, 31 KDa, 21.5 KDa

dan 14.5 KDa. Berat molekul marker protein yang telah diketahui kemudian

dihitung nilai BM-nya. Perhitungan logaritma BM dan nilai Rf dapat dilihat

pada tabel 7.

Hasil elektroforesis marker protein dan protein sampel dapat dilihat pada

gambar 8.

KDa

200

Gambar 8. Gel Hasil Elektroforesis. Keterangan gambar: 1 = Marker, 2 = Standar Gelatin

Sapi, 3 = Standar Gelatin Babi, 4 = Simulasi Cangkang Kapsul Gelatin Sapi, 5 = Simulasi

Cangkang Kapsul Gelatin Babi, 6 = Sampel Pharmaton, 7 = Sampel Omepros, 8 = Sampel

Obipluz, 9 = Nature E, 10 = Standar gelatin sapi tanpa enzim.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

116

97.4

66

14.5

21.5

31

45

6.5

40


Analisa diawali dengan perhitungan regresi linear seri log bobot

molekul pita pemisahan marker sebagai sumbu y dan nilai Rf sebagai sumbu

x.

Tabel 8. Nilai Log BM dan Nilai RF Marker Protein

No BM (KDa) Log BM Pergerakan

warna (mm)

Jarak Pita

(mm) Rf (x)

1 200 2.30 57 5.0 0.08

2 116 2.06 57 11.5 0.20

3 97.4 1.99 57 16 0.29

4 66 1.82 57 19.5 0.32

5 45 1.65 57 25.5 0.45

6 31 1.49 57 31 0.54

7 21.5 1.33 57 42 0.74

8 14.5 1.16 57 53.5 0.94

9 6.5 0.82 57 57 1

Kemudian dibuat kurva standar nilai RF yang diperoleh terhadap

nilai log BM yang dapat dilihat pada gambar 8.

Hasil regresi linear diatas kemudian digunakan untuk menghitung

bobot molekul pita pemisahan protein gelatin. Berdasarkan perhitungan

diperoleh nilai a = 2,262, b = -1,316 dan nilai r = - 0,968. Maka diperoleh

rumus y = -1,316x + 2,262, dengan rumus yang diperoleh dapat ditentukkan

nilai Rf, BM dan Log BM dari pita protein sampel yang terbentuk.

2,32,06 1,99

1,821,65

1,491,33

1,16

0,82

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0,08 0,2 0,29 0,32 0,45 0,54 0,74 0,94 0,98

Log

BM

rf

Kurva Standar Marker Protein

Gambar 9. Kurva Regresi Linear Standar Marker Protein

41


Tabel 9. Bobot Molekul Pita Gelatin Babi, Gelatin Sapi, Simulasi Cangkang Kapsul Gelatin

Sapi, Simulasi Cangkang Kapsul Gelatin Babi, dan Sampel.

NO SGS

(mm)

SGB

(mm)

SCKS

(mm)

SCKB

(mm)

P

(mm)

OM

(mm)

OB

(mm)

NE

(mm)

SGSTE

(mm)

BM

(kDa)

1 20,5 20,5 20,5 20,5 20,5 20,5 20,5 20,5 - 61,52

2 26 - 26 - - - 26 26 45,92

3 31 31 31 31 31 31 31 31 - 35,16

4 - 35,5 - 35,5 - - - - - 27,67

5 40 - 40 - - 40 40 40 - 21,78

4 - 41 - 41 - - - - - 20,65

5 - 54 - 54 - - - - - 10,35

Keterangan : SGS=Standar Gelatin Sapi, SGB=Standar Gelatin Babi, SKCS=Simulasi

Cangkang Kapsul Sapi, SCKB=Simulasi Cangkang Kapsul Babi, P=Pharmaton,

OM=Omepros, OB=Obipluz, NE=Nature E, SGSTE=Simulasi Gelatin Sapi Tanpa Enzim.

4.2 Pembahasan

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui profil protein gelatin babi

dan gelatin sapi pada sampel yang diuji gelatin babi (technical) dan gelatin

(technical) yang didapatkan dari PT. EMS Indonesia, sampel kapsul lunak

Obipluz, Omeproz dan Nature E yang didapat dari apotek kimia farma, jalan

Ir. H. Juanda No. 111 Situgintung-ciputat, Tangerang Selatan, Banten.

