AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA...

8/18/2019 AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL…

1/125

i

i

AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquil lari a microcarpa

Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL, GLIKOGEN

HATI DAN HISTOPATOLOGI PANKREAS TIKUS PUTIH YANG

DIINDUKSI ALOKSAN

SKRIPSI

untuk memenuhi persyaratandalam menyelesaikan program sarjana Strata – 1 Farmasi

Oleh :

Ranty Rirung Andrunganyan

NIM. J1E111030

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT

BANJARBARU

AGUSTUS 2015


2/125

ii

ii


3/125

iii

iii


4/125

iv

iv

ABSTRAK

AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU ( Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA ORAL, GLIKOGEN HATI

DAN HISTOPATOLOGI PANKREAS TIKUS PUTIH YANG DIINDUKSI

ALOKSAN

(Ranty Rirung Andrunganyan; Pembimbing : Nurlely, Fadlilaturrahmah; 2015; 68

halaman)

Daun gaharu ( Aquilaria microcarpa Baill.) secara empiris digunakan sebagai

penurun kadar glukosa darah. Penelitian ini bertujuan mengetahui pengaruh

pemberian ekstrak etanol daun gaharu (EEDG) terhadap penurunan kadar glukosa

darah pada tes toleransi glukosa oral (TTGO), peningkatan glikogen hati dan peningkatan jumlah pulau langerhans tikus yang dibuat diabetes serta menentukan

dosis efektif dari EEDG. Penelitian menggunakan 24 ekor tikus jantan galur Wistar,

dibagi menjadi 6 kelompok yaitu kelompok kontrol normal, kontrol negatif, kontrol

positif (glibenklamid 5 mg/kgBB), serta kelompok EEDG dengan dosis 50, 100 dan

200 mg/kgBB. Semua kelompok kecuali kelompok normal diinduksi aloksan 150

mg/kgBB, sedangkan kelompok normal diinduksi NaCl 0,9%. Hari ke-3 setelah

induksi diperiksa kadar glukosa darah pada hewan uji. Perlakuan dilakukan selama

28 hari setelah pemeriksaan gula darah paska induksi. Hari ke-23 seluruh kelompok

dilakukan TTGO dengan memberikan glukosa 2 g/kgBB. Hari ke-28 dilakukan

pengambilan organ pankreas dan hati melalui pembedahan. Organ hati dianalisis

dengan spektrofotometri UV-Vis untuk melihat kadar glikogennya dan pada organ pankreas dihitung jumlah pulau langerhans. Hasil penelitian menunjukkan EEDG

mampu menurunkan kadar glukosa darah pada TTGO, meningkatkan kadar glikogen

hati, dan meningkatkan jumlah pulau Langerhans. Oleh karena itu dapat dinyatakan

bahwa dosis EEDG yang efektif adalah 50 mg/kgBB.

Kata kunci : Aquilaria microcarpa Baill., Aloksan, TTGO, Glikogen hati, Jumlah

Pulau Langerhans.


5/125

v

v

ABSTRACT

THE ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT OF AGARWOOD LEAF (Aquilariamicrocarpa Baill.) TO ORAL GLUCOSE TOLERANCE TEST, LIVER GLYCOGEN

AND PANCREAS HISTOPHATOLOGY OF WHITE MICE INDUCTED WITH

ALLOXAN

(Ranty Rirung Andrunganyan; Advisors: Nurlely, Fadlilaturrahmah; 2015; 68

pages)

Agarwood leaves (Aquilaria microcarpa Baill.) empirically used as a reducer of

blood glucose level. This study aimed to identify the effect of ethanol extract of

agarwood leaf (EEAL) giving to the reducing of blood glucose level on tolerance test

of oral glucose, the increasing of liver glycogen, as will as number of islet of the pancreas diabetic rats and to determine the effective dose of EEAL. This study used

24 male Wistar mice, divided into 6 groups: normal control, negative control,

positive control (glibenclamide 5 mg/kgBB), group of EEAL (doses of 50, 100, and

200 mg/kgBB). All groups except normal group induced with alloxan 150 mg / kg,

while the normal group induced with 0.9% NaCl. The third day after the induction

blood glucose level was examined in the tested animals. Treatment was carried out

during the 28 days after the post-induction checks of blood glucose. On the twenty-

third day the entire group performed oral glucose tolerance test by giving glucose 2

g / kg. On the twenty-eighth day it was done the taking of pancreas and liver organ

through surgery. The liver was analyzed with UV-Vis spectrophotometry to see its

glycogen level and in pancreas organ it was calculated the number of islet of the

pancreas. The study result showed that EEAL was able to reduce blood glucose level

on oral glucose tolerance test, increase glycogen level of liver, and increase number

of islet of the pancreas. Therefore, it can be stated that the effective dose of EEAL is

50 mg/kgBB.

Keywords: Aquilaria microcarpa Baill. , alloxan, OGTT, Liver glycogen, Number of

islet


6/125

vi

vi

PRAKATA

Puji dan syukur tidak henti-hentinya penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang

Maha Esa atas segala anugrah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian

yang berjudul “Aktivitas Ekstrak Etanol Daun Gaharu ( Aquillaria microcarpa Baill.)

Terhadap Tes Toleransi Glukosa Oral, Glikogen Hati dan Histopatologi Pankreas

Tikus Putih yang Diinduksi Aloksan”.

Penulis dalam kesempatan ini mengucapkan terima kasih atas segala bantuan

dan dukungan kepada:

1. Kedua orangtua yang tidak henti-hentinya memberikan nasehat, motivasi,dukungan moril dan materil baik dalam proses perkuliahan ataupun dalam proses

penyelesaian skripsi.

2. Ibu Nurlely, S. Farm., M.Sc (Pharm)., Apt. selaku dosen pembimbing utama dan

Ibu Fadlilaturrahmah, S. Farm., M.Sc., Apt. selaku dosen pembimbing

pendamping yang telah banyak memberikan bimbingan, nasehat dan motivasi

selama penulisan proposal hingga skripsi.

3. Ibu Difa Intannia, S.Farm., M.Farm-Klin., Apt., Ibu Destria Indah Sari, M.Farm.,

Apt dan Bapak Muhammad Ikhwan Rizki, S.Farm, M.Sc., Apt., selaku tim

penguji. Terima kasih atas kritik, saran dan masukan yang telah diberikan selama

penulisan proposal hingga skripsi.

4. Ibu Nani Kartinah, S.Farm., M.Sc., Apt selaku dosen pembimbing akademik

yang telah banyak memberikan bimbingan, nasehat dan motivasi selama proses

perkuliahan yang sudah dijalani.

5. Dwi Juni Saputra yang selalu mendampingi, memberi semangat dan motivasi

selama proses penyelesaian skripsi.

6. Teman-teman angkatan 2011, khususnya Cha-cha, Nada, Nisa, Tiara, Windi dan

Yuni yang mendukung, menemani selama perkuliahan dan proses penyelesaian

skripsi.

7. Semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu baik secara langsung

maupun tidak langsung ikut membantu jalannya penyusunan skripsi ini. Penulis


7/125

vii

vii

menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan skripsi ini, namun penulis

berharap semoga skripsi ini dapat berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Banjarbaru, Agustus 2015

Penulis


8/125

viii

viii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .................................................................................

LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................

PERNYATAAN ........................................................................................

ABSTRAK ................................................................................................

ABSTRACT ..............................................................................................

PRAKATA ................................................................................................

DAFTAR ISI .............................................................................................

DAFTAR TABEL .....................................................................................

DAFTAR GRAFIK ...................................................................................

DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................

BAB I. PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang .............................................................................

1.2. Perumusan Masalah ......................................................................

1.3. Tujuan Penelitian ..........................................................................1.4. Manfaat Penelitian ........................................................................

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Gaharu ...........................................................................................

2.1.1 Morfologi .............................................................................

2.1.2 Kandungan Kimia ................................................................

2.1.3 Kegunaan Tumbuhan Gaharu ..............................................

2.2 Diabetes Melitus ............................................................................

2.3 Ekstraksi ........................................................................................

2.4 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ...................................................

2.5 Spektro UV-Vis .............................................................................

2.6 Aloksan ..........................................................................................

2.7 Parameter .......................................................................................

i

ii

iii

iv

v

vi

viii

xi

xii

xiii

1

1

2

33

4

4

4

5

5

5

9

10

11

12

13


9/125


10/125

x

x

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pengolahan Elstrak ........................................................................

4.1.1 Penyiapan Bahan untuk Ekstraksi ........................................

4.1.2 Ekstraksi ...............................................................................

4.2 Uji Kandungan Senyawa pada Ekstrak ..........................................

4.2.1 Pengujian Skrining Fitokimia ...............................................

4.2.2 Analisis Kualitatif Senyawa Ekstrak Etanol Daun Gaharu

dengan Kromatografi Lapis Tipis .........................................

4.3 Perlakuan Hewan Uji .....................................................................

4.3.1 Uji Pendahuluan Dosis Aloksan ...........................................

4.3.2 Uji Pendahuluan Dosis Pemberian Ekstrak Daun Gaharu ...

4.3.3 Pengujian Aktivitas ..............................................................

4.3.4 Tes Toleransi Glukosa Oral ...............................................

4.5.5 Glikogen Hati .......................................................................

4.3.6 Histopatologi Pankreas .........................................................

BAB V. PENUTUP

5.1 Kesimpulan ................................................................................

5.2 Saran ..........................................................................................

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

28

28

28

29

30

30

36

38

38

39

40

41

47

52

58

58

58


11/125

xi

xi

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Penggolongan Obat Hipoglikemik Oral ...............................................

2. Perlakuan Orientasi Dosis Aloksan ......................................................

3. Perlakuan Orientasi Dosis Pemberian ekstrak Gaharu .........................

4. Hasil Pengujian Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Gaharu ......

5. Hasil Analisis Kualitatif Senyawa Ekstrak Etanol Daun Gaharudengan Kromatografi Lapis Tipis Dengan Reaksi Penyemprot ...........

6. Hasil Uji Pendahuluan Dosis Aloksan .................................................

7. Uji Pendahuluan Dosis Pemberian Ekstrak Daun Gaharu ...................

8

21

22

31

36

38

49


12/125

xii

xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Tumbuhan Gaharu ( Aquilaria microcarpa Baill.) ................................

