ADLN Perpustakaan Universitas Airlanggarepository.unair.ac.id/25773/1/MPK 86 - 12 Nin p.pdf ·...

PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM KITINASE DARI

CAIRAN DIGESTIVE GLAND Achatina fulica

SKRIPSI

DWI RESTI NINGRUM

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS AIRLANGGA 2012

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

Skripsi Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica Dwi Resti Ningrum

ii

PURIFIKASI PARSIAL DAN KARAKTERISASI ENZIM KITINASE DARI

CAIRAN DIGESTIVE GLAND Achatina fulica

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains

Bidang Kimia pada Fakultas Sains Dan Teknologi

Universitas Airlangga

Disetujui Oleh :

Pembimbing I

Dr. Afaf Baktir, MS NIP. 19561014 19833 2 001

Pembimbing II

Dr. Purkan, M.Si NIP. 19721116 199702 1 001



iii

LEMBAR PENGESAHAN NASKAH SKRIPSI

Judul : Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Dysgetive Gland Achatina fulica Penyusun : Dwi Resti Ningrum Nim : 080810524 Pembimbing I : Dr. Afaf Baktir, MS Pembimbing II : Dr. Purkan, M.Si Tanggal Seminar : 23 Juli 2012

Disetujui oleh :

Pembimbing I,

Dr. Afaf Baktir, MS NIP. 19561014 19833 2 001

Pembimbing II

Dr. Purkan, M.Si NIP. 19721116 199702 1 001

Mengetahui: Ketua Departemen Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga

Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA

NIP. 19671115 199102 2 001



iv

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penyusun dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina fulica”. Penyusun menyadari bahwa penulisan proposal ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak, untuk itu penyusun menyampaikan terima kasih kepada:

1. Ibu Dr. Afaf Baktir, MS selaku pembingbing I dan Bapak Dr. Purkan, M.Si selaku pembingbing II yang telah memberikan saran, doa dan bimbingan sampai terselesaikan proposal ini.

2. Bapak Drs. Handoko Darmokoesomo, DEA selaku Dosen Wali yang senantiasa membimbing serta memberikan banyak masukan.

3. Ibu Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA selaku Ketua Departemen Kimia sekaligus ketua prodi S-1 kimia yang senantiasa memberikan dukungan.

4. Bapak, ibu dan adik-adik yang memberikan kasih sayang, doa, kepercayaan, dan dukungan baik secara moril maupun materi.

5. Teman – teman angkatan 2008 yang senantiasa menemani dalam menuntut ilmu.

Penyusun menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan, sehingga penyusun mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi perbaikan skripsi ini selanjutnya. Penyusun berharap skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya ilmu biokimia.

Surabaya, Juli 2012 Penyusun

Dwi Resti Ningrum



v

Ningrum, Dwi Resti, 2012, Purifikasi Parsial dan Karakterisasi Kitinase dari Cairan Digestive Gland Achatina Fulica, SKRIPSI, dibawah bimbingan Dr. Afaf Baktir, MS dan Dr. Purkan, M.Si, Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya

ABSTRAK

Ekstrak enzim dari digestive gland Achatina fulica diketahui mengandung berbagai jenis enzim hidrolase, salah satunya kitinase. Kitinase memiliki banyak kegunaan dalam berbagai bidang industri, diantaranya makanan, medis dan pertanian. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan pemurnian parsial ekstrak enzim kitinase dari digestive gland Achatina fulica menggunakan aseton. Optimasi prosentase aseton dilakukan untuk mendapatkan fraksi dengan aktivitas spesifik tertinggi. Aktivitas spesifik kitinase sesudah fraksinasi dibandingkan dengan ekstrak tanpa fraksinasi. Aktivitas spesifik yang paling banyak terkumpul ada pada fraksi 45-70. Terdapat peningkatan aktivitas spesifik sebesar 6,45 kali dari ekstrak sebelum difraksinasi. Fraksi ini memiliki suhu optimum pada 37o C dan pH optimum 7. Kata kunci: Achatina fulica, kitinase, fraksinasi aseton, pemurnian enzim



vi

Ningrum, Dwi Resti, 2012, Partial Purificaton And Characterization Chitinase Enzyme From Digestive Gland Fluids Of Achatina fulica, SKRIPSI, under Guidance Dr. Afaf Baktir, MS and Dr. Purkan, M.Si, Department of Chemistry, Sains and Technology Faculty, Airlangga University, Surabaya

ABSTRACT

The Enzyme from the digestive gland extracts of Achatina fulica is known contain various types of hydrolase enzymes, one of them is chitinase. Chitinase has many benefit for various industries, they are including food, medicine and agriculture. The objective of reseach to perform a partial purification chitinase enzyme of digestive gland extract of Achatina fulica using acetone. Optimization of the percentage acetone carried out to obtain the highest specific activity from each fraction. Chitinase specific activity after fractination is compared to extracts without fractionation. Specific activity of the most collected there in 45-70 fraction. There is an increase of 6.45 times the specific activity of without fractionation. This fraction has a temperature optimum at 37oC and optimum pH 7.

Keyword : Achatina fulica, chitinase, acetone fractionation, purification enzyme



vii

DAFTAR ISI

Halaman

KATA PENGANTAR ............................................................................................... iv

ABSTRAK ................................................................................................................. v

ABSTRACT ............................................................................................................... vi

DAFTAR ISI .............................................................................................................. vii

DAFTAR TABEL ...................................................................................................... ix

DAFTAR GAMBAR……………………………………………………………… x

BAB I PENDAHULUAN .......................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 4 1.3 Tujuan Penelitian ..................................................................................... 4 1.4 Manfaat Peneltian..................................................................................... 5

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ................................................................................ 7 2.1 Enzim ....................................................................................................... 7 2.1.1 Struktur enzim ................................................................................. 8 2.1.2 Mekanisme kerja enzim .................................................................. 8 2.2 Kitinase……………………………………………………………….. .. 9 2.2.1 Tinjauan Umum Kitinase ............................................................... 9 2.2.2 Pengukuran Aktivitas Kitinase ........................................................ 12 2.3 Metode Pemurnian Enzim ........................................................................ 13 2.3.1 Fraksinasi aseton ............................................................................. 13 2.3.2 Fraksinasi Amonium sulfat ............................................................. 15 2.3.3 Kromatografi ................................................................................... 16 2.3.3.1 Kromatografi penukar ion ............................................................ 16 2.3.3.2 Kromatografi afinitas ................................................................... 17 2.3.3.3 Kromatografi filtrasi..................................................................... 17 2.3.3.4 Kromatografi hidrofob ................................................................. 17 2.4 Koloidal Kitin........................................................................................... 18 2.6 Bekicot (Achatina fulica) ......................................................................... 19 2.7 Turbidimetri ............................................................................................. 21