Pemisahan protein SDS-PAGE menunjukkan pola pemisahan yang

baik setelah dilakukan hidrolisis menggunakan enzim pepsin dengan waktu

inkubasi 1 jam pada suhu 60°C. Pemilihan waktu inkubasi hidrolisis enzim

pepsin selama 1 jam pada suhu 60°C berdasarkan penelitian Hermanto et al

(2013) dimana pemisahan sudah dapat diidentifikasi dengan baik setelah

hidrolisis menggunakan enzim pepsin selama 1 jam pada suhu 60°C. Seperti

pada gambar 7.

Pada gambar 7 dapat dilihat pada kolom 10 protein yang tidak

terhidrolisis memiliki bobot molekul yang besar dan bertumpuk diatas 200

kDa. Namun setelah dilakukan hidrolisis selama satu jam menunjukkan

adanya fragmen polipeptida yang berada pada kisaran berat molekul 61,52

kDa dan 10,3 kDa. Hal ini menunjukkan aktivitas enzim pepsin dalam

42


pemotongan ikatan peptida protein menjadi fragmen polipeptida dengan

rentang berat molekul 65,45 kDa sampai 14,49 kDa.

Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari protein menunjukkan

kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang

sama yang berada pada posisi pita yang sama. Sesuai dengan prinsip

pergerakan molekul bermuatan, molekul dengan muatan dan ukuran yang

sama akan terakumulasi pada zona yang sama atau berdekatan (Soedarmadji,

1996). Hasil berupa pita-pita protein yang mengendap sesuai dengan berat

molekulnya, semakin kebawah berat molekulnya semakin kecil (Hames,

1990). Dari hasil pengamatan didapatkan pita protein dengan berat molekul

seperti pada tabel 9.

Pepsin sebagai enzim yang di gunakan untuk memotong protein

untuk menjadi fragmen-fragmen rantai polipeptida memiliki situs-situs

spesifik pemotongan. Pepsin memotong rantai polipeptida dengan memutus

ikatan peptida yang ada pada sisi NH2 bebas dari asam-asam amino aromatik

(Fenilalanin, tirosin dan triptofan), hidrofobik (leusin, isoleusing dan

metionin) atau karboksilat (glutamat dan aspartat) (Al Janabi et al., 1972).

Perbedaan profil pemisahan protein gelatin pada SDS-PAGE setelah

dihidrolisis dapat terjadi karena urutan asam amino penyusun protein tidak

sama tergantung spesies asalnya (Gorgieva dan Kokol, 2011).

Pro Ser Gly Asp Lys Gly Asp Thr Gly Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Leu

Gln Gly Leu Pro Gly Thr Ser Gly Pro Pro Gly Glu Asn Gly Lys Pro Gly

Glu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gly Ile Pro Gly Gly Lys Asp

Ser Gly Ala Pro Gly Glu Arg Pro Pro Gly Ala Gly Gly Pro Pro Gly Pro Arg

Gly Gly Ala Gly Pro Pro Gly Pro Glu Gly Gly Lys Gly Ala Ala Gly Pro

Pro Gly Ser Ala Gly Thr Pro Gly Leu Gln Gli Met Pro Gly Glu Arg Gly

Gly Pro Gly Gly

A . Susunan asam amino kolagen babi

Gly Pro pro Gly Pro Gln Gly Leu Gln Gly Leu Pro Gly Thr Lys Gly Glu

Ala Gly Ala Pro Gly Ile Pro Gly Gly Lys Gly Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly

43


Ala Gly Ala Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Thr Pro Gly Leu Gly Gly Met

Pro Gly Glu Arg Gly

B. Susunan asam amino kolagen sapi

Gambar 10. Pemotongan pepsin. Keteranga (A) susunan asam amino rantai alfa 1 kolagen

babi, (B) susunan asam amino rantai alfa 1 kolagen babi (Bell et al, 2004).

Gambar 9 menunjukkan bagaimana terjadinya pemotongan terhadap

asam amino dengan panjang yang tidak sama. Hasil studi literatur

menunjukkan kemungkinan terjadinya pemotongan rantai polipeptida antara

leusin dan glutamin pada pH 4 sebesar 100% (palashoff, 2008). Pada situs ini

(leusin-glutamin) dari kolagen sapi dan babi akan terlihat jumlah asam amino

hasil pemotongan tidak sama jumlahnya sehingga panjang rantai polipeptida

yang dihasilkan akan berbeda antara protein gelatin sapi dan babi. Hal ini

akan mempengaruhi bobot molekul fragmen polipeptida yang dihasilkan.

