58

Aktivitas Protease Dari Bacillus circulansPada Media Pertumbuhan Dengan pH Tidak Terkontrol

La Ode SumarlinProgram Studi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi

UIN Syarif Hidayatullah Jakartaemail : Lamarid@yahoo.com

Abstrak

Salah satu enzim yang telah banyak dipelajari adalah enzim protease. Jenis enzim inimerupakan enzim yang penting dari segi ekonomi karena menguasai 59% dari total penjualanenzim di dunia. Aplikasi protese telah meluas, baik pada industri pangan maupun nonpangan.Industri pangan memanfaatkan protease untuk memperbaiki tekstur, mempersingkat waktupencampuran, dan meningkatkan volume adonan pada pembuatan roti, menjernihkan bir,mengempukkan daging, dan menggumpalkan susu. Enzim ini dapat dproduksi oleh mikrobadalam suatu media mengandung Air Rendaman Kedelai (ARK) dengan pH tidak terkontrol.Pengukuran aktivitas enzim menggunakan metode Bergmeyer dan Grassl sedangkan kadarprotein ditentukan dengan metode Bradford. Hasil analisis menunjukkan bahwa AktivitasProtease (AP) pada media Air Rendaman Kedelai dan media standar dengan pH tidakterkontrol masing-masing sebesar 0,1814 U/ml dan 0,0342 U/ml. Produksi protease pada mediatersebut optimum pada pH 9,28, jam ke-56 pada fase akhir eksponensial dari fase pertumbuhanmikroba.

Kata Kunci : pH optimum, Bacillus circulans, protease, ARK

Abstract

Protease was one of enzymes which had been a lot of studied. This enzyme has an importanteconomical aspect where over then 59% of total selling enzymes in the world was occupatiedby protease. Aplication of protease have been extended in food industry as well as of non food industry.In food industrial enginering, protease had been used for repair texture, shorten time interference andincrease volume batter at production bread, make bir clear, soften meat and make milk coagulate. Thisenzyme can be producted by microba in “water soaking soybean” (WSS) with uncontroled pH. Theactivity of enzyme had been measured by using Bergmeyer and Grassl methods while the protein contentwas measured by Bradford method. The activity of protease (AP) in WSS and standard medium withuncontroled pH where found to be 0,1814 U/ml and 0,0342 U/ml respectively. The production ofprotease at the above mentioned medium was achieved optimum at pH 9.28, and 56th hours in the end oflogaritmic phase of microba.

Keywords : Bacillus circulans, protease, WSS

1. PENDAHULUAN

Perkembangan ilmu bioteknologi telahmenempatkan penggunaan enzim sebagai salahsatu alternatif untuk berbagai keperluanmisalnya di bidang industri, pengobatan, dananalisis. Keuntungan penggunaan enzim antaralain : (1) enzim merupakan bahan alami yangtidak beracun, (2) enzim dapat mempercepatreaksi tanpa menyebabkan terbentuknya hasilreaksi yang tidak diinginkan, (3) enzim aktif

pada konsentrasi rendah, (4) kecepatan reaksienzim dapat diatur dengan mengatur suhu, pH,dan jumlah enzim yang digunakan, (5) enzimdapat diinaktifkan jika reaksi yang diinginkansudah diperoleh, (6) enzim merupakansenyawa alamiah yang ramah lingkungan(Suhartono, 1993). Enzim juga masihmempunyai kemampuan transformasi kimiameskipun telah terpisah dari sel (Bakhtiar, A1991).

59

Salah satu enzim yang telah banyakdipelajari adalah enzim protease. Jenis enzimini merupakan enzim yang penting dari segiekonomi karena menguasai 59% dari totalpenjualan enzim di dunia (Suhartono, 1993).Aplikasi protese telah meluas, baik padaindustri pangan maupun nonpangan. Industripangan memanfaatkan protease untukmemperbaiki tekstur, mempersingkat waktupencamuran, dan meningkatkan volumeadonan pada pembuatan roti, menjernihkanbir, mengempukkan daging, danmenggumpalkan susu. Protease pada industrinon pangan digunakan antara lain dalambidang kesehatan, fotografi, industri detergen,dan industri kulit.

Enzim ini dapat dihasilkan olehtanaman, hewan, dan mikroba. Protease yangdihasilkan oleh mikroba sangat potensial untukdigunakan karena sumbernya yang berlimpah,produksi enzim yang cepat, biaya produksirelatif murah, dan mudah dikontrol.