viii

BAB III M ETODE PENELTIAN .............................................................................. 22 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian .................................................................. 22 3.2 Alat dan Bahan Penelitian ........................................................................ 22 3.2.1 Alat-alat penelitian .......................................................................... 22 3.2.2 Bahan-bahan penelitian ................................................................... 22 3.3 Diagram Alir Penelitian ........................................................................... 23 3.4 Prosedur Penelitian................................................................................... 23 3.4.1 Pembuatan substrat koloidal kitin ................................................... 23 3.4.2 Karantina Achatina fulica ............................................................... 24 3.4.3Panen cairan digestive gland Achatina fulica .................................. 24 3.4.4 Pembuatan Kurva Progres ............................................................... 24 3.4.5 Pembuatan kurva standar koloidal kitin .......................................... 24 3.4.6 Optimasi fraksinasi asteon ekstrak kasar enzim kitinase ................ 25 3.4.7 Penentuan kadar protein .................................................................. 25 3.4.8 Uji Aktivitas setiap fraksi hasil fraksinasi aseton ........................... 26 3.4.9 Karakterisasi enzim kitinase ........................................................... 27 3.4.9.1 Suhu optimum ........................................................................... 27 3.4.9.2 pH optimum .............................................................................. 27 BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Pembuatan substrat koloidal kitin ...................................................... 28 4.2 Karantina Achatina fulica .................................................................. 29 4.3 Panen cairan digestive gland Achatina fulica .................................... 30 4.4 Pembuatan Kurva Progres .................................................................. 31 4.5 Pembuatan kurva standar koloidal kitin ............................................. 32 4.6 Optimasi fraksinasi asteon ekstrak kasar enzim kitinase ................... 33 4.7 Penentuan kadar protein ..................................................................... 35 4.8 Uji Aktivitas setiap fraksi hasil fraksinasi aseton .............................. 35 4.9 Karakterisasi enzim kitinase .............................................................. 40 4.9.1 Suhu optimum .............................................................................. 40 4.9.2 pH optimum ................................................................................. 42 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan ........................................................................................ 43 5.2 Saran ................................................................................................... 43 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ 44 LAMPIRAN



ix

DAFTAR TABEL

Nomor Judul Tabel Halaman

1. Uji aktivitas kitinase hasil fraksinasi percobaan 1 ...... 37






x

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Gambar Halaman

1. Struktur protein primer, sekunder, tersier dan kuartener ..................... 7

2. Model Lock and Key ............................................................................ 9

3. Model Induced Fit ................................................................................ 9

4. Mekanisme kerja enzim eksokitinase dan endokitinase .................... 10

5. Struktur kitin ....................................................................................... 12

6. Agregasi protein akibat interaksi muatan berlawanan dari protein satu dengan protein lain ......................................................... 14

7. Denaturasi protein akibat pelarut organik .......................................... 15

8. Molekul air di sekitar permukaan hidrofobik protein ........................ 16

9. Anatomi bekicot ................................................................................. 19

10. Kurva progres ekstrak kitinase .......................................................... 31

11. Kurva standar koloidal kitin ................................................................ 32

12. Mekanisme kerja enzim kitinase

terhadap polimer N-asetilglukosamin ................................................. 36

13. Suhu optimum fraksi 45-70 ................................................................ 41

14. pH optimum fraksi 45-70 .................................................................... 42



2221

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Indonesia merupakan negara yang memiliki keanekaragaman flora dan

fauna. Hal ini disebabkan oleh kondisi iklim Indonesia yang tropis, sehingga

cocok untuk banyak jenis flora dan fauna untuk berkembang biak. Salah satu

hewan yang tingkat perkembangbiakannya tinggi adalah Achatina fulica

(bekicot).

Achatina fulica dianggap sebagai hama yang dapat menurunkan kualitas

produk panen. Meskipun demikian, Achatina fulica dapat dimanfaatkan untuk

makanan dan obat tradisional karena khasiatnya. Namun belum banyak penelitian

yang memanfaatkan cairan kelenjar saluran pencernaan (digestive gland) Achatina

fulica. Wheel (1961) menyatakan bahwa ekstrak kelenjar saluran pencernaan

(digestive gland) Achatina fulica memiliki campuran enzim karbohidrase,

meliputi enzim kitinase, xilanase, selulase, hemiselulase, amilase, maltase, dan

sukrase. Namun sejauh ini, informasi tentang karakteristik tiap enzim tersebut

masih belum dilaporkan, termasuk karakteristik kitinase.

Kitinase adalah salah satu enzim yang menarik untuk dikaji, karena

memilki kemampuan untuk menghidrolisis kitin menjadi oligomernya yang

selama ini dimanfaatkan dalam berbagai bidang. Senyawa oligomer tersebut

banyak dimanfaatkan untuk bidang medis dan makanan (Flach dkk., 1992).

Kitinase menghidrolisis kitin menjadi senyawa oligomer kitin, seperti



2

karboksimetil kitin, hidroksietil kitin dan etil kitin. Dalam bidang medis,

senyawa-senyawa tersebut dapat digunakan sebagai bahan dasar pembuatan

benang operasi, yang mempunyai keunggulan dapat diserap dalam jaringan tubuh,

tidak toksik dan dapat disimpan dengan waktu yang lama. Monomer lain dari kitin

yaitu N-asetil-D-glukosamin, dapat dimanfaatkan dalam bidang farmasi, obat

pengontrol kadar gula dalam darah, suplemen, anti inflamasi dan sebagainya

(Herdyastuti dkk., 2009).

Dalam bidang lingkungan, kitinase dimanfaatkan untuk penanganan

limbah yang mengandung kitin, seperti pabrik pembekuan udang. Apabila limbah

udang dibiarkan mencemari perairan dapat meningkatkan BOD dan COD yang

menyebabkan pencemaran lingkungan yang lebih luas. Kitinase menjadi perhatian

besar, terutama karena peranannya dalam hidrolisis jamur patogen. Enzim kitinase

banyak digunakan untuk pengendalian hayati (Sahai dan Manocha, 1993).

Kitinase sering dimanfaatkan sebagai agen biokontrol, terutama tanaman yang

terserang jamur patogen. Jamur memiliki komponen utama penyusun dinding sel,

salah satunya adalah kitin yang dapat dihidrolisis oleh kitinase. Dalam dua dekade

terahir banyak dikaji mengenai enzim kitinase sebagai antifungi. Sebagai contoh,

kitinase dari Tricodema banyak digunakan sebagai antifungi yang efektif terhadap

serangan Rhizoctonia solani pada tanaman kapas dan Fusarium pada tanaman

strawberi (Wang dkk., 2003).

Kitinase juga berperan dalam lisisnya biofilm jamur patogen Candida

albicans. Biofilm adalah matriks polimer ekstraseluler yang terbentuk dari suatu

komunitas mikroba terstruktur dan memiliki fenotip yang berbeda dari plantonik



3

dan sel bebasnya (Douglas, 2006). Dinding sel Candida albicans mengandung β-

1,3-glukan, β-1,6-glukan dan kitin (Marti´nez dkk., 1998). Berdasarkan penelitian

yang sudah dilakukan Kamiliyah (2011), ekstrak enzim Achatina fulica memiliki

daya hambat yang lebih tinggi terhadap biofilm Candida albicans jika

dibandingkan dengan perlakuan ekstrak kayu manis yaitu sebesar 22,81%. Dari

hasil penelitian tersebut, diketahui bahwa ekstrak enzim Achatina fulica mampu

meningkatkan efektivitas daya antifungi ekstrak kayu manis terhadap Candida

albicans sebesar 75%. Hasil ini menunjukkan bahwa di dalam ekstrak enzim siput

mengandung enzim-enzim yang mampu menghidrolisis biofilm maupun dinding

sel Candida albicans.