Seperti pada gambar 10.

Gambar 11. Pita spesifik standar gelatin sapi dan babi. Keterangan gambar: 1 = Marker, 2 =

Standar Gelatin Sapi, 3 = Standar Gelatin Babi, 4 = Simulasi Cangkang Kapsul Gelatin Sapi, 5

21,78 21,78

20,65

45,92 45,92

27,67 27,67

20,65

10,35 10,35

2 4 3 5 1 6 7 8 9 10

44


= Simulasi Cangkang Kapsul Gelatin Babi, 6 = Sampel Pharmaton, 7 = Sampel Omepros, 8 =

Sampel Obipluz, 9 = Nature E, 10 = Standar gelatin sapi tanpa enzim.

Penentuan pita spesifik dari gelatin babi dan gelatin sapi penting

dilakukan karena hal ini menjadi pembanding sumber gelatin sampel. Pita

spesifik ditentukan dengan melihat perbedaan pola pemisahan dari kedua

gelatin. Kemudian dilihat pita yang muncul di salah satu gelatin tetapi tidak

muncul pada pemisahan gelatin lainnya. Pita-pita yang muncul pada kedua

jenis gelatin bukan pita spesifik. Pada penelitian ini diperoleh pita yang hanya

muncul pada gelatin babi pada bobot molekul 27,67 kDa, 20,65 kDa dan

10,35 kDa (gambar 9 kolom 2) dan pita yang timbul pada gelatin sapi pada

bobot molekul 45,92 kDa dan 21,78 kDa. Sedangkan pita yang muncul pada

kedua jenis gelatin 61,5 kDa dan 35,16 kDa.

Analisis terhadap pita pemisahan sampel gelatin cangkang kapsul

lunak dilakukan dengan membandingkan keberadaan pita-pita spesifik pada

masing-masing standar gelatin. Dari hasil perbandingan diperoleh pemisahan

protein gelatin sampel kolom 6 tidak terdapat pita spesifik gelatin babi dan

gelatin sapi. Kolom 7 menunjukkan pita spesifik sapi pada berat molekul

21,78 kDa. Sedangkan kolom 8 dan kolom 9 menunjukkan 2 pita spesifik

gelatin sapi yaitu pada bobot molekul 45,92 kDa dan 21,78 kDa. Dengan hasil

tersebut kolom 7,8 dan 9 memiliki pita spesifik gelatin sapi sehingga dapat

disimpulkan kapsul yang dibuat berasal dari gelatin sapi. Sedangkan kolom 6

tidak memiliki pita spesifik standar gelatin sapi dan gelatin babi.

Kemungkinan menggunakan sumber gelatin dari bahan lain seperti ikan.

Selain itu pada berat molekul 35,5 kDa muncul pita. Hal ini

menunjukkan adanya fragmen dari pepsin dimana pepsin memiliki berat

molekul 34,5 kDa. Perbedaan berat molekul ini dapat terjadi akibat dari tidak

stabilnya voltase arus listrik saat running gel atau konsentrasi gel yang

dipakai.

Dari hasil penelitian ini dapat SDS-PAGE dapat digunakan sebagai

metode untuk membedakan gelatin sapi dan gelatin babi. SDS-PAGE juga

dapat membedakan gelatin yang telah menjadi produk olahan seperti

45


cangkang kapsul lunak. Tetapi SDS-PAGE hanya dapat melakukan analisis

secara kualitatif.

46


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan

sebagai berikut:

1. SDS-PAGE dapat membedakan profil protein gelatin sapi dan babi setelah

dihidrolisis menggunakan enzim pepsin.

2. Enzim pepsin memberikan perbedaan karakteristik bobot molekul fragmen

kedua sumber gelatin.

3. Profil protein gelatin babi menunjukkan pita spesifik pada berat molekul

27,67 kDa, 20,65 kDa dan 10,35 kDa. Sedangkan untuk sapi 45,92 kDa dan

21,78 kDa.

4. Dengan membandingkan profil protein sampel dan standar berdasarkan

bobot molekul kolom 6 diduga bersumber dari selain kedua gelatin

pembanding, sedangkan kolom 7, 8 dan 9 adalah gelatin sapi.