Enzim mempunyai aktivitas maksimumpada kisaran pH yang disebut pH optimum,yang umumnya antara pH 4,5 sampai 8.0.Suatu enzim tertentu mempunyai kisaran pHyang sempit. Disekitar pH optimum enzimmempunyai stabilitas yang tinggi. Stabilitasenzim terhadap panas berhubungan eratdengan stabilitasnya terhadap pH, seringstabilitas terhadap panas tidak pada pHisoelektrik dari enzim. Bila pH di bawah ataudi atas pH optimum, semakin jauh dari pHoptimum maka enzim semakin tidak stabil dansemakin tinggi suhu maka stabilitasnyasemakin menurun.

Pada penelitian ini telah diidentifikasimikroba yang memproduksi protease dalamjumlah banyak, yaitu Bacillus circulans.Mikroba tersebut diisolasi dalam limbah padatkecap. Pemurnian dilakukan untukmemisahkan enzim tertentu dari ekstrak kasaryang masih mengandung sel mikroba dankomponen lainnya.

Penelitian selanjutnya adalahmempelajari aktivitas protease Air RendamanKedelai pada pH yang tidak terkontrol dariBacillus circulans. Melalui penelitian inidiharapkan akan memberikan informasimengenai pH optimum enzim protease dariBacillus circulans.

2. METODE PENELITIAN

Bahan dan Alat

Air Rendaman Kedelai (ARK)digunakan sebagai media untuk pertumbuhanmikroba penghasil protease. Bahan penunjanglainnya adalah Natrium hidroksida, bufferborat, kalsium klorida, asam klorida, TCA(Tricloroacetic Acid), natrium karbonat,reagen folin ciocalteau, larutan enzim, isolatbakteri (Bacillus circulans), coomassiebriliant blue G-250, etanol, asam sulfat,Bovine Serum Albumin (BSA), dan ammoniumsulfat.

Alat yang digunakan adalah alat-alatgelas, pH meter, sentrifusa, spektrofotometerUV-Vis Hitachi, inkubator, dan fermentor.

Produksi Enzim

Isolat bakteri ditumbuhkan pada mediaagar miring dengan komposisi sebagai berikut: malt extract 3 gr, pepton 5 gr, agar 15 gr, danaquades 1 liter selama 3 hari. Sebanyak 2 oseinukulum dipindahkan ke dalam media cairdan ditumbuhkan selama 1 hari. Produksienzim dilakukan dalam fermentor (kapasitas 3liter) dengan volume media satu liter.Penelitian dilakukan dengan perlakuan pHtidak terkontrol. Sebagai pembandingdigunakan media dengan komposisi tertentu(media standar) yang mengandung KH2PO4 3gr/l, Na2PO4.12H2O 15 gr/l, MgSO4.7H2O 0,2gr/l, NaCl 0,5 gr/l, NH4Cl 0,1 gr/l, NaNO3 1gr/l, glukosa 1 gr/l, kasein 10 gr/l, dan ekstrakkhamir 0,5 gr/l. pH media diatur menjadi 10.

Tingkat pertumbuhan dan fluktuasiaktivitas protease (AP) ditetapkan dengancara pengambilan contoh (sampling)dilakukan setiap 8 jam selama 80 jam.Kemudian diukur Optical Density (OD) padapanjang gelombang 620 nm. Kondisipertumbuhan yang optimal bagi produksiprotease dari B. circulans akan digunakanuntuk produksi enzim pada tahap selanjutnya.

Analisis Kadar Protein Metode Bradford

Sebanyak 0,1 ml larutan enzimditambahkan ke dalam 5 ml larutan Bardford.Kemudian didiamkan selama 5 menit padasuhu ruang dan diukur absorbansnya padapanjang gelombang 595 nm denganspektrofotometer Uv-Vis.

Kurva standar (Konsentrasi BSA vsAbsorbans) dibuat menggunakan BSA dengan

konsentrasi 0-100 ppm. Standar diperlakukanseperti sampel, tetapi tanpa menggunakanenzim. Kadar protein sampel (mg/ml)

diperoleh dari perrsamaan regresi kurvastandar.

Tabel 1. Metode Analisis aktivitas protease Metode Bergmeyer & Grassl

Pengukuran aktivitas protease

Pengukuran aktivitas protease inimenggunakan metode Bergmeyer & Grassl1983. Prinsip kerja dari metode ini yaitukasein yang berfungsi sebagai substrat akandihidrolisis oleh protease dengan bantuan airmenjadi peptida dan asam amino.