Suatu enzim yang diambil dari alam masih bercampur dengan pengotor

lain. Untuk mengurangi atau menghilangkan pengotor tersebut melalui cara

pemurnian. Pemurnian dilakukan untuk meningkatkan aktivitas spesifik dari suatu

enzim. Aseton merupakan salah satu pelarut organik yang biasa digunakan dalam

pemurnian enzim. Di samping pelarut organik, pemurnian juga dapat dilakukan

dengan fraksinasi dengan amonium sulfat. Kelebihan fraksinasi aseton dibanding

dengan fraksinasi amonium sulfat adalah tidak perlu adanya perlakuan yang rumit

untuk menghilangkan garam yang tersisa. Dalam hal ini, fraksinasi aseton

dilakukan pada suhu -20oC (Thermo Fisher Scientific, 2009).

Enzim industri biasanya digunakan dalam keadaan kemurnian parsial.

Enzim kitinase pada penelitian ini akan dimurnikan secara parsial dari ekstrak

enzim Achatina fulica. Enzim ini akan diuji aktivitasnya dan ditentukan suhu dan



4

pH optimumnya dalam keadaan murni parsial untuk tujuan aplikasi dalam kondisi

kemurnian parsial.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka dibuat rumusan

masalah sebagai berikut.

1. Pada fraksi manakah aktivitas kitinase pada ekstrak enzim dari

digestive gland Achatina fulica terkumpul pada proses fraksinasi

aseton ?

2. Berapakah peningkatan kemurnian ekstrak enzim kitinase setelah

difraksinasi dengan aseton ?

3. Bagaimana karekteristik terkait dengan pH dan suhu optimum ekstrak

enzim kitinase dari Achatina fulica ?

1.3 Tujuan

Tujuan dari penelitian ini adalah melakukan pemurnian parsial ekstrak

enzim kitinase digestive gland Achatina fulica menggunakan aseton.

Adapun tujuan khusus dari penelitian ini adalah sebagai berikut.

1. Menentukan fraksi aseton yang optimum dari fraksinasi aseton.

2. Menghitung peningkatan kemurnian ekstrak enzim kitinase setelah

fraksinasi aseton.

3. Menentukan karakteristik terkait pH dan suhu optimum enzim

kitinase dari Achatina fulica.



5

1.2 Manfaat

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah tentang

aktifitas enzim kitinase setelah dimurnikan secara parsial menggunakan fraksinasi

aseton. Selain itu, penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi tentang

karakteristik enzim kitinase terkait pH dan suhu optimum. Dengan enzim kitinase

dari digestive gland Achatina fulica dapat digunakan untuk berbagai macam

kebutuhan industri.



6

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Enzim

Enzim merupakan unit fungsional yang termasuk dalam protein dari

metabolisme sel yang disusun oleh rantai-rantai polipeptida. Enzim berfungsi

untuk mempercepat reaksi spesifik tanpa pembentukan produk samping. Enzim

tidak mengubah titik kesetimbangan reaksi yang dikatalisis. Enzim memilki berat

molekul yang berkisar dari 12.000 sampai lebih dari 1 juta. Enzim memilkiki

spesifitas terhadap substrat. Substrat adalah substansi yang mengalami perubahan

kimia setelah bereaksi dengan enzim, sedangkan produk adalah substansi baru

yang terbentuk setelah setelah reaksi (Voet dan Voet, 2004).

Enzim mengikat molekul substrat membentuk kompleks enzim-substrat

yang bersifat sementara, yang terurai membentuk enzim bebas dan produknya.

Enzim menyebabkan berlangsungnya reaksi kimia dengan mengarahkan subtrat

ke sisi katalitik. Aktifitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu pH,

konsentrasi substrat dan enzim, adanya aktivator dan inhibitor (Lehninger, 1998).

Reaksi enzimatis hanya bekerja pada suhu dan pH tertentu (Stryer, 2002).

2.1.1 Struktur enzim

Enzim merupakan protein globular yang memilki struktur primer,

sekunder, tersier, dan kuartener. Struktur primer terbentuk dari ikatan kovalen

antar residu-residu asam amino yang berurutan membentuk ikatan peptida.

Struktur sekunder terbentuk dari ikatan hidrogen antara atom O dari gugus

Struktur primer

6



7

karbonil (C=O) dengan atom H (N-H) dalam satu rantai polipeptida. Dalam

struktur sekunder, struktur protein dibagi menjadi dua yaitu β-sheet dan heliks

(Bondanszky, 1998).

Gambar 2.1 Struktur protein primer, sekunder, tersier dan kuartener

Struktur tersier merupakan struktur protein yang paling stabil, karena

terdapat ikatan yang dapat menstabilkan protein itu sendiri. Jenis ikatan-ikatan

tersebut adalah: ikatan hidrogen antara gugus R residu asam amino rantai samping

yang berdekatan, ikatan ion diantara gugus R yang berlawanan, interaksi

hidrofobik dari gugus R asam amino hidrofobik dan ikatan kovalen berupa ikatan

disulfida dari sistein (Ottoway dan Apps, 1984)

Struktur kuartener terbentuk karena adanya interaksi beberapa rantai

polipeptida yang membentuk oligomer. Oligomer berinteraksi kembali melalui

ikatan ionik, van der waals dan ikatan hidrofobik (Bodanszky, 1998).

Struktur primer

Asam amino

Struktur sekunder

Ikatan hidrogen Ikatan hidrogen

Struktur tersier

Struktur kuartener

Struktur primer



8

2.1.2 Mekanisme kerja enzim

Proses awal katalisis enzim adalah pembentukan kompleks antara enzim

dan substrat. Substrat diikat pada daerah yang dinamakan sisi aktif enzim. Reaksi

kimia yang terjadi dalam kompleks enzim substrat tersebut dapat dilanjutkan

dengan pelepasan produk dan enzim.

Mekanisme katalisis enzim melibatkan gugus fungsi yang terdapat pada

sisi aktif enzim. Sisi aktif enzim adalah tempat pengikatan substrat yang

mengandung residu asam amino yang berperan dalam pembuatan dan pemutusan

ikatan selama proses katalisis. Ikatan – ikatan yang terjadi antara enzim dan

substrat adalah ikatan elektrostatik, ikatan hidrogen, gaya Van Der Walls ataupun

interaksi hidrofobik. Gugus yang terlibat dalam proses pengikatan substrat disebut

gugus pengikat (binding group). Gugus yang terlibat dalam proses katalitik antara

enzim dan substrat disebut gugus katalitik (catalytic group). Gugus katalitik

terletak pada gugus samping enzim (Poedjiadi, 1994).

Terdapat dua model interaksi enzim dan substrat, yaitu :

1. Model Lock and Key : dikemukakan oleh Emil Fischer. Pada model ini,

substrat memiliki daerah polar (- dan +) dan non polar (H, hidrofobik)

diletakkan pada sisi aktif yang memiliki muatan komplementer dari substrat

tersebut. Model Lock and Key menerangkan adanya kesesuaian ukuran atau

bentuk substrat terhadap sisi aktif enzim. Substrat yang tidak cocok bentuknya

dengan sisi aktif enzim, baik karena terlalu besar maupun karena terlalu kecil

tidak dapat terikat pada sisi aktif (Marks, 1996).