5. Hasil ini bukanlah satu-satunya penentu sumber gelatin sampel yang diteliti.

Diperlukan penelitian lebih lanjut untuk memastikan dan menguatkan

informasi sumber gelatin yang digunakan. Berat molekul yang terbentuk

dapat digunakan sebagai informasi tambahan untuk penelitian produk

gelatin olahan khususnya cangkang kapsul gelatin lunak.

5.2 Saran

Perlu dilakukan analisis lebih lanjut pada pita-pita hasil pemisahan

SDS-PAGE dengan menggunakan LCMS sehingga dapat diketahui urutan

asam amino pada masing-masing pita tersebut.

47


DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., Johnson, J., Lewis, M., Raff, K., Roberts, & Walier P. 2002. Molecular

Biology of The Cell. Gardland science. New York: xxxiv + 1463 hlm.

Anonim. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi IV. Departemen Kesehatan Republik

Indonesia. Jakarta: Ditjen POM 404.

Al-Janabi, J., J. A. Hartsuck, et al. 1972. ‘Kinetics and mechanism of pepsinogen

activation.’ J Biol Chem 247:4628-32.

Ansel, Howard C. 2005. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi Ed 4th. UI PRESS:

Jakarta.

Azira, T., Amin. I., and Che Man, Y. B., 2012. Differentiation of bovine and porcine

gelatins in processed products via Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide

Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and principal component analysis (PCA)

techniques. International Food Research Journal 19 (3): 1175-1180 (2012).

Bell et al., 2004. Porchine Collagens and Gelatins. Uniter States Patent

Applicatioon Publication. Pub. No.: US 2004/005663 A1.

Bintang, Maria. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga

Bhatt, Bhawna, dan Agrawal, S.S. 2007. Pharmaceutical Technology Capsules.

Delhi Institute of Pharmaceutical Science and Research.

Burden, David W & Whitney, Donald W. 1958. Biotechnology: Protein to PCR: A

Course in Strategies and Lab Techniques. Boston: Birkhauser.

Carr, J. M., K. Sufferling, & J. Poppe. 1995. Hydrocolloids and their use in the

confectionery industry. Journal of Food Techniques. Boston: Birkhauser.

Cole, C. B. 2002. The Occurence of Dark Coloured Gelatin, In Occurence,

Measurement and Origins of Gelatine Colour as Determined by Fluoresence

and Electhrophoresis. South Africa: Thesis University of Petroria.

Departemen Agama RI. 2008. Al-Quran dan Terjemahnya. Cahaya Qur’an: Depok.

Doi, H., Watanabe, E., Shibata, H., Tanabe, S. A reliable enzyme linked

immunosorbent assay for the determination of bovine and porcine gelatin in

processed foods. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2009. 57:

1721-6.

Fatchiyah, Laras, Esti Arumningtyas, Widyarti, Sri dan Rahayu, Sri. 2011. Biologi

Molekular Prinsip Dasar Analisis. Erlangga, Jakarta.

FAO. 2009. FAOSTAT statistic database. Rome (available at faosfat.fao.org)

48


Gadri , A. dan Ega Priani, S. 2012. Stabilitas Kadar dan Laju Disolusi Ketoprofen

Dalam Sediaan Kapsul Gelatin dan HPMC-Karagenan. Prosiding SnaPP

2012, Sains, Teknologo dan Kesehatan.

GMIA, 2012. Gelatin Handbook, USA: Gelatin Manufacturers Institute of

America.

Gorgieva, S., Kokol, V. 2011. Collagen- vs Gelatine-Based Biomaterials and their

Biocompatibility. Review and Perspectives, Biomaterials-Applications forr

Nanomedicine, Prof. Rosario Pignatello (Ed.), ISBN: 978-953-307-661-4.

Grobben A.H., Steele P.J., Somerville R.A., Taylor D.M. 2004. Inactivation of the

ovine-spongiform-encephalopathy (BSE) agent by the acid and alkali

processes used the manufacture of bone gelatin. Biotechnology and Applied

Biochemistry 39:329-338.

Hammes, B.D. 1998. Electhrophoresis of Protein. Oxford University Press. New

York.

Hana, Abu. 2009. Gelatin Halal dan Gelatin Haram. http//republika.co.id/infohalal.

(6 Mei 2014 pukul 01.55).

Hardi, Y. R. 2010. Struktur Molekul Protein. http://sciencebiotech.net/struktur-

molekul-protein/ (6 Mei 2014, pukul 01.51 WIB).