2. Perbedaan Diabetes melitus tipe I dan Tipe II ......................................

3. Struktur Aloksan ...................................................................................

4. Preparat Pankreas .................................................................................

5. Skema Pengujian Aktivitas Antidiabetes .............................................

6. Reaksi Uji Mayer ..................................................................................

7. Reaksi Uji Dragendorff ........................................................................

8. Reaksi Terpenoid dengan Pereaksi Lieberman-Burchard ....................

9. Reaksi Tanin dan Gelatin .....................................................................

10. Reaksi Flavonoid dengan NaOH ..........................................................

11. Reaksi Fenol dengan FeCl3 ..................................................................

12. Reaksi Antara Polifenol dengan Pereaksi FeCl3 ...................................

13. Grafik Tes Toleransi Glukosa Oral .......................................................

14. Grafik Rata-rata Total AUC Tiap Kelompok Perlakuan ......................

15. Grafik pembacaan panjang gelombang Larutan Standar ( Bovine liver glycogen) yang Direaksikan dengan PHESUL (Phenol dan Asam

Sulfat Pekat) ..........................................................................................

16. Grafik Kurva Operating Time Larutan Standar ( Bovine liver glycogen) yang Direaksikan dengan PHESUL (Phenol dan Asam

Sulfat Pekat) .........................................................................................

17. Grafik Kurva Standar ( Bovine liver glycogen) yang Direaksikandengan PHESUL (Phenol dan Asam Sulfat Pekat) ..............................

18. Grafik Rata-rata Kadar Glikogen Hati pada Tiap Kelompok

perlakuan ...............................................................................................

19. Grafik Rata-rata Jumlah pulau langerhans pada Tiap Kelompok

perlakuan ...............................................................................................

20. Gambar preparat pankreas masing-masing kelompok ........................

4

7

12

14

23

32

32

33

34

35

36

38

43

45

48

49

50

51

54

57


13/125

xiii

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran

1. Surat determinasi

2. Form Ethical clearance

3. Sertifikat aloksan

4. Sertifikat hewan uji

5. Proses ekstraksi daun gaharu

6. Perhitungan rendemen ekstrak etanol daun gaharu

7. Hasil pegujian skrining fitokimia ekstrak etanol daun gaharu

8. Hasil analisi kualitatif senyawa ekstrak daun gaharu dengan kromatografi

lapis tipis dengan reaksi penyemprot

9. Hasil orientasi dosis aloksan

10. Hasil orientasi dosis ekstrak

11. Pembuatan larutan pnginduksi

12. Pembuatan larutan stok ektrak kering daun gaharu 13. Skema pengujian aktivitas antidiabet

14. Dokumentasi uji aktivitas antidiabet

15. Pengamatan kadar glkosa darah pada TTGO

16. Hasil rata-rata ± SEM kadar glukosa daah pada TTGO

17. Persentase kadar glukosa darah pada TTGO

18. Hasil persentase rata-rata ± SEM kadar glukosa daah pada TTGO

19. AUC tiap kelompok

20. Hasil AUC total (rata-rata ± SEM) tiap kelompok

21. Contoh Perhitugan persentase kadar glukosa darah

22. Analisis statistik data rata-rata AUC total pada TTGO

23. Hasil uj post hoc LSD kadar glukosa darah TTGO pada tiap kelompok

perlakuan

24. Dokumentasi pembacaan glikogen hati

25. Hasil absorbansi pembacaan panjang gelombang


14/125

xiv

xiv

26. Hasil absorbansi operating time

27. Hasil absorbansi penetapan kurva standar

28. Hasil uji regresi kurva standar

29. Hasil absorbansi sampel hati tikus

30. Hasil kadar glikogen tikus (μ/mg) Mean ± SEM setiap kelompok

31. Contoh perhitungan penetapan kadar glikogen hati

32. Analisis statistik data kadar glikogen hati

33. Hasil uji Mann-Whitney kadar glikogen hati terhadap tiap kelompok

perlakuan

34. Dokumentasi pembuatan preparat pankreas

35. Hasil pembacaan jumlah pulau langerhas

36. Hasil pembacaan jumlah pulau langehans (Mean ± SEM) pada setiap

kelompok

37. Analisis statistik data jumlah pulau langerhans pada pankreas

38. Hasil uji Mann-Whitney jumlah pulau langerhans terhadap tiap kelompok

perlak


15/125

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Diabetes melitus didefinisikan sebagai suatu penyakit kelainan metabolik

kronis secara serius yang memiliki dampak signifikan terhadap kesehatan yang

ditandai dengan tingginya kadar gula dalam darah. Diabetes melitus dapat

disebabkan karena menurunnya hormon insulin yang diproduksi oleh sel beta pada

pulau Langerhans dalam kelenjar pankreas (Reinauer et al. 2002). Berdasarkan data

dari International Diabetes Federation (IDF) Diabetes Atlas, Indonesia termasuk

dalam daftar 10 negara dengan penderita diabetes terbanyak. Di Indonesia pada

tahun 2013 ada sebanyak 8,5 juta penduduk yang mengalami diabetes dan

diperkirakan pada tahun 2035 akan terjadi peningkatan jumlah penderita diabetes

menjadi 14,1 juta penduduk Indonesia (IDF, 2013). Terapi diabetes melitus dapat

dilakukan dengan terapi tanpa obat berupa diet, olahraga teratur dan penurunan berat

badan merupakan komponen penting dari pengobatan diabetes melitus. Apabila

penatalaksanaan terapi tanpa obat (pengaturan diet dan olahraga) belum berhasilmengendalikan kadar glukosa darah penderita, maka perlu dilakukan langkah

berikutnya berupa penatalaksanaan terapi dengan obat, baik dalam bentuk terapi obat

hipoglikemik oral, terapi insulin, atau kombinasi keduanya (Depkes RI, 2005).

Penggunaan obat herbal sebagai terapi alternatif beberapa penyakit semakin

berkembang luas dan populer. Salah satu tanaman yang dapat dimanfaatkan sebagai

terapi alternatif untuk penurun kadar glukosa dalam darah adalah daun gaharu. Daun

tanaman gaharu ( Aquilaria microcarpa Baill.) secara empiris digunakan sebagai

penurun kadar glukosa darah oleh masyarakat Tamiang Layang, dimana daun gaharu

tersebut diseduh dengan air hangat dan diminum. Dari hasil penelitian Prankhon et al

(2011) daun gaharu dengan spesies berbeda yaitu Aquilaria sinensis berpotensi

sebagai agen antidiabetes, dimana dapat menurunkan kadar glukosa darah puasa dan

meningkatkan penyerapan glukosa di jaringan adiposa. Berdasarkan penelitian yang

dilakukan oleh Mega & Swastini (2010) ekstrak metanol daun gaharu mengandung


16/125

2

2

senyawa metabolit sekunder flavonoid, terpenoid dan senyawa fenol.

Flavonoid merupakan agen antidiabetes yang bekerja dengan cara meningkatkan

pemanfaatan glukosa pada jaringan perifer, menstimulasi sel beta pankreas untuk

meningkatkan sekresi insulin dan bertindak sebagai inhibitor glukosidase (Jadhav &

Puchchakayala, 2012). Flavonoid sebagai salah satu kelompok senyawa fenolik yang

banyak terdapat pada jaringan tanaman dapat berperan sebagai antioksidan, dimana

berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Gomathi et al (2013) bahwa antioksidan

yang terdapat dalam ekstrak Evolvulus alsinoides L. dapat membantu regenerasi dari

pankreas pada tikus yang mengalami diabetes.

Pengujian aktivitas penurun glukosa darah dapat diamati dari beberapa

parameter yaitu kadar glukosa pada tes toleransi glukosa oral, glikogen hati dan

histopatologi pankreas. Parameter ini diambil karena menggambarkan proses

pengendalian kadar glukosa dalam darah. Pengamatan pada histopatologi pankreas

dilakukan dengan menghitung jumlah pulau Langerhans, dimana menurut Adeyemi

et al (2010) kerusakan pada pankreas menyebabkan penurunan jumlah pulau

Langerhans yang mengakibatkan penurunan sekresi insulin dan meningkatnya kadar

glukosa dalam darah. Kadar glukosa pada tes toleransi glukosa oral digunakan untukmengukur kemampuan tubuh dalam menggunakan gula jenis glukosa yang

merupakan sumber utama energi tubuh (Islam et al , 2009). Kadar glikogen dalam

hati digunakan untuk melihat penggunaan glukosa pada jaringan, dimana apabila

kadar glukosa darah meningkat (hiperglikemik) maka glukosa akan diubah dan

disimpan sebagai glikogen atau lemak. Glikogenesis (produksi glikogen) akan

menurunkan kadar glukosa darah dan proses ini distimulasi oleh insulin yang

disekresi oleh pankreas (James et al , 2002).

1.2. Rumusan Masalah

Masalah yang timbul berkaitan dengan judul penelitian ini dan menarik untuk

dipecahkan antara lain:

(1) Apakah ekstrak etanol daun gaharu memiliki aktivitas terhadap penurunan

kadar glukosa pada tes toleransi glukosa oral, peningkatan kadar glikogen


17/125

3

3

hati dan peningkatan jumlah pulau Langerhans pada histopatologi dari

pankreas tikus putih jantan yang diinduksi aloksan?

(2) Berapa besar dosis pemberian ekstrak etanol daun gaharu yang dapat

menurunkan kadar glukosa pada tes toleransi glukosa oral, meningkatkan

kadar glikogen hati dan meningkatkan jumlah pulau Langerhans pada

histopatologi dari pankreas tikus putih jantan yang diinduksi aloksan?

1.3. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan sebagai berikut:

(1) Membuktikan aktivitas ekstrak etanol daun gaharu terhadap penurunan kadar

glukosa pada tes toleransi glukosa oral, peningkatan kadar glikogen hati dan

peningkatan jumlah pulau Langerhans pada histopatologi dari pankreas tikus

putih jantan yang diinduksi aloksan.

(2) Menentukan dosis pemberian ekstrak etanol daun gaharu yang dapat

menurunkan kadar glukosa pada tes toleransi glukosa oral, meningkatkan

kadar glikogen hati dan meningkatkan jumlah pulau Langerhans pada

histopatologi dari pankreas tikus putih jantan yang diinduksi aloksan.

1.4. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat menambah data penelitian dalam usaha

pemanfaatan tumbuhan gaharu sebagai salah satu bahan alam untuk penurun kadar

glukosa darah pada manusia.


18/125

4

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Gaharu

3.5.1 Morfologi

Daun, bunga dan buah tanaman gaharu mempunyai ciri yaitu; daun lonjong

memanjang dengan panjang 5 – 8 cm, lebar 3 – 4 cm, berujung runcing, dan berwarna

hijau mengkilat. Bunga berada di ujung ranting atau ketiak atas dan bawah daun.