9

2. Pada model Induced Fit : dikemukakan oleh Koshland. Pada model ini,

senyawa-senyawa yang lebih besar atau lebih kecil dari substrat yang asli

masih dapat berinteraksi dengan sisi aktif enzim. Sisi aktif yang pada awalnya

belum sesuai dengan bentuk substrat, akan terinduksi dan menyesuaikan

dengan bentuk substrat setelah substrat menempel pada sisi aktif. Sehingga

sisi aktif bersifat fleksibel (Marks, 1996).

Gambar 2.2 Model Lock and Key (Marks, 1996). E merupakan simbol untuk

enzim, S merupakan simbol dari substrat dan P merupakan simbol untuk produk.

Gambar 2.3 Model Induced Fit (Marks, 1996). E merupakan simbol untuk

enzim, S merupakan simbol dari substrat dan P merupakan simbol untuk produk.

2.2 Kitinase

2.2.1 Tinjauan umum kitinase

Kitinase adalah enzim yang penting digunakan untuk produksi

oligosakarida fisiologis aktif dari berbagai kitin dan kitosan (Flach,1992).

Oligomer ini memiliki banyak aplikasi medis, dan juga dapat digunakan sebagai

pengawet makanan (Flach,1992). Nama kimia dari kitinase adalah {Poli [1,4-(N-

acetyl-β-Dglukosamin)] glucanohidrolase}(Fleuri dkk., 2009).



10

Enzim kitinase dihasilkan oleh bakteri, fungi, tanaman, dan hewan

(Toharisman, 2007). Kitinase juga disintesis oleh protozoa, saluran pencernaan

nematode, polikhaeta dan mollusca. Kitinase juga ditemukan dalam lendir

pencernaan burung-burung pemakan seranga, lendir pencernaan dan pangkreas

ikan, amfibi dan reptil pemakan serangga (Yurnaliza, 2002). Bakteri

mengeluarkan kitinase sebagai sarana memperoleh nutrisi dan agen parasitisme,

sementara fungi, protozoa dan invertebrata mengeluarkan enzim tersebut untuk

proses morfogenesis. Tanaman mengeluarkan kitinase untuk mempertahankan diri

dari serangan patogen (Toharisman, 2007).

Menurut Harman dkk. (1993) dan Manocha (1993) kitinase terbagi dalam

tipe endokitinase dan eksokitinase.

Gambar 2.4 Mekanisme kerja enzim eksokitinase dan endokitinase (Sahai & Manocha, 1993).

Aplikasi kitinase yang banyak digunakan adalah sebagai agen biokontrol.

Telah dilaporkan Brurberg dkk. (1996), bahwa ChiA dan ChiB Serratia

marcescens yang telah ditransformasikan ke E.coli memiliki kemampuan untuk

GIcNAc mikrofibril kitin ujung nonreduksi ujung reduksi lokasi hidrolisis

eksokitinase

endokitinase



11

mengontrol jamur tanaman yang bersifat patogen, sebagai contoh adalah dapat

mengurangi penyakit dari Rhizoctonia solani yang menyebabkan akar tebu

membusuk.

Senyawa- senyawa hasil degradasi kitinase pada kitin membentuk

oligomernya seperti karboksimetil kitin, hidroksietil kitin dan etil kitin. Dalam

bidang medis, senyawa-senyawa tersebut digunakan sebagai bahan dasar

pembuatan benang operasi yang memilki keunggulan dapat diserap dalam

jaringan tubuh, tidak toksik dan dapat disimpan dengan waktu yang lama.

Monomer kitin, N-asetil-D-glukosamin dapat dimanfaatkan untuk obat pengontrol

darah dan suplemen anti inflamasi. Selain itu, N-asetil-D-glukosamin dapat

membantu mengurangi hiperpigmentasi aktivitas enzim tirosin yang berperan

dalam produksi melanin.

Kitinase menghidrolisis substansi yang mengandung senyawa kitin. Kitin

dibangun oleh unit-unit monomer N-asetilglukosamin (GlcNAc) yang tersusun

liniar dengan ikatan β (1,4). Rantai kitin antara satu dengan yang lainnya

membentuk ikatan hidrogen antara gugus NH dari satu rantai dan gugus C=O dari

rantai lain yang berdekatan. Ikatan hidrogen ini menyebabkan kitin membentuk

formasi serabut (fibril) dan tidak dapat larut dalam air. Berikut merupakan gambar

unit kitin :



12

Gambar 2.5 Struktur kitin. Satu unit kitin terdiri dari monomer N-asetilglukosamin

Di alam, kitin banyak ditemukan pada sel jamur dan eksoskeleton dari

serangga dan krustasea (Cohen-Kupiec dan Chet, 1998). Kitin pada jamur

berbentuk mikrofibril yang memiliki panjang yang berbeda tergantung pada

spesies dan lokasi selnya. Mikrofibril merupakan struktur utama dari struktur

dinding sel jamur terdiri atas jalinan rantai-rantai polisakarida yang saling

bersilangan membentuk anyaman. Jalinan ini kuat berikatan pada matriks (Cabib,

1987). Dalam hal ini kitinase berperan sebagai penghidrolisis dinding sel jamur

dan matriks jamur patogen.

2.2.2 Pengukuran aktivitas kitinase

Pengukuran aktivitas kitinase dapat dilakukan dengan beberapa cara

seperti yang disebutkan dalam Jeaniaux (1966) dan Cabib (1987) :

a. Berdasarkan pengurangan substrat.

1). Metode viskosimetri, yaitu aktivitas kitinase terhadap kitosan, glikol kitin atau

karboksimetilkitin yang diukur berdasarkan terjadinya pengurangan viskositas

substrat.



13

2). Metode turbidimetri, yaitu mengukur perbedaan turbiditas suspensi koloidal

sebelum dan setelah kitinolisis. Pengukuran ini bersifat cepat dan akurat. Contoh

pada pengukuran aktifitas enzim endokitinase.

b. Berdasarkan pembentukan produk akhir reaksi hidrolilis kitin yaitu GlcNAc.

GlcNAc atau N-asetilglukosamin yang dibebaskan dari kitin ditentukan secara

kolorimetrik dengan p-dimetilaminobenzaldehida. Satu unit aktivitas kitinase

dinyatakan sebagai μmol GlcNAc yang dibebaskan selama 1 jam dalam kondisi

yang ditetapkan.

c. Spectrometer Assay yaitu menggunakan kromogen 3,4, dinitrophenil tetra N-

asetilkhitotetraose.

2.3 Metode Pemurnian Enzim

Ekstrak enzim belum 100 % terdiri atas protein enzim yang diinginkan,

sehingga perlu pemurnian untuk memisahkan dari pengotor. Pemurnian dapat

dilakukan dengan beberapa cara yaitu : pengendapan protein melalui fraksinasi

dengan amonium sulfat atau pelarut organik dan kromatografi (Scopes, 1994).

Adapun metode kromatografi terdapat berbagai macam, diantaranya kromatografi

penukar ion, afinitas, filtrasi, dan hidrofob.