Hashim, D. M., Che Man, Y. B., Norakasha, R., Shuhaimi, M., Salmah, Y. and

Syahariza, Z. A. 2010. Potential use of Fourier transform infrared

spectroscopy for differentiation of bovine and porcine gelatins. Food

Chemistry 118: 856 - 860.

Hardi, Yepi, R. 2010. Struktur Molekul Protein. http://sciencebiotech.net/struktur-

molekul-protein/ (06 Mei 2014, Pukul 04.00 WIB)

Hermanto, S. dan Ode L. S. 2013. Differentiation of Bovine and Prochine Gelatin

Based on Spectroscopic and Electrophoretic Analysis. Journal of Food and

Pharmaceutical Science 1 (2013) 68-73.

Hermanto, S. Dhien, C. K. Mentia. 2009. Perbedaan Profil Protein Produk Olahan

(Sosis) Daging Babi dan Sapi Hasil Analisa SDS-PAGE. UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

Hidaka, S. dan S. Y. Liu. 2003. Effect of Gelatins on Calcium Phosphate

Precipitation: A Possible Application for distinguishing Bovine Bone Gelain,

J. Food Compos. Anal., 16, 477-483.

Jamaludin, M.A., Zaki, N.N.M. Ramli, M.A., Hasim, D.M. dan Ab. Rahman, S.

2011. Istihalah: Analysis on The Utilization of Gelatie in Food Products 2011

2nd International Conference on Humanities, Historical and Social Science

IPEDR vol. 17. Singapore: IACSIT Press.

Jannah, Akhyunul. 2008. Tinjauan Kehalalan dan Alternatif Produksi. UIN Malang

Press, Malang.

http://sciencebiotech.net/struktur-molekul-protein/




49


Mahasri, G., Fajriah, U. Dan Subekti, S., 2010. Characterization of Protein

Lernaea cyprinacea by Using SDS-PAGE Electrophoresis Method. Jurnal

Ilmiah Perikanan dan Kelautan Vol. 2, No. 1.

Mannucci, PM, Mannucci, Pier Mannuccio. 1998. Hemostatic Drugs. N. Eng. J.

Med. 339 (4): 245-53.

Martoharsono, Soeharsono. 2006. Biokimia. Yogyakarta: Gajah Mada University

Press.

Mohd, R. H., N. R., C. Y. M., Amin, I., & A. Noorfaizan. 2011. Chemical and

Functional Properties of Bovine and Porcine Skin Gelatine. International

Food Research Journal 18: 813-817.

Murray R. K, et al. 2000. Biokimia Harper Edisi 25. Jakarta: Penerbit buku

kedokteran EGC.

Nemati, M., Oveisi, M. R., Abdollahi, H. and Sabzevari, O. 2004. Differentiation

of bovine and porcine gelatins using principal component analysis. Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis 34: 485-492.

Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Penerbit Universitas

Indonesia (UI-Press).

Reich, G. 2001. Formulation and physical properties of soft capsules Chapter 11.

Deutsche Lederinstitute, Frieberg/SA

Rybicky, E., dan Purves, M. (n.d.). SDS Polyacrilamide Gel Elektrophoresis (SDS-

PAGE).http://www.mcb.utc.ac.za/Mannual/sdspage.html (06 Mei 2014,

pukul 03.00 WIB)

Riaz, M.N. dan M.M. Chaudry. 2004. Halal food production. CRC Press, USA.

Schrieber, R. & Gareis, H. 2007. Gelatine Handbook : Theory dan Industrial

Practice. Jerman: Wiley VCH Verlag GmbH dan Co. KgaA

Sudarmadji, S., Haryono, B., Suhardi. 1996. Analisa Bahan Makanan dan

Pertanian. Yogyakarta: Penerbit Liberty.

Venien, A & Levieux, D. 2005. Differentiation of Bovine from Porcine Gelatines

Using Polyclonal Anti-peptide Antibodies in Indirect and Competitive

Indirect ELISA. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 39

(2005) 418-424.

Veis, A. 1964. The Macromolekul Chemistry of Gelatin. New York and London:

Academic Press.

Widyaninggar, A., Triwahyudi, Triyana, K., dan Rohman, A. 2012. Differentiation

Between Porcine and Bovine Gelatin in Commercial Capsule Shells Based

on Amino Acid Profiles and Principal Component Analysis. Indonesian J.

Pharm. Vol. 23 No. 2: 96-101.