Buah berada dalam polong berbentuk bulat telur atau lonjong, berukuran panjang

sekitar 5 cm dan lebar 3 cm (Sumarna, 2002). Tumbuhan gaharu dapat dilihat pada

gambar 1. Menurut Tarigan (2004) secara taksonomi tanaman gaharu dapat

diklasifikasikan sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Divisio : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

Sub kelas : Dialypetale

Ordo : MyrtalesBangsa : Thymeleaceae

Genus : Aquilaria

Species : Aquilaria microcarpa Baill.

(a) (b)

Gambar 1. Tumbuhan Gaharu ( Aquilaria microcarpa Baill.) (a) batang pohon; (b) daun

(koleksi pribadi)


19/125

5

5

2.1.2 Kandungan Kimia

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Mega & Swastini (2010)

menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun gaharu (Gyrinops versteegii)

mengandung metabolit sekunder seperti senyawa fenol, flavonoid dan terpenoid

Ketiga senyawa metabolit sekunder tersebut diketahui mempunyai sifat sebagai

senyawa antioksidan atau sebagai agen antikanker. Menurut hasil penelitian yang

telah dilakukan Santosa et al (2013) yang menyatakan bahwa golongan senyawa dari

ekstrak metanol daun gaharu mengandung senyawa triterpen yang mempunyai gugus

fungsi seperti -OH, CH alifatik, C=O, dan C=C alifatik .

2.1.3 Kegunaan Tumbuhan Gaharu

Gaharu mempunyai banyak khasiat seperti anti asmatik, obat sakit perut,

kanker, hepatitis, sirosis dan sebagainya (Santosa et al , 2013). Secara tradisional

tanaman gaharu dipergunakan sebagai obat : penghilang stress, gangguan ginjal,

hepatitis, sirosis, pembengkakan hati dan ginjal, bahan antibiotik untuk TBC,

reumatik, kanker, malaria dan tukak lambung, anti asmatik, antimikroba, stimulant

kerja syaraf, sakit perut, afrodisiak , penghilang rasa sakit, diare, ginjal, tumor dan

paru-paru (Mega & Swastini, 2010).

2.2 Diabetes Melitus

Kata diabetes berasal dari bahasa Yunani yang memiliki arti mengalir,

sedangkan melitus berasal dari bahasa latin yang berarti madu atau manis (Fitriani,

2011). Diabetes melitus (DM) merupakan suatu kelainan metabolik kronis serius

yang memiliki dampak signifikan terhadap kesehatan seseorang atau suatu kondisi

konsentrasi glukosa dalam darah secara kronis lebih tinggi daripada nilai normal

(hiperglikemia) akibat tubuh kekurangan insulin atau fungsi insulin tidak efektif.

(Subroto, 2006). Setelah makan makanan tinggi karbohidrat, kadar glukosa darah

meningkat dari kadar puasa sekitar 80-100 mg/dL ke kadar sekitar 120-140 mg/dL

dalam periode 30 menit sampai 1 jam. Konsentrasi glukosa darah kemudian mulai

menurun kembali ke kadar puasa dalam waktu sekitar 2 jam setelah makan (Marks et

al , 2000). Gejala tipikal yang sering dirasakan penderita diabetes antara lain poliuria

(sering buang air kecil), polidipsia (sering haus), dan polifagia (banyak makan atau


20/125

6

6

mudah lapar), penglihatan kabur, koordinasi gerak anggota tubuh terganggu,

kesemutan pada tangan atau kaki, timbul gatal-gatal yang seringkali sangat

mengganggu (pruritus), dan berat badan menurun tanpa sebab yang jelas (Depkes

RI, 2005). Penyakit diabetes melitus dapat disebabkan oleh beberapa faktor

diantaranya pola makan, obesitas, faktor genetik, bahan kimia dan obat-obatan, serta

infeksi pada pankreas (Wijayakusuma, 2004).

Menurut Subroto (2006) klasifikasi diabetes melitus adalah sebagai berikut:

(1) Diabetes melitus Tipe I (Diabetes Melitus tergantung Insulin)

Tipe ini disebabkan oleh kerusakan sel beta pankreas sehingga kekurangan

insulin absolut. Faktor keturunan juga merupakan salah satu penyebab. Penderita

Diabetes melitus Tipe I tergantung pada terapi insulin dan tidak dianjurkan

mengonsumsi obat antidiabetik oral. Penderita Diabetes melitus Tipe I tidak dapat

disembuhkan dan tergantung pada injeksi insulin selama hidupnya.

(2) Diabetes melitus Tipe II (Diabetes Melitus tidak tergantung Insulin)

Tipe ini disebabkan oleh gangguan sekresi insulin yang progresif karena

resistensi insulin. Diabetes melitus Tipe II dipicu oleh pola hidup yang kurang sehat.

(3) Diabetes Melitus KehamilanDiabetes tipe ini hanya diderita oleh wanita selama kehamilannya dan

umumnya akan kembali normal sesudah hamil. Walaupun demikian, beberapa kasus

yang tidak terkontrol dapat berkembang lebih lanjut pasca-kelahiran. Penanganan

yang kurang baik terhadap penderita akan berakibat buruk pada janin seperti

kelainan bawaan, gangguan pernapasan pada bayi bahkan kematian janin.

(4) Diabetes melitus tipe lain

Diabetes tipe ini disebabkan oleh keadaan atau sindrom tertentu seperti

penyakit pankreas, penyakit hormonal, keadaan yang disebabkan oleh obat atau zat

kimia, gangguan reseptor insulin, dan sindrom genetik tertentu.


21/125

7

7

Gambar 2. Perbedaan Diabetes melitus tipe I dan Tipe II (Baradero et al , 2005)

Reaksi biokimia dalam tubuh selalu berubah untuk mengatur dan

mempertahankan nilai kadar glukosa darah. Tujuan mengatur metabolisme

karbohidrat adalah untuk mempertahankan homeostatis dan mengubah reaksi

biokimia sesuai yang dibutuhkan oleh tubuh (Gropper et al , 2005). Kadar glukosa

darah dipertahankan melalui dua reaksi utama, yaitu penambahan glukosa dari

simpanan glukosa hati dan mengambil kelebihan glukosa untuk dibawa ke hati dan

otot (Sizer & Whitney, 2006). Menurut Almatsier (2001) ada beberapa hormon yang

berhubungan dengan pengaturan kadar glukosa darah, yaitu :

(1) Hormon insulin

Hormon ini dihasilkan oleh sel-sel beta pulau Langerhans pankreas. Hormon

ini berfungsi menurunkan kadar glukosa darah. Mekanisme penurunan kadar glukosa

darah oleh insulin meliputi peningkatan laju penggunaan glukosa melalui oksidasi,

glikogenesis, dan lipogenesis. Efek lain yang ditimbulkan insulin adalah peningkatan

difusi fasilitatif glukosa kedalam sel-sel otot dan sel lemak. Pengeluaran insulin

dirangsang oleh hormon glukagon dan hormon-hormon saluran cerna.

(2) Hormon glukagon

Hormon ini diproduksi oleh sel alfa pulau Langerhans pankreas dan

mempunyai sifat kebalikan dari hormon insulin. Glukagon meningkatkan glukosa

darah melalui peningkatan glikogenolisis dan glukoneogenesis.


22/125

8

8

(3) Hormon epinefrin

Hormon ini diproduksi oleh medula kelenjar adrenal dan mempunyai efek

menaikan kadar glukosa darah melalui peningkatan glikogenolisis dan menurunkan

pengeluaran insulin dari pankreas.

(4) Hormon Glukokortikoid

Hormon ini diproduksi korteks adrenal yang berfungsi untuk menaikkan

glukosa darah dengan merangsang glukoneogenesis.

(5) Hormon Tiroksin

Peningkatan produksi hormon ini akan meningkatkan laju absorbsi heksosa

dari usus kecil, glikogenolisis dan glukoneogenesis dalam hati.

(6) Hormon pertumbuhan

Hormon ini meningkatkan pengambilan asam amino dan sintesis protein oleh

semua sel sehingga menurunkan pengambilan glukosa sel dan meningkatkan

mobilisasi lemak untuk energi.

Berdasarkan Depkes RI (2005) penggolongan obat hipoglikemik oral dapat

dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Penggolongan Obat Hipoglikemik OralPenggolongan Obat Hipoglikemik Oral

Golongan Contoh Senyawa Mekanisme Kerja

Sulfonilurea Gliburida atau Glibenklamida

Glipizida

Glikazida

Glimepirida

Glikuidon

Merangsang sekresi insulin di kelenjar

pankreas, sehingga hanya efektif pada

penderita diabetes yang sel-sel β

pankreasnya masih berfungsi dengan baik.

Meglitinida Repaglinid Merangsang sekresi insulin di

kelenjar pankreas.

Turunan

fenilalanin

Nateglinid Meningkatkan kecepatan sintesis insulin

oleh pankreas.

Biguanida Metformin Bekerja langsung pada hati (hepar),

menurunkan produksi glukosa hati. Tidak

merangsang sekresi insulin oleh kelenjar

pankreas.


23/125

9

9

Lanjutan tabel 1. Penggolongan Obat Hipoglikemik Oral

Penggolongan Obat Hipoglikemik Oral

Golongan Contoh Senyawa Mekanisme Kerja

Tiazolidindion Rosiglitazon

Troglitazon

Pioglitazon

Meningkatkan kepekaan tubuh

terhadap insulin. Berikatan dengan PPARγ

( Peroxisome Proliferator Activated

Receptor-gamma) di otot, jaringan lemak,

dan hati untuk menurunkan resistensi

insulin

Inhibitor α-

glukosidase

Acarbose

Miglitol

Menghambat kerja enzim-enzim pencenaan

yang mencerna karbohidrat, sehingga

memperlambat absorpsi glukosa ke dalam

darah.

2.3 Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses penarikan komponen/zat aktif suatu simplisia dengan

menggunakan pelarut tertentu. Prinsip ekstraksi adalah melarutkan senyawa polar

dalam pelarut polar dan senyawa non polar dalam pelarut non polar (Robinson,

1995). Parameter dasar yang mempengaruhi kualitas ekstrak

yaitu, bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan awal, pelarut yang digunakan

untuk ekstraksi dan prosedur ekstraksi. Variasi dalam metode ekstraksi yang

berbeda yang akan mempengaruhi komposisi kuantitas dan metabolit sekunder dari

ekstrak tergantung pada jenis ekstraksi, waktu ekstraksi, suhu, sifat pelarut,

konsentrasi pelarut dan polaritas (Pandey & Tripathi, 2014).