2.3.1 Fraksinasi aseton

Fraksinasi aseton merupakan salah satu metode pemurnian enzim secara

parsial dengan menggunakan pelarut organik. Prinsip pemurnian parsial dengan

pelarut organik adalah molekul hidrofobik pada enzim akan berkurang pada saat

penambahan pelarut organik. Pelarut organik mengimobilisasi parsial molekul air

dari protein. Molekul air di sekitar permukaan hidrofobik protein digantikan oleh



14

molekul pelarut organik. Pada fakta penelitian menggunakan fraksinasi dengan

pelarut organik, disimpulkan bahwa aseton sesuai digunakan untuk pemurnian

protein.

Gambar 2.6 Agregasi protein akibat interaksi muatan berlawanan dari molekul protein satu dengan molekul protein lain

(Scopes, 1994)

Faktor utama penyebab agregasi molekul protein oleh aseton adalah

ikatan elektrostatik dan kekuatan dipolar. Keberadaan aseton dalam larutan

protein menyebabkan agregasi antara muatan yang berlawanan dari permukaan

molekul protein satu dan protein yang lain. Proses presipitasi dengan pelarut

organik terjadi pada keadaan elektrostatik protein. Molekul protein besar akan

lebih mudah beragregasi karena memiliki perbedaan muatan yang tinggi. Molekul

yang besar akan segera teragregasi karena terjadi perubahan yang besar dari

muatan permukaan protein satu dengan protein yang lain.

bagian hidrofob

pelarut organik



15

Dalam fraksinasi aseton, suhu harus di bawah 0oC pada saat sampel

preparasi maupun pada saat fraksinasi. Pada suhu di atas 10oC, protein mengalami

denaturasi.

Gambar 2.7 Denaturasi protein akibat pelarut organik (Scopes, 1994)

Pada saat temperatur tinggi, molekul dari pelarut organik masuk ke dalam

protein melalui permukaannya, kemudian berinteraksi dengan residu hidrofobik

dari protein. Interaksi tersebut menyebabkan protein mengalami denaturasi.

2.3.2 Fraksinasi amonium sulfat

Fraksinasi amonium sulfat merupakan salah satu teknik pemurnian protein

yang biasa dilakukan. Pemurnian dengan metode ini menggunakan prinsip

agregasi protein molekul bagian permukaan hidrofobik dari protein.

Molekul pelarut organik berinteraksi dengan residu

hidrofob

Interaksi hidrofob internal

Kestabilan struktur saat suhu naik

Gangguan akibat interaksi hidrofob

Denaturasi



16

Gambar 2.8 Molekul air di sekitar permukaan hidrofobik protein (Scopes, 1994)

Pada saat ion garam terlarut, akan mengurangi pelarut air yang terdapat di

antara bagian hidrofobik molekul-molekul protein, sehingga molekul air tersebut

menjadi berkurang. Hal ini karena ion garam menarik molekul air yang berada di

sekitar bagian hidrofobik. Bagian permukaan hidrofobik protein satu akan

berikatan dengan bagian permukaan hidrofobik yang lain, kemudian saling

beragregasi dan protein mengendap (Scopes, 1994).

2.3.3 Kromatografi

2.3.3.1 Kromatografi penukar ion

Berdasar muatannya, kromatografi penukar ion dibagi menjadi dua yaitu

penukar kation dan penukar anion. Kromatografi penukar kation menggunakan

penukar kation yang bermuatan negatif, sebagai contoh adalah carboxymethyl-

cellulose (CM-cellulose). Sedangkan penukar anion menggunakan resin penukar

anion yang bermuatan positif, sebagai contoh adalah diethylaminoethyl-cellulose

(DEAE-cellulose). Protein harus memiliki muatan yang berbeda dengan penukar

Bagian hidrofob dari protein

Molekul air



17

ionnya. Penambahan Tris-Cl meningkatkan kekuatan ion pada bufer yang

mengalir pada kolom kromatografi (Scopes, 1994).

2.3.3.2 Kromatografi afinitas

Prinsip kromatografi afinitas adalah ligan terimobilisasi pada kolom.

Sampel protein yang dilewatkan pada kolom, akan terjadi interaksi spesifik antara

protein target dengan ligan, yang menyebabkan protein target dapat terpisah dari

protein pengotor. Ligan berikatan kovalen dengan backbone matrix. Hanya enzim

dengan afinitas spesifik yang akan terikat pada adsorben melalui interaksi dengan

ligannya (Scopes, 1994).

2.3.3.3 Kromatografi filtrasi

Pemisahan dengan metode kromatografi filtrasi didasari oleh ukuran

molekul protein dan perbedaan ukuran material pembatas pada matriks. Matriks

yang biasa digunakan adalah selulosa dan dekstran. Molekul protein berukuran

kecil akan terperangkap di dalam matiks, sedangkan molekul yang lebih besar dari

ukuran matriks akan bebas dan keluar dari kolom kromatografi (Scopes, 1994).

2.3.3.4 Kromatografi hidrofob

Interaksi rantai alifatik pada adsorben dan kesamaan bagian hidrofob

permukaan protein. Dalam kromatrografi hidrofobik, agregasi terjadi antara

bagian hidrofob protein dan ligan terimobilisasi pada adsorben. Rantai alifatik

yang cocok digunakan sebagai adsorben adalah C4, C6, C 8, dan C 10, serta rantai

yang mengandung gugus amino terminal.



18

Interaksi protein dengan adsorben hidrofobik adalah sebuah ikatan

hidrogen atau ikatan elektrostatik. Kekuatan ikatan hidrogen menentukan

kekuatan interaksi hidrofobik. Jika dibandingkan dengan kromatografi penukar

ion, pemisahan protein menggunakan kromatografi hidrofobik akan lebih bagus.

Kolom kromatografi ini terdiri dari selulosa atau dekstran. Kromatografi hidrofob

memiliki kesamaan dengan presipitasi amonium sulfat, yaitu menggunakan

prinsip salting-out (Scopes, 1994).

2.4 Koloidal Kitin

Koloidal kitin adalah kitin yang banyak digunakan sebagai substrat dalam

medium fermentasi. Senyawa ini diperoleh dengan menghidrolisis secara parsial

kitin dengan larutan asam klorida (HCl) 10 N (Chernin dkk., 1995). Untuk

menetralkan kembali kitin yang sudah dihidrolisis dengan HCl 10 N, ditambahkan

NaOH 10 N.

2.5 Achatina fulica

Achatina fulica merupakan bekicot asli dari Afrika Timur. Berbagai nama

sebutan untuk Achatina fulica diantaranya adalah Giant African Snail (GAS),

Agate snail, Schnecke, African snail, African giant, Kalutara, Caracol gigante

africano, Acatina africana, Gran caracol africano, Escargot géant africain,

Achatine de Madagascar (FAO, 1989).