50


Zhang, G., Liu, T., Wang Q., Chen, L., Lei, J., Luo, J., Ma, G., & Su, Z. 2008. Food

Hydrocolloids. Journal homepage: www.elsevier.com/locate/foodhyd (6 Mei

2014 pukul 02.00 WIB).

http://www.elsevier.com/locate/foodhyd%20(6

51


LAMPIRAN

ALUR PENELITIAN

Lampiran 1

Staining dan destaining gel

setelah proses elektroforesis

Analisis pola pmisahan protein

Loading 10µl gelatin kedalam

sumuran gel

Running gel elektroforesis 40 mA

pada tegangan 150 volt (60

menit)

Sampel Kapsul

Lunak

Ekstraksi Gelatin

Simulasi Gelatin

Cangkang Kapsul Lunak

Konsentrasi gel stacking 4%

resolving 12%

Standar Gelatin Sapi

dan Gelatin Babi

Hidrolisis Dengan Pepsin pada pH

4,5 dan Inkubasi pada suhu 60°C

selama 1 jam

Centrifuge 3 menit, preparasi

endapan untuk dielektroforesis

Preparasi gel elektroforesis

Analisis pola pmisahan protein

Pembahasan dan Kesimpulan

52


Lampiran 2

Seperangkat alat elektroforesis

Pengeluaran isi cangkang kapsul lunak

Penimbangan cangkang kapsul kosong

Ekstraksi sampel

Pemanasan sampel sebelum

dieketroforesis

Pembuatan gel

53


Loading sampel

Elektroforesis

Staining

Staining semalaman menggunakan

shaker

Destaining

Gel hasil elektrofroresis

54


Lampiran 3

Preparasi Reagent SDS-PAGE

a. Larutan Stok Acrylamide/ Bis (30%%T;2,67%C)

29,2 g akrilamide dilarutkan dalam 100 ml air deionisasi, kemudian

ditambahkan 0,8 ml N’N’ –bis-methylene-acrylamide ke dalam larutan

aduk hingga larut dengan stirer, kemudian larutan disaring dan disimpan

pada suhu 4°C ditempat yang terhindar dari cahaya.

b. SDS 10% (w/v)

10 g SDS dilaritkan dalam 90 ml air deionisasi diaduk dengan hati-hati

kemudia pH disesuaikan hingga 8,8 dengan penambahan 6 N HCL.

Kemudian air deionisasi ditambahkan pada larutan hingga 100 ml, larutan

disimpan pada suhu 4°C.

c. Resolving Buffer: 1,5 M Tris-HCl;pH 8,8

18, g Basa Tris dilarutkan dalam 60 ml air deionisasi diaduk dengan hati-

hati kemudian pH disesuaikan hingga 8,8 dengan penambahan 6 N HCl.

Kemudian ditambahkan air deionisasi hingga 100 ml larutan disimpan pada

suhu 4°C.

d. Stacking Buffer: 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8

Ditimbang sebanyak 6 g tris dilarutkan dalam 60 ml air deionisasi. Atur pH

6,8 dengan 6N HCl, kemudian tambahkan air deionisasi hingga total

volumenya 100 ml. Simpan pada suhu 4°C.

e. Sample Buffer

Sampel buffer dibuat dengan cara mencampurkan 3,5ml air deionisasi, 1,25

ml stacking buffer, 2,5 ml gliserol, 2 ml SDS 10% dan 0,2 ml 0,5% (w/v)

bromophenol blue. Total larutan 9,5 ml disimpan pada suhu ruang.

f. Running Buffer

Basa tris ditimbang sebanyak 30,3 gram, kemudian ditambahkan 144 gram

glisisn dan 10 gram SDS. Dilarutkan dalam 100 ml air deionisasi, larutan

diaduk kemudian ditambahkan air deionisasi hingga volume total 1000 ml.

Larutan disimpan pada suhu 4°C.

g. 10% APS (disiapkan ketika akan digunakan)

55


APS ditimbang sebanyak 100 mg kemudian dilarutkan dalamP 1 ml air

deionisasi.

ANALISA PROFIL PROTEIN GELATIN BABI DAN … · lunak gelatin sapi, cangkang kapsul lunak Pharmaton,...

Documents

Transcript of ANALISA PROFIL PROTEIN GELATIN BABI DAN … · lunak gelatin sapi, cangkang kapsul lunak Pharmaton,...