Berdasarkan Depkes RI (2000), ekstraksi dengan menggunakan pelarut dapat

dilakukan dengan beberapa cara yaitu :

(1) Cara dingin

a. Maserasi

Maserasi adalah proses penyarian simplisia dengan menggunakan pelarut

dengan beberapa kali pengadukan pada temperatur ruangan.

b. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut sampai sempurna (exhaustive

extraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan. Proses


24/125

10

10

terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap

perkolasi sebenarnya (penetesan atau penampungan ekstrak).

(2) Cara Panas

a. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya,

selama waktu tertentu dan jumlah pelarut yang relatif konstan dengan adanya

pendingin balik.

b. Soxhlet

Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang umumnya dilakukan

dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut

relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

c. Infus

Infus adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia nabati

dengan air pada suhu 90°C selama 15 menit.

2.4 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi lapis tipis didasarkan pada distribusi fase cair-padat. Sebagai

fase diam atau absorbennya berupa lapisan tipis alumina atau silika gel yang

menempel pada permukaan kaca plastik, sedangkan sebagai fase gerak adalah eluen

yang digunakan untuk membawa zat yang dianalisis bergerak melalui fase diam

padat. Fase diam harus mempunyai sifat tidak larut dalam fase gerak maupun dalam

komponen sampel. Fase diam dalam KLT yang biasa digunakan sebagai pelapis plat

adalah silika gel (siO2), selulosa, alumina (Al2O3) dan kieselgur (tanah diatom)

(Gritter et al , 1991). Prinsip KLT adalah adanya adsorbsi dan partisi, yang

ditentukan oleh fase diam (adsorben) dan fase gerak (eluen). Komponen kimia akan

bergerak naik mengikuti fase gerak karena daya serap adsorben terhadap komponen-

komponen kimia tidak sama sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan

kecepatan yang berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya. Hal inilah yang

menyebabkan terjadinya pemisahan (Gandjar & Rohman, 2007). Pelarut sebagai fase

gerak atau eluen merupakan faktor yang menentukan gerakan komponen-komponen


25/125

11

11

dalam campuran. Pemilihan pelarut tergantung pada sifat kelarutan komponen

tersebut terhadap pelarut yang digunakan (Sastrohamidjojo, 1992).

2.5 Spektroskopi UV-Vis

Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari

spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan

panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas yang

ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk

mengukur energi cahaya secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan,

direflaksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Kelebihanspektrofotometer dibandingkan fotometer adalah panjang gelombang sinar dapat

lebih terseleksi. Hal ini karena sebelumnya sinar diurai dengan alat pengurai seperti

prisma, kisi (grating) ataupun celah optik. Pada fotometer, sinar dengan panjang

gelombang yang diinginkan diperoleh dengan menggunakan filter dari berbagai

warna, yang mempunyai spesifikasi panjang gelombang tertentu. Pada fotometer

filter, tidak mungkin diperoleh panjang gelombang yang benar-benar monokromatis,

melainkan suatu trayek dengan panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan pada

spektrofotometer panjang gelombang yang benar-benar terseleksi dapat diperoleh

dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun

dari sumber spektrum sinar tampak yang sinambung, dan monokromatis. Sel

pengabsorbsi untuk mengukur perbedaan absorbsi antara cuplikan dengan blanko

ataupun pembanding (Prasetyo, 2006).

Prinsip dasar spektrofotometri UV-Vis adalah analisis yang didasarkan pada

pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu laju larutan berwarna pada

panjang gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi

difraksi dengan detector fototube (Setiono & Avriliana, 2013). Metode

spektrofotometri UV-Vis banyak diterapkan untuk penetapan senyawa-senyawa

organik yang umumnya dipergunakan untuk penentuan senyawa dalam jumlah yang

sangat kecil. Analisis ini berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik ultra

violet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai

instrumen spektrofotometer dengan suatu materi (senyawa). Metode ini berdasarkan


26/125

12

12

penyerapan sinar ultraviolet maupun sinar tampak yang menyebabkan terjadinya

transisi elektron (perpindahan elektron dari tingkat energi yang rendah ketingkat

energi yang lebih tinggi) (Octaviani et al , 2014).

2.6 Aloksan

Gambar 3. Struktur Aloksan (Szkudelski, 2001)

Aloksan merupakan diabetogenik bila diberikan secara intravena,

intraperitoneal atau subkutan. Dosis aloksan diperlukan untuk menginduksi diabetes

tergantung pada spesies hewan, rute pemberian dan status gizi. Dosis (intravena)

aloksan yang paling sering digunakan untuk menginduksi diabetes pada tikus adalah

65 mg/kgBB, k etika aloksan diberikan secara intraperitoneal atau subkutan dosis

efektif harus 2-3 kali lebih tinggi (Szkudelski, 2001). Pemberian aloksan

menyebabkan nekrosa spesifik pada pulau-pulau Langerhans, memiliki efek

sitotoksik pada sel beta pankreas. Saat sel beta dirusak oleh aloksan, sekresi insulin

pun menurun mengakibatkan tubuh tidak dapat menggunakan glukosa. Glukosa

terakumulasi dalam darah (hiperglikemia) hal itu disebut kondisi diabetes. Keadaan

ini ditunjukan oleh meningkatnya kadar glukosa darah tikus kontrol positif. Aloksan

dalam darah berikatan dengan GLUT-2 (Glucose Transport ) yang memfasilitasi

masuknya aloksan ke dalam sitoplasma sel beta pankreas (Wibawa et al , 2013).

Aloksan dapat meningkatkan konsentrasi ion kalsium bebas sitosolik pada sel

β Langerhans pankreas. Efek tersebut diikuti oleh beberapa kejadian yaitu influks

kalsium dari cairan ekstraseluler, mobilisasi kalsium dari simpanannya secara

berlebihan, dan eliminasinya yang terbatas dari sitoplasma. Influks kalsium akibat

aloksan tersebut mengakibatkan depolarisasi sel β Langerhans, lebih lanjut membuka

kanal kalsium tergantung voltase dan semakin menambah masuknya ion kalsium ke


27/125

13

13

sel. Pada kondisi tersebut, konsentrasi insulin meningkat sangat cepat, dan secara

signifikan mengakibatkan gangguan pada sensitivitas insulin perifer dalam waktu

singkat. Selain kedua faktor tersebut di atas, aloksan juga diduga berperan dalam

penghambatan glukokinase dalam proses metabolisme energi (Szkudelski, 2001).

2.7 Parameter

2.7.1 Pengukuran Tes Toleransi Glukosa Oral (TTGO)

Tes toleransi glukosa oral (TTGO) digunakan untuk mengukur kemampuan

tubuh dalam menggunakan gula jenis glukosa, yang merupakan sumber utama energi

tubuh (Islam et al , 2009). Hasil TTGO dapat dipengaruhi oleh masuknya karbohidratdan durasi puasa sebelum dilakukan tes. TTGO biasanya dijadwalkan pada pagi hari

dan berlangsung selama 2 jam (Phillips, 2012). Tes ini dianggap sebagai tes yang

paling fisiologis, karena melalui rute oral. Glukosa yang masuk kedalam saluran

cerna akan diserap pada saluran usus dan masuk sirkulasi splanknik setelah itu

menuju ke sirkulasi sistemik. Konsentrasi glukosa darah yang meningkat akan

merangsang sel beta pankreas untuk melepaskan insulin, yang akan merangsang

penyerapan glukosa oleh jaringan perifer (Pacini et al , 2013).

2.7.2 Glikogen dalam Hati

Insulin dan glukagon mengatur metabolisme glikogen hati dengan mengubah

status fosforilasi glikogen dalam jalur degradatif dan glikogen sintase dalam jalur

biosintetik. Glikogen hati merupakan cadangan pertama untuk menunjang kadar

glukosa darah, dan defisiensi glikogen fosforilase atau enzim lain pada jalur

degradasi glikogen hati (Marks et al , 2000). Kelebihan glukosa akan disimpan

sebagai glikogen pada manusia dan hewan. Sekitar sepertiga cadangan glikogen

tubuh terdapat pada hati dan dua pertiga pada otot. Hati berperan penting dalam

mempertahankan kadar glukosa darah. Jika kadar glukosa darah meningkat

(hiperglikemik) maka glukosa akan diubah dan disimpan sebagai glikogen atau

lemak. Glikogenesis (produksi glikogen) akan menurunkan kadar glukosa darah dan

proses ini distimulasi oleh insulin yang disekresi oleh pankreas (James et al , 2002).

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Suarsana et al (2010), dimana

penurunan aktivitas enzim yang terlibat dalam sintesis glikogen pada keadaan


28/125

14

14

diabetes berhubungan dengan resistensi insulin pada berbagai jaringan. Peningkatan

kadar glikogen hati dan otot diduga melalui mekanisme stimulasi sel beta pankreas

meningkatkan sekresi insulin.

2.7.3 Histopatologi Pankreas

Pankreas adalah kelenjar lunak kekuningan dengan panjang 12-15 cm yang

terletak di bawah kulvatura mayor lambung. Pada bagian endokrin sel pankreas

terdiri dari kelompok sel khusus yang disebut pulau Langerhans yang tersebar di

seluruh pankreas. Di dalam pulau ini terdapat sel alfa yang mengeluarkan hormon

glukagon dan sel beta yang mengeluarkan hormon insulin. Glukagon dan insulin

adalah hormon utama yang berperan dalam mengatur glukosa darah (Brooker, 2009).

Kerusakan pada pankreas menyebabkan penurunan jumlah pulau Langerhans yang

mengakibatkan penurunan sekresi insulin dan meningkatnya kadar glukosa dalam

darah (Adeyemi et al , 2010). Pemeriksaan pankreas pada seorang pasien diabetes

secara histologik mengungkapkan adanya hialinasi atau fibrosis dari pulau

Langerhans, dengan destruksi sebagian besar sel beta nya (Bloom & Fawcett, 2002).

Berdasarkan penelitian Kumar et al (2011) histologi pankreas tikus yang

normal, mengalami diabetes serta setelah pemberian ekstrak Dillenia indica dapat

dilihat seperti gambar di bawah ini:

Gambar 4. (A) kontrol normal (B) Kontrol Diabetes (C) DIME ( Dillenia indicamethanolic leaves) 500 mg / kg (Kumar et al, 2011).