Kasein peptida + asama amino

Lajuamino terseaktivitas katyang terbenyang tidak tini dilakukPenambahanproduk yanamino akanprotein yamengendap.menginaktifamino tirosiTCA akanmenghasilkaNa2CO3 besekitar 11,5untuk inten1981). W

absorbansnya pada daerah sinar tampak 578nm dengan alat spektrofotometer Uv-Vis.Besarnya serapan berbanding lurus dengankonsentrasi protein yang terhidrolisis.Aktivitas protease dihitung berdasarkanpersamaan :

UA =T

xPxAoAs

AoA 11

Bufer Borat 0Bufer kaseinHCl (0,05 M)Larutan enzimAkuadesTirosin (5 mMInkubasi selamTCA (0,1 M)CaCl2 (2 mMLarutan EnzimInkubasi selamenitSupernatanNa2CO3 (0,4Reagen FolinInkubasi selama 20 menit pada suhu 35oC, kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm

protease

pebualtuerhan

g

nP

kan

bnrt

sitar

Pereaksi Sampel (ml) Blanko (ml) Standar (ml),2 M pH 8.0 1.00 1.00 1.00(2%b/v) 1.00 1.00 1.00

0.20 0.20 0.200.20 - -

- 0.20 -) - - 0.20a 10 menit pada suhu 35oC

2.00 2.00 2.00) 0.20 - -

- 0.20 0.20ma 10 menit pada suhu 35oC dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada 4000 rpm selama 10

1.50 1.50 1.50M) 5.00 5.00 5.00(1 : 2) 1.00 1.00 1.00

60

mbentukan peptida dan asamt dapat dijadikan tolak ukur

isis protease. Asam-asam aminok harus dipisahkan dari substratidrolisis. Umumnya pemisahan

dengan penambahan TCA.TCA tersebut menyebabkan

mengandung peptida dan asamlarut dalam TCA, sedangkang tidak terhidrolisis akanenambahan TCA ini sekaligusn enzim protease. Asam-asamdan triptophan yang larut dalamereaksi dengan reagen folin

warna biru. Penambahanujuan untuk medapatkan pHyang merupakan pH optimumas dan stabilitas warna (Novo,na yang terbentuk diukur

Keterangan :

UA : Unit aktivitas (U/ml/menit)

A1 : Absorbansi sampel

A0 : Absorbansi blanko

As : Absorbansi standar

T : Lama inkubasi

P : Faktor pengenceran

Secara kuantitatif kemurnian ditentukanberdasarkan aktivitas spesifik (U/mg) yaituperbandingan antara Unit aktivitas (U/ml) dankadar protein (mg/ml)

3. HASIL DAN PEMBAHASAN

Produksi enzim

61

Berdasarkan hasil analisis, AktivitasProtease (AP) pada media Air RendamanKedelai dan media standar dengan pH tidakterkontrol masing-masing sebesar 0,1814 U/mldan 0,0342 U/ml.

Keadaan ini menunjukkan bahwa mediaair rendaman kedelai lebih baik daripadamedia standar untuk menghasilkan protease.Tingginya aktivitas protease tersebutdisebabkan kandungan protein yang cukuptinggi pada kedelai sebagai sumber nitrogenbagi mikroorganisme.

Pada awal produksi enzim, pH mediacenderung mengalami penurunan karenaterjadi proses pemecahan karbohidrat menjadiasam-asam organik. Kemudian mengalamikenaikan yang disebabkan oleh media yangtertutup oleh amoniak yang terbentuk daripemecahan senyawa-senyawa yangmengandung nitrogen (Gambar 1).

Gambar 1. Nilai pH pada berbagai waktu inkubasi

Hasil analisis pada perlakuan dengan pHmedia tidak terkontrol pada media airrendaman kedelai menunjukkan aktivitasprotease tertinggi pada pH 9,28, jam ke-56sebesar 0,1814 U/ml. Bila dihubungkan denganfase pertumbuhan mikroba, maka aktivitastertinggi tersebut terdapat pada akhir faseeksponensial (Gambar 2).

Hal ini sejalan dengan yangdikemukakan oleh Ward (1983), bahwapembentukan enzim protease mulai meningkatselama memasuki fase eksponensial, kemudianmeningkat dengan cepat memasuki stasioner.Dalam keadaan normal sintesis enzimekstraseluler maksimum terjadi sebelum fasestasioner atau akhir fase eksponensialmenjelang fase stasioner (Schaefer, 1969).

Tingginya produksi enzim pada faseeksponensial ini diduga berhubungan dengan

proses sporulasi yang cepat dan mengalamipenurunan sejalan dengan menurunnya prosessporulasi. Produsi enzim sejajar dengan kurvapertumbuhan dan mencapai optimal pada akhirfase eksponensial (Kumalaningsih, 1989).