Berikut ini merupakan klasifikasi Achatina fulica (Wallace, 2002)

Kingdom : Animalia

Phylum : Mollusca

Class : Gastropoda



19

ginjal

Order : Pulmonata

Family : Achatinidae

Genus : Achatina

Species : Achatina fulica

Achantina fulica merupakan hewan yang tergabung dalam kelas

gastropoda. Bagian tubuhnya terbagi atas empat bagian utama yaitu kepala, leher,

kaki, serta alat-alat dalam. Kepala Achatina fulica memiliki sepasang tentakel

pendek yang berfungsi sebagai indera pembau dan sepasang tentakel panjang

yang berfungsi sebagai indera penglihatan. Di bawah kepalanya terdapat kelenjar

muksosa yang berfungsi menghasilkan lendir. Anatomi Achatina fulica dapat

dilihat pada gambar berikut :

Gambar 2.9 Anatomi Achatina fulica

Cangkang Achatina fulica berfungsi sebagai rumah atau pelindung badan

untuk mempertahankan diri dari musuh (Santoso, 1989). Achatina fulica berjalan

menggunakan otot perutnya. Pada saat kondisi lembab atau basah, Achatina fulica

mata

tentakel

mulut

ganglia otak tali saraf tembolok

hati

lambung insang mata

ginjal

digestive gland

kaki

gonad



20

akan aktif. Sedangkan pada kondisi lingkungan yang kering, Achatina fulica

cenderung bersembunyi di bawah permukan tanah atau di dalam cangkangnya.

Hasil panen berupa daun atau bunga merupakan makanan yang cocok bagi

perkembangan Achatina fulica. Achatina fulica hidup di kondisi tanah yang bersih

dari sampah anorganik. Achatina fulica merupakan hewan invertebrata yang

hemaprodit. Achatina fulica bertelur pada saat usia satu tahun. Dalam kondisi

optimum, Achatina fulica dapat bertelur hingga empat kali dalam setahun (Mead,

1979).

Ekstrak enzim merupakan gabungan beberapa enzim yang melakukan

aktivitas bersama akan tetapi masing-masing enzim yang tergabung didalamnya

tetap berdiri sendiri. Achatina fulica yang berasal dari eropa timur (Helix pomatia)

dilaporkan memiliki kandungan ekstrak enzim yang terdiri dari enzim β-1,3-

glukanase, enzim β-1,4-glukanase dan kitinase (Gabriel dan Kopecka, 1987).

Helix pomatia dan Achatina fulica memiliki kesamaan dalam makanan yang

dikonsumsi yaitu berupa dedaunan atau batang pohon yang mengandung glukan,

selulosa, dan kitin (Kay, 1986). Sehingga Achatina fulica juga memiliki enzim

yang terdapat pada Helix pomatia yaitu β-1,3-glukanase, β-1,4-glukanase dan β-

1,4-glukanhidrolase. β-1,3-glukanase. Wheel (1961) menyatakan bahwa ekstrak

kelenjar saluran pencernaan (dygestive gland) Achatina fulica memiliki campuran

enzim karbohidrase yaitu berupa enzim kitinase, xilase, selulase, hemiselulase,

amilase, maltase, dan sukrase. Disamping itu, dygestive gland Achatina fulica

mengandung enzim protease, dan polipeptidase. Enzim kitinase mampu



21

menghidrolisis kandungan kitin yang terdapat dalam biofilm maupun dinding sel

jamur patogen.

2.7 Turbidimetri

Teknik spektroskopi dapat digunakan dalam menentukan struktur molekul

suatu senyawa. Terdapat banyak teknik spektroskopi yang sering digunakan

dalam pengukuran aktivitas enzim diantatanya adalah spektrofotometri UV-Vis

dan turbidimetri (Eisenthal, 2002).

Turbidimetri adalah pengukuran analit secara tidak langsung yang

analisisnya berdasarkan berkas sinar yang diteruskan (seperti spektrofotometri

UV-Vis). Turbidimetri mengukur kekeruhan sebagai sebab terjadinya perubahan

sistem OD. Metode ini digunakan untuk mengukur aktivitas enzim yang kerjanya

menghidrolisis polimer. Prinsip dasar metode turbidimetri adalah jika cahaya

mengenai larutan, maka cahaya tersebut akan dihamburkan. Sedangkan cahaya

yang tidak mengenai larutan akan diteruskan. Jumlah cahaya yang diteruskan

berbanding lurus dengan transmitan, sedangkan cahaya yang dihamburkan

berbanding terbalik dengan transmitan atau berbanding lurus dengan absorbansi

(Kosim, 2010). Turbidimetri mengukur variasi turbiditas suspensi koloidal kitin

selama kitinolisis. Pengukuran ini bersifat cepat dan akurat, contoh pada

pengukuran aktivitas enzim endokitinase.



22222

22

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di laboratorium Biokimia Fakultas Sains dan

Teknologi, Universitas Airlangga, mulai bulan Februari 2012 sampai dengan

bulan Juni 2012.

3.2 Alat dan Bahan Penelitian

3.2.1 Alat-alat penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat

gelas yang biasa digunakan di laboratorium kimia, pHmeter dan termometer.

Sedangkan instrumen yang digunakan adalah timbangan analitik (Ohaus), lemari

pendingin (Toshiba Glasio), lemari pendingin -20oC (Royal), sentrifuga

(Universal 320R Zentrifugen), dan spektrofotometer UV-VIS (Pharmaspec UV-

1700 Shimadzu).

3.2.2 Bahan-bahan penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Achatina fulica,

kitin, akuades, aseton, HCl 10N, NaOH 10N, NaH2PO4.2H2O, asam sitrat,

Na2HPO4.2H2O.



23

3.3 Diagram Alir Penelitian

3.4 Prosedur Penelitian

3.4.1 Pembuatan substrat koloidal kitin

Sebanyak 5 gram kitin yang diperoleh dari laboratorium Kimia Fisik,

Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga. Kitin dilarutkan dalam 100

ml HCl 10 N lalu didiamkan selama 24 jam pada suhu 4oC, kemudian larutan

disaring. Adapun filtrat ditambahkan 50 ml akuades dingin dan 10 N NaOH

Uji aktivitas

Karakterisasi enzim kitinase

Optimasi fraksinasi aseton

Panen cairan disgestive gland Achatina fulica

Perlakuan terhadap Achatina fulica

Karantina Achatina

fulica

Achatina fulica

Kitinase dengan kemurnian parsial

Ekstrak enzim dygestive gland

Achatina fulica

Penentuan kadar protein

Data uji aktivitas Data kadar protein

Data uji aktivitas

Uji aktivitas Penentuan kadar protein

Data kadar protein

fulica

Suhu optimum enzim kitinase

pH optimum enzim kitinase



24

hingga mencapai pH 7. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm

selama 20 menit hingga berbentuk koloid. Selanjutnya, koloid diresuspensi

menggunakan akuades, disentrifugasi selama 15 menit dan disimpan pada suhu

4oC (Rochima, 2006).

3.4.2 Karantina Achatina fulica

Achatina fulica dikarantina dalam kandang yang tidak terkena sinar

matahari langsung. Kelembaban kandang senantiasa dijaga dengan cara memberi

air ke dalam kandang namun tidak terlalu banyak. Achatina fulica diberi makanan

berupa dedaunan dan sayur setiap hari minimal selama satu minggu.

3.4.3 Panen cairan disgetive gland Achatina fulica

Cangkang bagian belakang Achatina fulica dipecah, lalu cairan yang

keluar ditampung. Cairan digestive gland Achatina fulica yang sudah ditampung,

disentrifugasi dengan kecepaatan 4000 rpm. Jika terdapat endapan dan supernatan,

maka supernatan merupakan crude enzim Achatina fulica.