Histologi pankreas (Gambar 3) menunjukkan asinus normal (panah merah) dan

normal seluler di pulau Langerhans (panah kuning) di pankreas pada kontrol normal

(A). Pada hewan kontrol diabetes terjadi kerusakan yang luas untuk pulau

Langerhans dan mengurangi dimensi pulau diamati pada tikus diabetes (B). Pada

hewan yang diberikan DIME 500 mg / kg terlihat ukuran populasi sel pulau

kembalinya menjadi normal (C).

A

B

C


29/125

15

15

2.8 Hipotesis

Hipotesis untuk penelitian ini yaitu ekstrak etanol daun gaharu dapat

memberikan pengaruh terhadap penurunan kadar glukosa pada tes toleransi glukosa

oral, peningkatan kadar glikogen hati dan peningkatan jumlah pulau Langerhans

pada histopatologi dari pankreas tikus putih jantan yang diinduksi aloksan.


30/125

16

16

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan yaitu penelitian eksperimental dengan

menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Penelitian ini untuk membuktikan

aktivitas ekstrak etanol daun gaharu terhadap penurunan kadar gula darah pada tes

toleransi glukosa oral, peningkatan kadar glikogen hati dan peningkatan jumlah

pulau Langerhans pada histopatologi pankreas pada tikus putih jantan galur wistar

yang diinduksi aloksan.

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan selama bulan Januari – Juli 2015 di

Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Laboratorium Farmakologi-Toksikologi,

Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas

Lambung Mangkurat Banjarbaru.

3.3 Alat dan Bahan

3.3.1 Alat

Alat yang digunakan adalah alat pemotong daun, timbangan gram kasar,

blender, ayakan, perkolator, waterbath (Smic®), vacum rotary ovaporator

(Heidolph®), hot plate (Stuart CB 302®), neraca analitik (IND GF-3000®),

desikator, sendok tanduk, penjepit kayu, pipa kapiler, rak tabung reaksi, magnetic

stirrer , chamber , alat-alat kaca (Pyrex®), spuit injeksi (Onemed®), timbangan tikus

(Precise®), sonde oral, baskom besar, kandang tikus, glukometer (GlucoDr ®), plat

silika GF254, chamber , spektrofotometer UV-Vis, sentrifuge (Clements GS 150®),

lampu UV 254 nm dan 366 nm, oven (Vinco Inc®), lemari pendingin, mikroskop

(Olympus CX21®), alat bedah ( Pinset, Gunting dan skapel), mortir dan stamper,

flotation bath (Civilab®) kaca objek, kaca penutup, corong kaca (Pyrex®), pipet

tetes, pipet volume (Pyrex®), spektrofotometer UV-Vis, vortex mixer (Jeio Tech®),

dan Mikrotom (Microtec®).


31/125

17

17

3.3.2 Bahan

Bahan yang digunakan daun gaharu, akuades, etanol 70% (Biomed®), FeCl3

1% (teknis) , FeCl3 10% (teknis), kloroform (teknis), ammonia (teknis), H2SO4 (p.a),

pereaksi Meyer (p.a), pereaksi Dragendorff (p.a), pereaksi Leibermen-Buchard (p.a),

NaOH (teknis), HCl encer (teknis), larutan klorida (teknis), larutan timbal asetat

(teknis), gelatin (teknis), silika gel F254, asam asetat glasia (teknis), butanol (teknis),

etil asetat (teknis), n-heksana (teknis), asam formiat (teknis), anisaldehid asam sulfat

(teknis), NaCl 0,9% (Otsuka®), NaCMC 0,5% , KOH 30% (p.a), etanol (95%) (p.a),

glukosa monohidrat (teknis), reagen fenol 5 % (p.a) , standar glikogen (Sigma®),formalin 10% (teknis), paraffin , pewarna hematoxylin-eosin (HE), larutan haupt,

aloksan (C4H2 N2O4) (Sigma®), glibenklamid (Indofarma®), standar pellet, alkohol

96% (Biomed®) , alkohol absolut dan xylol (p.a).

3.4 Hewan Uji

Hewan uji yang digunakan yaitu tikus jantan galur Wistar dengan berat 200-

260 gram berumur 4-6 bulan. Pembagian jumlah tikus untuk pengujian tiap

kelompok (n = 4) dihitung berdasarkan rumus Federer :

(n-1)(t-1) > 15

Keterangan :

t = jumlah kelompok perlakuan

n = jumlah ulangan dari tiap perlakuan

Rumus Federer untuk Metode Induksi Aloksan

(n-1) (t-1) ≥ 15

(n-1) (6-1) ≥ 15

n ≥ 4

berdasarkan perhitungan tersebut, maka jumlah pengulangan yang dilakukan untuk

setiap perlakuan n ≥ 4. Pengulangan yang dibutuhkan pada setiap kelompok

sebanyak 4 kali atau 4 ekor tikus sehingga jumlah total tikus yang digunakan

sebanyak 24 ekor tikus putih.


32/125

18

18

3.5 Variabel Penelitian

3.5.1 Variabel BebasVariabel bebas dari penelitian ini adalah dosis pemberian ekstrak etanol daun

gaharu.

3.5.2 Variabel Terikat

Variabel terikat dari penelitian ini adalah kadar glukosa darah pada tes

toleransi glukosa oral, glikogen hati dan jumlah pulau Langerhanss pada

histopatologi pankreas dari tikus putih yang telah diinduksi dengan aloksan.

3.6 Prosedur Penelitian

3.6.1 Pengumpulan Sampel

Sampel daun gaharu diambil dari daerah Tamiang Layang, Kalimantan

Tengah. Pengambilan dilakukan pada bulan Januari 2015 pada pagi hari. Tanaman

gaharu yang digunakan telah berusia diatas 5 tahun (cukup dewasa) agar didapatkan

kandungan senyawa metabolit sekunder yang maksimal.

3.6.2 Pengolahan BahanDaun gaharu yang telah dikumpulkan, dilakukan sortasi basah dan pencucian untuk

memisahkan pengotor dan bagian tanaman lain yang tidak dibutuhkan. Kemudian

dilakukan perajangan agar tanaman mudah dikeringkan. Kemudian dilanjutkan

dengan pengeringan daun gaharu. Pengeringan dilakukan dengan oven suhu 400 C

selama 72 jam hingga diperoleh sampel kering (Ibrahim et al , 2014). Setelah sampel

kering kemudian dilakukan sortasi kering untuk memisahkan bagian tanaman yang

rusak karena pemanasan. Lalu sampel diserbukkan dengan menggunakan blender

hingga terbentuk sampel serbuk dan diayak dengan pengayak no. 30 (Matthew et al ,

2013).

3.6.3 Ekstraksi

Serbuk daun gaharu ditimbang sebanyak 100 gram, kemudian dimasukkan

dalam alat perkolator. Sampel ditambahkan pelarut etanol 70%, kemudian direndam

selama 24 jam (Jamshidi et al , 2014). Kecepatan tetesan alat perkolator diatur 45


33/125

19

19

tetes setiap menit dan ditambahkan pelarut secara bertahap. Proses ekstraksi sampel

dengan pelarut etanol 70% menggunakan perbandingan 1,5:10 (Nobre et al , 2005).

Filtrat yang diperoleh dipisahkan dari residu dengan menggunakan kertas Whatman

nomor 1. Ekstrak cair yang diperoleh, dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator

dengan suhu 450 C hingga diperoleh ekstrak kental (Chaisawangwong &

Gritsanapan, 2009).

3.6.4 Uji Kandungan Senyawa Daun Gaharu

3.6.4.1 Pengujian Skrining Fitokimia

a. Senyawa Flavonoid

Ekstrak ditetesi dengan larutan NaOH maka akan terbentuk warna kuning

yang intens, dan apabila ditambahkan asam encer maka warnanya akan menghilang,

menunjukkan adanya flavonoid (Tiwari et al , 2011).

b. Senyawa Alkaloid

Ekstrak dilarutkan dalam HCL encer dan disaring untuk mendapatkan

filtratnya. Filtrat ditetesi dengan reagen Mayer apabila terbentuk endapan berwarna

kuning menunjukkan adanya alkaloid. Filtrat ditetesi dengan reagen Dragendroff

apabila terbentuk endapan merah menunjukkan adanya alkaloid (Tiwari et al , 2011).

c. Senyawa Tanin

Ekstrak ditambahkan dengan larutan gelatin 1% mengandung natrium

klorida, apabila terbentuk endapan putih menunjukkan adanya tanin (Tiwari et al ,

2011).

d. Senyawa Terpenoid

Ekstrak kental daun gaharu ditambahkan pereaksi Leibermen-Buchard, jika

terbentuk cincin coklat maka ekstrak positif mengandung terpenoid (Setyowati et al,

2014).

e. Senyawa Fenolik

Ekstrak ditetesi dengan 3-4 tetes larutan FeCl3 apabila terbentuk warna hitam

kebiruan menunjukkan adanya fenol (Tiwari et al , 2011).


34/125

20

20

3.6.4.1 Analisis Kualitatif Senyawa Ekstrak Etanol Daun Gaharu dengan

Kromatografi Lapis Tipis

Fase diam yang digunakan dalam skrining ini adalah Silika gel F254 ukuran

20x20 cm2 yang kemudian dipotong sesuai kebutuhan, sedangkan fase gerak dan

penampak noda yang digunakan sebagai berikut:

a. Senyawa Golongan Flavonoid

Fase Gerak : Butanol – Asam asetat glasial – Air (4 :1:5) Fase gerak ini

biasa disebut BAW (Butanol, Acetic acid, Water ) dan

lapisan atas diambil dan dipakai sebagai fase gerak.

Dengan pereaksi : Uap Amonia (Positif mengandung flavonoid jika timbul

warna kuning atau kuning-coklat setelah pemberian uap

amoniak).

Tanpa pereaksi : Bila tanpa pereaksi kimia, di bawah lampu UV 365 nm,

flavonoid akan berfluoresens biru, kuning atau hijau,

tergantung dari strukturnya.

(Marliana, 2007).

b. Senyawa Golongan Alkaloid

Fase Gerak : Etil asetat – Metanol – Air (6:4:2)

Dengan pereaksi : Pereaksi Dragendorff (Positif mengandung alkaloid jika

timbul warna coklat atau jingga setelah penyemprotan

pereaksi Dragendorff.