Gambar 2. Aktivitas Protease (AP) dalam mediaair rendaman kedelai dengan pH tidak terkontrolpada berbagai fase pertumbuhan mikroba (OD)

Penelitian oleh Bernlohr (1964), jugamenunjukkan kultur yang mempunyai efisiensisporulasi yang tinggi akan diimbangi denganaktivitas protease yang tinggi. Dalampenelitian ini digunakan media standar sebagaipembanding yang ternyata mempunyaikecenderungan yang sama, yaitu aktivitasoptimum pada fase eksponensial (Gambar 3).

Umumnya setelah fase stasioneraktivitas enzim menurun. Hal ini disebabkan

oleh adanya hasil-hasil metabolisme yangdapat menghambat aktivitas enzim. Rendahnya

5.00

6.50

8.00

9.50

11.00

0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80

Waktu Inkubasi (jam)

pH

ARK Standar

0.0000

0.2000

0.4000

0.6000

0.8000

1.0000

1.2000

1.4000

1.6000

1.8000

0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80

Waktu Inkubasi (jam)

OD

62

0nm

0.0000

0.0050

0.0100

0.0150

0.0200

0.0250

0.0300

0.0350

0.0400

Un

itA

ktivitas

(U/m

l)

OD

AP

Gambar 3.Aktivitas Protease (AP) dalam mediastandar dengan pH tidak terkontrol pada berbagaifase pertumbuhan mikroba (OD)

0.0000

0.2000

0.4000

0.6000

0.8000

1.0000

1.2000

1.4000

1.6000

0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80

Waktu Inkubasi (jam)

OD

620

nm

0.0000

0.0200

0.0400

0.0600

0.0800

0.1000

0.1200

0.1400

0.1600

0.1800

0.2000

Unit

Aktivitas

(U/m

l)

OD

AP

62

aktivitas enzim dapat disebabkan oleh kadargaram, pH, dan substrat. Di samping itu,penurunan aktivitas berkaitan dengan kegiatnsaling mnghiddrolisis di antara protease padasaat ubstrat sudah mulai berkurang karenaprotease juga merupakan suatu protein(Suhartono, M.T., 1988).

4. KESIMPULAN

Penggunaan media air rendaman kedelaidengan pH 9,8 untuk produksi protease dariBacillus circulans memberikan aktivitasprotease yang tinggi sebesar 0,1814 U/ml.

Produksi protease pada media tersebutoptimum pada jam ke-56, kondisi inibertepatan dengan akhir fase logaritmik darifase pertumbuhan mikroba.

DAFTAR PUSTAKA

1. Bakhtiar, A., (1991), Usaha ProduksiEnzim Protease Dari Bacillus SubtilisATCC 6633 Menggunakan mediaProduksi Limbah Tetes, LaporanPenelitian, Universitas Airlangga,Surabaya.

2. Bergmeyer, H.V. dan Grassl, (1983),Method of Enzymatic Analisis 2. VerlagChemia, Weinhein.

3. Bernlohr, R.W., (1964),Postlogarithmic phase metabolism ofsporulating microorganism protease of

Bacilus licheniformis. Biol. Chem. 239 :538.

4. Bradford, M.M., (1976), A rapid andsensitive method for the quantitation ofmicrogram quntities of protein utilizingthe principle of protein-Dye binding.Anal. Biochem. 72; 248-254

5. Foisy, H., (1978), Some Properties ofAminopeprtidase from Brevibacteriumlinens F.E.M.S. Microbiology Letters 3 :207 – 210.

6. Kumalaningsih, S., (1989), Isolasi danpemurnian Enzim Proteolitik dari bakterihalofilik moderat. Jawa Pos, Surabaya.

7. Novo, (1981), Novo’s Handbook ofPractical biotechnology, Novo, Denmark,

8. Schaefer, (1969), Sporulation and theproduction of antibiotics, exoenzyme,and exotoxins. Bacteriol. Rev. 33: 48-71.

9. Suhartono, M.T., (1988), Enzim danbioteknologi, Pusat Antar Universitas,IPB, Bogor.

10. Suhartono, M.T., (1993), Telaahformulasi aditif di dalam peningkatandaya simpan protease Bacillus sp.,Laporan Penelitian Fateta, IPB.

11. Ward, O.P., (1983), Properties ofmicrobial peroteinase. Di dalam W.Fogarty (ed). Microbial Enzymes andBiotechnology. Applied SciencePublishing, London.