3.4.4 Pembuatan kurva standar koloidal kitin

Koloidal kitin yang sudah tersedia dilarutkan ke dalam bufer fosfat 50 mM

pH 7. Larutan induk dibuat dari koloidal kitin 0,25 % b/v. Untuk kadar koloidal

kitin selanjutnya dibuat dari pengenceran koloidal kitin induk.

3.4.5 Pembuatan kurva progres

Disiapkan enam tabung ependorf yang bersih. Ke dalam masing-masing

tabung, dimasukkan sejumlah 200 μl enzim kitinase dan 800 μl substrat kitin.

Masing-masing tabung diinkubasi dengan waktu yang berbeda. Pada tabung



25

pertama diinkubasi selama 10 menit, ke-dua diinkubasi 20 menit dan seterusnya

hingga tabung ke-enam. Setelah diinkubasi, diukur OD (Optical Density) pada

masing-masing sampel.

3.4.6 Optimasi fraksinasi aseton ekstrak kasar enzim kitinase

Fraksinasi aseton dilakukan pada kisaran prosentase 50 hingga 70.

Fraksinasi pertama, ekstrak enzim kitinase sebanyak 20 ml ditambahkan 50%

aseton, kemudian disentrifugasi, sehingga didapatkan residu fraksi 0-50% dan

supernatan. Fraksinasi ke-dua, supernatan diambil dan ditambahkan aseton hingga

70%, kemudian disentrifugasi, sehingga didapatkan residu fraksi 50-70% dan

supernatan.

Setiap endapan yang terbentuk pada masing-masing fraksi selanjutnya

dilakukan pengukuran aktivitas unit dan aktivitas spesifik kitinase. Apabila dalam

tahap fraksinasi ini belum terjadi pemisahan kitinase secara baik, yang ditandai

dengan nilai aktivitas kitinase yang masih menyebar, maka perlu dilakukan

optimasi variasi prosentase aseton pada prosedur fraksinasi.

3.4.7 Penentuan kadar protein

Penentuan kadar protein menggunakan metode Lowry. Disiapkan larutan

A, B, C dan D. Larutan A dibuat dengan cara menimbang sebanayak 0,5 gram

Cu.SO4.5H2O dan 1 gram Na3C6H5O7.7H2O, kemudian dilarutkan dalam akuades.

Larutan tersebut diencerkan dalam labu ukur 100 ml dengan akuades. Larutan B

dibuat dengan cara menimbang 20 gram Na2CO3 dan 4 gram NaOH, kemudian

dilarutkan dalam akuades 1 liter. Larutan C dibuat dari 1 ml larutan A ditambah



26

dengan 50 ml larutan B. Sedangkan larutan D dibuat dari 10 ml reagen fenol

Folin-Ciocalteu ditambah dengan 10 ml akuades.

Tahap pengukuran kadar protein dari enzim kitinase adalah, sebanyak 0,5

ml sampel enzim ditambah 2,5 ml larutan C. Hasil dari pencampuran keduanya

divortex. Kemudian ditambah dengan 0,25 ml larutan D, setelah itu diinkubasi

selama 20 menit, kemudian OD (Optical Density) dibaca pada λ750.

3.4.8 Uji aktivitas enzim kitinase setiap fraksi hasil fraksinasi aseton

Sejumlah 200 μl enzim kitinase ditambah dengan 800 μl substrat kitin

(0,25% kolodial kitin b/v dalam 50 mM bufer fosfat pH 7). Campuran diinkubasi

pada suhu 37oC selama 20 menit, kemudian dilakukan pengukuran aktivitas

kitinase.

Larutan standar kitin dibuat dari larutan koloidal kitin dengan berbagai

konsentrasi. Larutan standar pertama dibuat 0,25% b/v koloidal kitin yang

dilarutkan dalam bufer fosfat (pH 7) di dalam labu ukur 10 ml. Larutan standar ke

dua dibuat dari 0,25% b/v koloidal kitin yang ditambahkan bufer fosfat dengan

volume dan pH yang sama. Larutan standar dibuat hingga medapatkan tujuh

konsentrasi. Setelah itu, larutan standar diukur dengan spektrofotometer pada λ

660 nm (Kim, 2003).

Satu unit aktivitas adalah jumlah enzim yang menghidrolisis kitin 0,001%

(b/v) permenit permili dalam kondisi percobaan. Aktifitas kitinase diukur

berdasarkan pengukuran substrat yang dihidrolisis dari substrat awal oleh enzim

kitinase. Pengukuran aktivitas menggunakan metode turbidimetri yang

menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis. OD (Optical Density) setiap sampel



27

diukur pada λ 660 nm (Kim, 2003) dan suhu kamar selama 20 menit. OD (Optical

Density) yang diperoleh dikonversi menjadi konsentrasi. Adapun perhitungannya

adalah,

Sisa koloidal kitin = koloidal kitin awal – koloidal kitin terhidrolisis

3.4.9 Karakterisasi enzim kitinase

3.4.9.1 Suhu optimum

Disiapkan 5 buah tabung bersih dan kering. Pada masing-masing tabung

dimasukkan kitinase kasar sebanyak 200 μl, dan ditambah dengan 800 μl substrat

kitin (0,25% kolodial kitin b/v dalam 50mM bufer fosfat pH 7) dengan volume 4

ml. Masing-masing tabung diinkubasi 20 menit pada suhu yang berbeda-beda,

yaitu 30oC, 37oC, 40oC, dan 50oC selama 20 menit. Rentang suhu yang digunakan

dalam pengukuran suhu optimum didasarkan pada penelitian dari Yong

dkk.(2005), bahwa kitinase stabil pada suhu 25-50oC.

3.4.9.2 pH optimum

Disiapkan 5 buah tabung bersih dan kering. Pada masing-masing tabung

dimasukkan kitinase kasar sebanyak 200 μl, dan ditambah dengan 800 μl substrat

kitin (0,25% kolodial kitin b/vdalam 50mM bufer fosfat pH 7). Masing-masing

tabung diinkubasi 20 menit pada pH yang berbeda-beda, yaitu 4, 5, 6, 7 dan 8

selama 20 menit. Rentang pH yang digunakan dalam pengukuran pH optimum

didasarkan pada penelitian dari Yong dkk.(2005), bahwa kitinase stabil pada pH

3-8.



28

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pembuatan Substrat Koloidal Kitin

Kitin dibangun oleh unit-unit monomer N-asetilglukosamin (GlcNAc) yang

tergabung secara linier melalui ikatan β (1,4). Rantai kitin yang satu dengan yang

lainnya digabungkan oleh ikatan hidrogen, yaitu antara H pada gugus NH dari satu

rantai dengan O pada gugus C=O dari rantai lain yang berdekatan. Ikatan hidrogen ini

menyebabkan kitin membentuk formasi serabut (fibril) dan tidak dapat larut dalam

air. Kitin tidak dapat larut air, pelarut organik, alkali pekat, asam mineral encer, tetapi

larut dalam asam-asam mineral yang pekat (Yurnaliza, 2002).