(Marliana, 2007).

c. Senyawa Golongan Terpenoid

Fase Gerak : n-heksan – Etil asetat (4:1)

Dengan pereaksi : Anisaldehid Asam Sulfat (Positif mengandung terpenoid

jika timbul warna ungu-merah atau ungu setelah

penyemprotan pereaksi anisaldehid asam sulfat.

(Wagner et al , 1996).


35/125

21

21

d. Senyawa Golongan Tanin

Fase Gerak : Air – Metanol – Kloroform (10:35:65)

Dengan pereaksi : FeCl3 1% (Positif mengandung tanin jika timbul warna

biru tua atau hijau kehitaman setelah penyemprotan

pereaksi FeCl3 1%.

(Prameswari & Widjanarko, 2014).

e. Senyawa Golongan Polifenol

Fase gerak : Kloroform - etil asetat - asam formiat (0,5 : 9 : 0,5)

Dengan pereaksi : FeCl3 10% (Positif mengandung polifenol jika timbulwarna hitam setelah penyemprotan pereaksi FeCl3 10%.

(Marliana, 2007).

3.6.5 Uji Pendahuluan Orientasi Dosis Aloksan

Pengujian pendahuluan orientasi dosis aloksan menggunakan hewan uji yang

dibagi menjadi 7 kelompok, dimana perlakuan yang diberikan adalah :

Tabel 2. Perlakuan Orientasi Dosis Aloksan

Hewan Uji Perlakuan Induksi

Normal NaCl 0,9% sebanyak 5 mL/kg BB

Induksi 1 Aloksan dosis 100 mg/kg BB






Pemberian induksi dilakukan secara intraperitoneal. Kemudian diadaptasi selama 7

hari. Setelah adaptasi, tikus dipuasakan selama 12 jam dengan tetap diberikan air

minum. Kadar glukosa darah puasa ditentukan pada hewan uji. Ditentukan dosis

efektif aloksan yang dapat menyebabkan keadaan hiperglikemia, namun tidak

menyebabkan kematian (Fitriani, 2011).


36/125

22

22

3.6.6 Penginduksian Aloksan

Hewan uji sebanyak 30 tikus jantan galur wistar sebelum diberi perlakuan

diadaptasikan selama satu minggu sebelum pengujian, setelah itu hewan uji dibagi

menjadi 6 kelompok, dimana masing-masing kelompok terdiri dari 4 tikus. Sebanyak

5 kelompok dipuasakan selama 12 jam kemudian diinduksi dengan senyawa aloksan

secara intraperitonial. Tikus diadaptasikan selama 1 minggu dengan pemberian

standar pellet dan air yang selalu tersedia. Kadar glukosa darah puasa hewan uji

diukur, jika kadar glukosa antara 470 - 530 mg/dL dilakukan pemberian perlakuan

pada hewan uji (Maniyar et al , 2012).

3.6.7 Uji Pendahuluan Orientasi Dosis Pemberian Ekstrak Daun Gaharu

Hewan uji sebanyak 8 ekor yang telah diinduksi aloksan digunakan untuk uji

pendahuluan orientasi dosis ekstrak daun gaharu. Masing-masing hewan uji

diberikan dosis ekstrak daun gaharu yang berbeda secara oral yaitu:

Tabel 3. Perlakuan Orientasi Dosis Pemberian Ekstrak Daun Gaharu

Hewan uji Perlakuan

Hewan Uji 1

Hewan Uji 2

Glibenklamid 2,5 mg/kg BB

Diberikan ekstrak gaharu 10 mg/ kg BB

Hewan Uji 3 Diberikan ekstrak gaharu 100 mg/ kg BB

Hewan Uji 4 Diberikan ekstrak gaharu 1000 mg/kg BB

Pemberian perlakuan dilakukan selama 7 hari, pada hari ketujuh dilakukan pengukuran

kadar glukosa darah puasa untuk mengetahui dosis yang efektif dalam penurunan

glukosa darah puasa namun tidak menyebabkan keadaan hipoglikemik.

3.6.8 Pengujian AktivitasKelompok uji diberikan ekstrak daun gaharu dengan dosis pemberian yang berbeda.

Pemberian perlakuan dilakukan selama 28 hari (4 minggu), dimana setiap hari

kelompok uji diberikan perlakuan (Kumar et al , 2014). Glibenklamid dan ekstrak

terlebih dahulu disuspensi dengan NaCMC 0,5% sebelum diberikan pada hewan uji.

Perlakuan yang diberikan pada hewan uji sebagai berikut :

Hewan Uji kelompok 1 : NaCMC 0,5% pada kelompok normal


37/125

23

23

Dilakukan pemisahan glikogen dari hati

Diukur absorbansinya dengan

spektrofotometer pada panjang

gelombang 490 nm

Diukur kadar glikogen

Hewan Uji kelompok 2 : Glibenklamid 2,5 mg/kgBB pada kontrol positif

Hewan Uji kelompok 3 : NaCMC 0,5% pada kontrol negatif

Hewan Uji kelompok 4 : diberikan ekstrak gaharu dosis 50 mg/kgBB



Tahapan pengujian aktivitas pada penelitian disajikan pada Gambar 5 berikut ini:

\

Diberikan perlakuan dari hari ke 0 – 28 hari

Pada hari yang ke 23 dilakukan tes toleransi

glukosa oral

Pada hari ke-28 diambil organ dalamnya

Diambil preparat pankreas

Dilakukan pewarnaan HE

Diamati di bawah mikroskop

Gambar 5. Skema Pengujian Aktivitas Antidiabetes

Hewan Uji

Tidak Induksi AloksanInduksi Aloksan

Kelompok

Normal

KelompokKontrol

Positif

Kelompok

Kontrol

Negatif

Kelompok Uji Kelompok UjiKelompok Uji

Glibenklamid

2,5 mg/kg BB

NaCMC

0,5%

Ekstrak Daun

Gaharu dosis

50 mg/kgBB

Ekstrak Daun

Gaharu dosis

200 mg/kgBB

Ekstrak Daun

Gaharu dosis100 mg/kgBB

NaCMC 0,5%

Pankreas Hati

Hasil

Hasil


38/125

24

24

3.6.9 Pengukuran Tes Toleransi Glukosa Oral (TTGO)

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Ridwan et al (2012) pengukuran

tes toleransi glukosa oral (TTGO) dilakukan pada hari ke-23 dan dipuasakan selama

± 18 jam. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Kumar et al (2014) tikus

diberi larutan glukosa 2 g/kg BB secara oral 30 menit setelah diberi perlakuan.

Pemberian larutan glukosa dilakukan menggunakan alat sonde. Selanjutnya, setelah

pemberian glukosa kadar glukosa darah diukur dengan menggunakan alat

glukometer, dimana darah diambil pada vena ekor pada masing-masing kelompok

setelah 0, 30, 60, 90, 120, dan 150 menit. kelompok perlakuan sebagai berikut:

Hewan Uji kelompok 1 : NaCMC 0,5% pada kelompok normal

Hewan Uji kelompok 2 : Glibenklamid 2,5 mg/kg BB pada kontrol positif

Hewan Uji kelompok 3 : NaCMC 0,5% pada kontrol negatif




3.6.10 Analisis Kadar Glikogen Dalam Hati

Metode pengukuran menurut Peungvicha et al (1998) dalam Suarsana et al

(2010), dimana sampel sebanyak 1 g organ hati diambil lalu dikeringkan dalam oven

pada suhu 50ºC selama satu malam, dilanjutkan dengan penggerusan sampai menjadi

tepung. Masing-masing sampel diambil 25 mg diekstraksi dengan 1 mL larutan KOH

30% dan diinkubasi dalam penangas air mendidih selama 20 menit, diletakkan pada

suhu ruang sampai dingin. Tambahkan 1,5 mL etanol (95%) dingin ke dalam tabung

sampel dan disimpan dalam suhu 4ºC selama 30 menit. Untuk memisahkan endapan

glikogen dalam sampel dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 20

menit. Menurut Jung et al (2011) masing-masing sampel dan standar ( Bovine liver

glycogen) ditambahkan akuadest 0,2 mL reagen fenol 5 %, dan 1 ml H 2SO4,

kemudian diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang

490 nm.


39/125

25

25

3.6.11 Histopatologi Pankreas

Menurut penelitian yang dilakukan oleh Yunita (2014) untuk melihat

histologi dari pankreas tikus maka dilakukan langkah-langkah sebagai berikut :

a. Pengambilan Organ Pankreas

Pada akhir perlakuan semua tikus dilakukan pembedahan dengan penyayatan

pada kulit dan otot abdominal hingga rongga perut terbuka. Selanjutnya dilakukan

pengambilan organ pankreas. Pankreas yang telah dipisahkan dari tubuh hewan

dibersihkan dengan larutan NaCl 0,9% lalu difiksasi dengan formalin 10% sampai

tahap pembuatan blok parafin.

b. Pembuatan Preparat Histologi

Pembuatan preparat histopatologi pada organ pankreas dilakukan dengan

prosedur sebagai berikut;

i. Fiksasi

Sediaan organ pankreas direndam dengan formalin 10%.

ii. Dehidrasi

Pankreas yang sudah difiksasi dengan formalin dipindahkan kedalam larutan

alkohol bertingkat (60%, 70%, 80%, 90%, 96%, alkohol absolut) masing-masingselama 2 jam.

iii. Penjernihan

Setelah itu organ dimasukkan ke dalam larutan alkohol absolut yang

dicampur xilol (1:1) selama 10 menit. Kemudian organ dipindahkan ke dalam xilol

murni selama 15 menit.

iv. Penanaman

Organ yang sudah jernih dipindahkan kedalam campuran xilol parafin lunak

(1:1) lalu dimasukan kedalam oven bersuhu 480C selama 30 menit. Setelah itu

dipindahkan kedalam parafin lunak murni lalu dimasukan kembali kedalam oven

480C selama 1 jam. Lalu di pindahkan lagi kedalam parafin keras dan dimasukan

kedalam oven 580C selama 1,5 jam. Setelah itu dilakukan embedding (penanaman

organ blok) dengan ukuran blok 2x1.


40/125

26

26

v. Penyayatan

Setelah pembuatan blok selesai diamkan blok parafin sampai keras dan siap

disayat. Setelah itu masing-masing blok disayat dengan ketebalan 4 (empat) mikron

dengan alat mikrotom, lalu lembaran-lembaran atau pita parafin hasil penyayatan

diletakan diatas object glass yang sudah diberi larutan Haupt dan akuades dan dapat

dilakukan pewarnaan.

c. Pewarnaan Hemotoksilin Eosin (HE)

Tahapan yang dilakukan dalam pewarnaan HE dimulai dengan proses

deparafinasi, yaitu penghilangan parafin dengan memasukan preparat kedalam serilarutan xilol III, xilol II, dan xilol I. Proses kemudian dilanjutkan dengan rehidrasi,

yaitu dengan memasukan preparat ke dalam seri larutan alkohol sampai alkohol 70

% secara berurutan. Preparat diwarnai dengan pewarnaan hemotoksilin dilanjutkan

dengan pencucian dalam akuades. Setelah itu preparat diwarnai dengan eosin lalu

preparat dimasukan kedalam alkohol bertingkat mulai alkohol 70% sampai alkohol

absolut setelah itu dilakukan penjernihan dengan xilol murni. Sediaan ditutup dengan

cover glass dan siap untuk dilakukan pengamatan di bawah mikroskop.

d. Pengamatan

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Masjedir et al (2013) untuk

analisis kuantitatif pada histopatologi pankreas dapat dilakukan dengan menghitung

jumlah pulau Langerhans, dimana perhitungan jumlah pulau Langerhans dilakukan

dengan menggunakan mikroskop dan dilakukan pada sepuluh lapang pandang

dengan perbesaran 100x.

3.7 Analisis Data

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental. Data yang didapat pada

uji Tes Toleransi Glukosa Oral (TTGO), kadar glikogen hati dan histopatologi

pankreas dilakukan pengujian normalitas distribusi data dengan metode Shapiro-

Wilk dan uji homogenitas varians data dengan metode Levene’s Test , jika data

terdistribusi normal dan homogen maka dianalisis secara statistik dengan

menggunakan uji ANOVA pada selang kepercayaan 95% dan jika perlakuan berbeda


41/125

27

27

nyata (P< 0,05) dilanjutkan dengan Post-Hoc test LSD. Tetapi jika data tidak

terdistribusi normal maka dilanjutkan dengan Kruskal-Wallis test dan jika perlakuan

berbeda nyata (P< 0,05) dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney.


42/125

28

28

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pengolahan Ekstrak

4.1.1 Penyiapan Bahan untuk ekstraksi

Pada penelitian ini bahan uji yang digunakan adalah daun dari tanaman

gaharu ( Aquillaria microcarpa Baill.) yang diperoleh dari daerah Tamiang Layang,

Kecamatan Dusun Timur, Kabupaten Barito Timur, Kalimantan Tengah. Tanaman

yang digunakan diuji determinasi terlebih dahulu untuk memastikan bahwa bahan uji

yang diambil sesuai dengan yang diinginkan. Determinasi tanaman dilakukan di

Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong, Bogor. Hasil determinasi

dapat dilihat pada lampiran 4 yang menunjukan bahwa tanaman yang digunakan

dalam penelitian ini adalah Aquillaria microcarpa Baill. dengan suku Thymeleaceae.

Daun gaharu dikumpulkan dengan cara dipetik, menurut Salisbury & Rose

(1995) pengambilan daun dilakukan pada daun yang tidak terlalu muda dan tidak

terlalu tua. Daun muda umumnya mempunyai kemampuan fotosintesis yang masih

rendah, sedangkan daun yang sudah tua mulai mengalami kerusakan klorofil yang

ditandai dengan perubahan warna menjadi kuning. Rusaknya klorofil akan

menurunkan kemampuan fotosintesis. Apabila kemampuan fotosintesis menurun

maka metabolit sekunder yang dihasilkan pun akan menurun juga. Selanjutnya

dilakukan sortasi basah pada daun gaharu yang bertujuan untuk memilih daun yang

tidak rusak dan memisahkan dengan senyawa pengotor.

Daun gaharu yang sudah disortasi dicuci dengan air mengalir untuk

menghilangkan kotoran yang menempel. Daun yang sudah bersih tadi dikeringkan,

proses pengeringan pada daun bertujuan untuk menghentikan reaksi enzimatik,

dimana enzim akan menjadi tidak aktif sehingga tidak terjadinya penguraian bahan

kimia (Krisyanella et al , 2012). Proses pengeringan juga bertujuan untuk mengurangi

kadar air di dalam daun yang menyebabkan berkurangnya aktivitas mikroba

sehingga komponen kimia dalam daun tidak akan rusak. Proses pengeringan

dilakukan dengan oven pada suhu 400C, menurut Hernani & Nurdjanah (2009)

pengeringan dilakukan harus sesuai dengan bahan tanaman yang akan dikeringkan.


43/125

29

29

Apabila suhu dan metode pengeringan tidak benar maka akan mengurangi kadar zat

berkhasiat dalam sampel. Daun sendiri dapat dikeringkan dengan kisaran suhu 20-

400C dan untuk sampel yang mengandung metabolit sekunder (flavonoid)

dikeringkan dengan oven pada suhu 400C karena suhu oven bersifat stabil sehingga

sampel dapat kering dengan merata. Daun gaharu yang sudah kering dihaluskan

dengan menggunakan blender dan kemudian diayak menggunakan pengayak dengan

nomor mesh 30. Penghalusan daun dilakukan untuk mempermudah proses ekstraksi.

Ukuran partikel yang lebih kecil merupakan ukuran yang ideal untuk proses

ekstraksi. Semakin kecil ukuran partikel, luas permukaan semakin besar dan lebih

mudah melepas komponen bioaktif (Syed & Rizvi, 2010).

4.1.2 Ekstraksi

Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstraksi dingin

dengan perkolasi, proses ekstraksi dapat dilihat pada lampiran 5. Perkolasi

merupakan prosedur yang paling sering digunakan untuk ekstraksi bahan aktif dalam

tingtur dan ekstrak cairan. Sebuah perkolat (sempit, kerucut berbentuk kapal terbuka

di kedua ujungnya) umumnya digunakan. Bahan padat yang dibasahi dengan jumlah

penyari yang tepat dan didiamkan dalam wadah tertutup dengan baik, dimana larutan

penyari ditambahkan untuk membentuk lapisan dangkal di atas sampel dan

campuran dibiarkan dalam perkolator tertutup selama 24 jam. Perkolator dibuka dan

cairan yang terkandung di dalamnya dibiarkan menetes perlahan. Penyari

ditambahkan sesuai dengan yang diperlukan (Pandey & Tripathi, 2014). Keuntungan

dari metode ekstraksi perkolasi ini adalah rendemen yang didapatkan lebih banyak

(Perwita, 2011), serta berdasarkan penelitian oleh Sumitra et al (2012) bahwa

metode ini lebih baik untuk menarik senyawa flavonoid dan fenolik dibandingkan

dekokta dan metode maserasi.

Etanol 70% dapat melarutkan senyawa fitokimia lebih maksimal karena

etanol 70% masih mengandung air yang cukup banyak (30%) yang membantu proses

ekstraksi sehingga sebagian senyawa tersebut ada yang tertarik dalam etanol dan ada

pula yang tertarik ke dalam air. Beberapa senyawa fitokimia seperti alkaloid,

flavonoid, glikosida flavonoid serta klorofil terlarut dalam pelarut polar sehingga


44/125

30

30

senyawa yang terlarut dalam pelarut etanol 70% cukup banyak (Sani et al , 2014).

Pelarut etanol 70% digunakan berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Bimakr et

al (2011) bahwa pelarut etanol 70% lebih banyak menyari senyawa flavonoid

(katekin, epikatekin, rutin dan apigenin) dibandingkan dengan etanol 99,5%.

Senyawa flavonoid itu sendiri berperan sebagai antidiabetes dimana mekanismenya

bekerja dengan cara meningkatkan pemanfaatan glukosa pada jaringan perifer,

menstimulasi sel beta pankreas untuk meningkatkan sekresi insulin dan bertindak

sebagai inhibitor glukosidase (Jadhav & Puchakayala, 2012).

Ekstrak yang telah diperoleh kemudian dipekatkan menggunakan rotary

vacum evaporator pada suhu 450C dan dihentikan setelah diperoleh ekstrak yang

hampir kental. Pemekatan dengan rotary vacum evaporator merupakan tehnik

pemekatan ekstrak tanpa merusak senyawa yang diisolasi dari ekstrak karena

rangkaian alat ini menggunakan pompa vacum sehingga di dalam evaporator terjadi

pengurangan tekanan yang menyebabkan pelarut dapat menguap di bawah titik

didihnya (Siadi, 2012). Rendemen adalah perbandingan antara ekstrak yang

diperoleh dengan simplisia awal (Depkes RI, 2000). Rendemen dihitung untuk

mengetahui persentasi bagian yang dapat diekstrak dari bahan mentah (Malangngi etal , 2012). Ekstraksi dengan perkolasi dilakukan sebanyak 4 kali proses ekstraksi, 100

g serbuk dari sampel digunakan pada sekali proses ekstraksi. Dari 400 g serbuk

didapatkan persen rendemen sebesar 9,0295 % (b/b). Sedangkan pada proses

ekstraksi daun gaharu (Gyrinops versteegii) yang dilakukan oleh Mega & Swastini

(2010) dengan menggunakan metode ekstraksi maserasi hanya mendapatkan persen

rendemen sebesar 4%. Hal ini dikarenakan perbedaan proses ekstraksi yang

dilakukan. Besar kecilnya nilai rendemen menunjukan keefektifan proses ekstraksi.

Efektivitas proses ekstraksi dipengaruhi oleh jenis pelarut yang digunakan sebagai

penyari, konsentrasi pelarut, suhu ekstraksi, metode dan waktu ekstraksi (Tiwari et

al , 2011).


45/125

31

31

4.2 Uji kandungan Senyawa pada Ekstrak

4.2.1 Pengujian Skrining Fitokimia

Tanaman obat mengandung beberapa senyawa metabolit sekunder,

diantaranya tanin, alkaloid, karbohidrat, terpenoid, sterol dan flavonoid. Senyawa ini

disintesis berlebih oleh organisme hidup melalui metabolisme primer atau sekunder.

Analisis fitokimia yang dilakukan pada ekstrak tanaman untuk mengidentifikasi

adanya konstituen yang dikenal untuk pengobatan serta aktivitas fisiologisnya

(Yadaf & Munin, 2011). Hasil pengujian skrining fitokimia dari ekstrak etanol daun

gaharu ditunjukan pada tabel 4.

Tabel 4. Hasil Pengujian Skreening Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Gaharu

No Uji Hasil Ket.

1. avonoid (+) arna larutan kuning intens dan warnanya akan

hilang apabila ditambahkan asam encer

2. kaloid

- reagen Mayer

- reagen Dragendroff

(-)

(-)

rdapat endapan kuning

rdapat endapan coklat kemerahan

3. nin (+) rbentuk endapan putih

4. rpenoid (-) rbentuk cincin coklat

5. nolik (+) arna larutan hitam kebiruan

Prosedur dan hasil skrining fitokimia dapat dilihat pada lampiran 7. Hasil

skrining fitokimia menunjukan bahwa ekstrak etanol daun gaharu positif

mengandung flavonoid, tanin dan fenolik. Menurut hasil penelitian yang dilakukan

oleh Khalil et al (2013) pada tanaman gaharu dengan spesies yang berbeda Aquilaria

malaccensis, hasil skrining fitokimia menunjukan bahwa daun gaharu mengandung

alkaloid, saponin dan senyawa fenolik (flavonoid, terpenoid dan tanin). Sedangkan

pada penelitian yang dilakukan oleh Mega & Swastini (2010) pada tanaman gaharu

(Gyrinops versteegii) dengan spesies yang berbeda juga menunjukan hasil yang

negatif pada skrining fitokimia untuk alkaloid.

Alkaloid adalah senyawa organik yang terdapat dalam tumbuh-tumbuhan,

bersifat basa, dan struktur kimia mempunyai sistem lingkar heterosiklik dengan

nitrogen sebagai hetero atomnya. Unsur-unsur penyusun alkaloid adalah karbon,


46/125

32

32

hidrogen, nitrogen dan oksigen (Sumardjo, 2009). Pada identifikasi alkaloid akan

terbentuk endapan pada uji mayer dan dragendorff berarti menandakan positif

mengandung alkaloid. Pada uji alkaloid dengan pereaksi mayer, nitrogen pada

alkaloid akan bereaksi dengan ion logam K + dari kalium tetraiodomerkurat(II)

membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap (Setyowati et al , 2014). Uji

alkaloid dengan reagen mayer yang dilakukan pada ekstrak daun gaharu memberikan

hasil negatif, dimana tidak adanya terbentuk endapan. Hal ini terjadi karena komplek

kalium-alkaloid tidak terbentuk. Reaksi dari uji alkaloid dengan reagen mayer dapat

dilihat pada Gambar 6.

HgCl2 + 2KI HgI2 + 2KCl

HgI2 + 2KI k 2 HgI4Kalium tetraiodomerkurat (II)

N

+

N

K

Kalium Alkaloidendapan

+ K 2 HgI4K 2 HgI4

Gambar 6. Reaksi Uji Mayer (Marliana et al , 2005)

Hasil positif alkaloid pada uji dragendorff ditandai dengan terbentuknya

endapan coklat muda sampai kuning. Pada uji alkaloid dengan pereaksi dragendorff,

nitrogen digunakan untuk membentuk ikatan kovalen koordinat dengan K + yang

merupakan ion logam (Marliana et al , 2005). Uji alkaloid dengan reagen dragendorff

yang dilakukan pada ekstrak daun gaharu memberikan hasil negatif, dimana tidak

adanya terbentuk endapan. Hal ini terjadi karena tidak terbentuknya ikatan kovalen

koordinat antara nitrogen dan K +. Reaksi dari uji alkaloid dengan reagen dragendorff

dapat dilihat pada Gambar 7.


47/125

33

33

Bi (NO3)3 + 3KI BiI3 + 3KNO3coklat

BiI3 + KI K BiI4kalium tetraiodobismutat

N

+ K BiI4

N

K

+ BiI4

kalium-alkaloid

endapan

Gambar 7. Reaksi Uji Dragendorff (Marliana et al , 2005)

Terpenoid merupakan turunan-turunan terpena atau senyawa-senyawa yang

strukturnya mirip terpena. Molekul terpenoid dapat mengandung gugus karboksil,

hidroksil, formil, atau gugus yang lainnya (Sumardjo, 2009). Identifikasi terpenoid

menggunakan uji Lieberman-Burchard akan memberikan hasil positif jika

terbentuknya cincin coklat pada batas larutan saat ditambahkan dengan H2SO4.

Perubahan warna disebabkan karena terjadinya oksidasi pada golongan senyawa

terpenoid melalui pembentukan ikatan rangkap terkonjugasi. Reaksi ini diawali

dengan proses asetilasi gugus hidroksil menggunakan asam asetat anhidrat. Gugus

asetil yang merupakan gugus pergi yang baik akan lepas. Sehingga terbentuknya

ikatan rangkap. Selanjutnya terjadi pembentukan gugus hidrogen beserta

elektronnya, mengakibatkan ikatan rangkap berpindah. Senyawa ini mengalami

resonansi yang bertindak sebagai elektrofil atau karbokation. Serangan karbokation

menyebabkan adisi elektrofilik, diikuti dengan pelepasan hidrogen beserta

elektronnya dilepas akibatnya senyawa mengalami perpanjangan konjugasi yang

memperlihatkan munculnya cincin coklat (Setyowati et al , 2014). Uji terpenoid

dengan pereaksi Lieberman-Burchard yang dilakukan pada ekstrak daun gaharu

memberikan hasil negatif, dimana tidak adanya terbentuk cincin coklat. Hal ini

terjadi karena tidak terjadinya oksidasi pada golongan senyawa terpenoid melalui

pembentukan ikatan rangkap terkonjugasi sehingga tidak terlihatnya cincin coklat.

Gambar reaksi terpenoid dengan pereaksi Lieberman-Burchard dapat dilihat pada

Gambar 8.


48/125

34

34

OH

-HOAc

O

O

H

-HOAc

H

- HA B

+

H

Ac2O H

H

adisi elektrofilik

- H

- H

- H

i

Gambar 8. Reaksi Terpenoid dengan Pereaksi Lieberman-Burchard (Setyowati et

al , 2014)

Tanin merupakan suatu senyawa fenol yang memiliki berat molekul besar

yang terdiri dari gugus hidroksi dan beberapa gugus yang bersangkutan seperti

karboksil untuk membentuk kompleks kuat yang efektif dengan protein dan beberapa

makromolekul. Tanin terdiri dari dua jenis yaitu tanin terkondensasi dan tanin

terhidrolisis. Kedua jenis tanin ini terdapat dalam tumbuhan, tetapi yang paling

dominan terdapat dalam tanaman adalah tanin terkondensasi (Hayati et al , 2010).

Hasil positif pada identifikasi tanin dengan menggunakan larutan gelatin 1% yang

mengandung natrium klorida akan menunjukan terbentuknya endapan putih (Tiwari

et al , 2011). Pada uji tanin yang dilakukan pada ekstrak daun gaharu diperoleh

hasil positif, adanya tanin akan mengendapkan protein pada gelatin. Tanin

bereaksi dengan gelatin membentuk kopolimer mantap yang tidak larut dalam

air. Reaksi ini lebih sensitif dengan penambahan NaCl untuk mempertinggi

penggaraman dari tanin-gelatin (Marliana et al , 2005). Gambar reaksi tanin dan

gelatin dapat dilihat pada Gambar 9.


49/125

35

35

OHO

OH

OH

OH

Tanin

+ CH

O

C

O

CH2 NHC

O

N

N

C

O

CH

CH2

CH2

C

O

O

C

O

CH2 NHC

O

CH

CH2

CH2

C

NH2

NH2

NH

NHC

O

NC

O

CH2 NHC

O

CH NH

CH3

Gelatin

CH

O

C

O

CH2 NHC

O

N

N

C

O

CH

CH2

CH2

C

O

O

C

O

CH2 NH

C

O

CH

CH2

CH2

C

NH2

NH2

NH

NC

O

NC

O

CH2 NC

O

CH NH

CH3

HO

O

OH

HO OH

HO

O

OH

HO OH

H

HO

O

OHHO

OH

Gambar 9. Reaksi Tanin dan Gelatin (Sa’adah, 2010)

Golongan flavonoid dapat digambarkan sebagai deretan senyawa C6- C3-C6.

Artinya kerangka karbonnya terdiri atas dua gugus C6 (cincin benzene tersubstitusi)

yang disambungkan oleh rantai alifatik tiga-karbon. Flavonoid mencakup banyak

pigmen yang paling umum dan terdapat pada seluruh dunia tumbuhan mulai dari

fungus sampai angiospermae. Pada tumbuhan tingkat tinggi, flavonoid terdapat baik

dalam bagian vegetatif maupun dalam bunga. Flavonoid terutama berupa senyawa

yang larut dalam air. Bahan aktif tersebut dapat diektraksi dengan etanol 70%

(Yunita et al , 2009). Pada uji flavonoid yang dilakukan pada ekstrak daun gaharu

diperoleh hasil positif, dimana terjadinya perubahan warna larutan menjadi kuning

intensif setelah ditambahkan larutan NaOH dan warna kuning akan menghilang jika

ditambahkan asam encer. Flavonoid yang bereaksi dengan NaOH akan membentuk

senyawa kuinoid sehingga terjadi perubahan warna menjadi kuning. Warna kuning

tersebut disebabkan karena pembentukan struktur kinoid yang mengandung ikatan

rangkap terkonjugasi yang lebih panjang dan planar sehingga dapat berfluorosensi

(Alfian & Susanti, 2012). Gambar reaksi flavonoid dan NaOH dapat dilihat pada

Gambar 10.


50/125

36

36

O

O

OH

NaOH

O

O

O Kinoid

Gambar 10. Reaksi Flavonoid dengan NaOH (Mulyani & Laksana, 2011)

Fenol adalah senyawa dengan gugus OH yang terikat pada cincin aromatik

(Fessenden & Fessenden, 1986). Fenol sederhana berupa zat padat tanpa warna,

mudah teroksidasi dan warnanya berubah menjadi gelap. Bersifat asam lemah karena

adanya gugus hidroksi (OH) sekurangnya satu gugus hidroksi (Robinson, 1995).

Pada uji fenol yang dilakukan pada ekstrak daun gaharu diperoleh hasil positif,

dimana terjadinya perubahan warna larutan menjadi hitam kebiruan setelah

ditambahkan dengan pereaksi FeCl3. Gambar reaksi fenol dengan FeCl3 dapat dilihat

�

AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA...

Documents

Transcript of AKTIVITAS EKSTRAK ETANOL DAUN GAHARU (Aquillaria microcarpa Baill.) TERHADAP TES TOLERANSI GLUKOSA...