Substrat koloidal kitin dalam penelitian ini dibuat dari limbah kulit udang sebagai

sumber kitin. Berdasarkan metode Chernin dkk (2003), pembuatan koloidal kitin terdiri

dari dua tahap yang meliputi tahap hidrolisis sebagian kitin dan penetralan. Sebanyak 5

gram kitin dilarutkan dalam 100 ml HCl 10 N. Larutan HCl 10 N termasuk asam

mineral yang pekat, sehingga dapat melarutkan kitin. Larutan kitin tersebut bewarna

kuning pucat, seperti wana kitin pada saat sebelum dilarutkan. Setelah larut, larutan

kitin didiamkan selama 24 jam pada suhu 4oC di lemari es. Tujuan penyimpanan

larutan kitin pada suhu 4oC adalah agar pada saat proses penetralan dengan NaOH 10

N tidak menimbulkan reaksi panas yang berlebih. Setelah penyimpanan, larutan

disaring untuk menghilangkan pengotor yang ada pada larutan kitin. Larutan tersebut

ditambah 50 ml akuades dingin. Hal ini dimaksudkan untuk mengencerkan larutan



29

kitin yang sangat asam dan menurunkan suhu dari larutan kitin tersebut. Setelah

ditambah akuades, larutan dinetralkan dengan NaOH 10 N. Penambahan NaOH

dilakukan secara perlahan-lahan supaya pH koloidal kitin yang diinginkan tepat

netral. Dibutuhkan sebanyak 34 ml volume NaOH untuk dapat menetralkan pH

larutan kitin. Pada saat penambahan NaOH pada larutan kitin, terbentuk koloid yang

berwarna putih. Setelah pH netral, koloid disentrifugasi selama 20 menit pada suhu

4oC. Tujuan koloid disentrifugasi adalah untuk mendapatkan endapan yang berupa

pelet koloidal kitin. Dari 184 koloidal kitin didapatkan sebanyak 10,0227 gram pelet

koloidal kitin. Pelet tersebut merupakan sediaan substrat koloidal kitin.

4.2 Karantina Achatina fulica

Achatina fulica dikarantina dalam kandang yang tidak terkena sinar matahari

langsung. Kandang dibuat bagian yang dapat dilalui udara tetapi tetap meminimalkan

sinar matahari masuk kedalam. Kelembaban kandang senantiasa dijaga dengan cara

memberi air ke dalam kandang namun tidak terlalu banyak. Selain itu pelepah pisang

juga berfungsi sebagai hal yang sama. Karantina dilakukan selama minimum satu

minggu. Achatina fulica diberi nutrisi berupa dedaunan dan sayuran seperti kubis,

daun papaya, daun singkong dan lain-lain. Pemberian makanan dilakukan secara rutin

agar kondisi Achatina fulica yang berada dalam kondisi yang homogen.

Kondisi lingkungan dan makanan Achatina fulica mempengaruhi enzim yang

diproduksi oleh digestive gland. Enzim yang dibentuk apabila terdapat induser

disebut enzim induktif. Induser berupa molekul substrat atau turunannya. Dalam hal



30

ini substrat dari enzim kitinase adalah senyawa yang terdapat dalam makanan yang

dikonsumsi setiap hari oleh Achatina fulica. Contoh lain enzim induktif adalah

pembentukan enzim beta-galaktosidase pada Escherichia coli yang diinduksi oleh

laktosa sebagai substratnya atau derivatnya.

4.3 Panen Cairan Disgetive Gland Achatina fulica

Cairan disgetive gland dari Achatina fulica merupakan ekstrak enzim yang

dihasilkan oleh Achatina fulica. Produksi ekstrak enzim diperoleh dari cangkang ekor

(apex) Achatina fulica yang dipecah, kemudian cairan yang keluar dari ekor

ditampung dalam beker es agar enzim tidak mengalami perubahan aktivitas. Hasil

ekstrak enzim berwarna biru tua yang masih tercampur dengan partikel padat dan

biomassa sel. Dari 50 ekor Achatina fulica didapatkan sebanyak 30 ml cairan

digestive gland.

Ekstrak enzim disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 20 menit,

terdapat endapan yang merupakan pengotor. Kecepatan 4000 rpm pada sentrrifuga

berfungsi mengendapkan pengotor selain protein. Pengotor tersebut adalah partikel

padat dan biomassa yang mempunyai masa dan kerapatan yang lebih besar daripada

cairannya. Sedangkan supernatan merupakan larutan ekstrak enzim, yang selanjutnya

akan dimurnikan secara parsial. Ekstrak enzim disimpan pada suhu dingin dan

tertutup agar tidak mudah rusak.



31

4.4. Pembuatan Kurva Progres

Kurva progres kitinase dibuat dengan tujuan untuk mengetahui waktu

inkubasi yang sesuai untuk uji aktivitas enzim kitinase dari digestive gland Achatina

fulica.

Gambar 4.1 Kurva progres aktivitas kitinase dari digestive gland Achatina fulica

Kurva progres merupakan kurva perubahan substrat kitin terhadap waktu. Kurva

pada Gambar 4.4 merupakan profil kurva progres dari enzim kitinase. Perubahan

substrat terhadap waktu pada awalnya menunjukkan slope yang tinggi (garis a),

kemudian slope menurun dimulai dari menit ke-22. Pada lima menit pertama masih

sedikit substrat kitin yang dihidrolisis, setelah itu meningkat tajam hingga 20 menit

sehingga slope pada kurva tinggi (garis a) yang berarti memilki kecepatan orde 1.

Dimulai dari menit ke-22 substrat kitin terhidrolisis menurun dan menjadi nol hingga

y = 0.017x + 0.242R² = 0.991

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 20 40 60 80

kada

r ki

tin te

rhid

rolis

is (%

b/v)

waktu (menit)

a

22



32

menit ke-60 yang berarti memiliki kecepatan orde 0. Kadar substrat terhidrolisis

menurun karena enzim menjadi jenuh terhadap substrat, pada akhirnya, enzim

dihambat oleh produk yang terbentuk. Berdasarkan kurva progres, maka uji aktivitas

enzim dilakukan selama 20 menit karena reaksi enzimatis bekerja secara optimum.

4.5 Pembuatan Kurva Standar Koloidal Kitin

Koloidal kitin dibuat dengan berbagai kadar untuk diukur OD-nya pada λ660.

Koloidal kitin induk dibuat dengan kadar 0,25%b/v. kadar koloidal kitin berikutnya

dibuat dengan pengenceran induk.

Gambar 4.2 Kurva standar koloidal kitin

Semakin besar kadar koloidal kitin, maka akan semakin besar pula OD yang

didapat. Persamaan kurva koloidal kitin y = 1.422x + 0.060 dibuat untuk

mengkonversi OD dari setiap jumlah kitin yang terhidrolisis karena aktivitas enzim

kitinase.

y = 1.422x + 0.060R² = 0.990

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0 0.1 0.2 0.3

OD

λ660

koloidal kitin %b/v



33

4.6 Optimasi Fraksinasi Aseton Ekstrak Enzim Kitinase

Pelarut organik untuk fraksinasi protein dipilih berdasarkan pertimbangan

dapat larut dengan air dan memilki efek presipitasi yang bagus. Pelarut organik yang

biasa digunakan adalah etanol dan aseton (Scopes,1994). Dalam penelitian ini dipilih

aseton sebagai pelarut organik untuk fraksinasi, karena aseton lebih mudah untuk

dipisahkan dari protein. Selain itu aseton tidak memiliki efek azeotrop sepeti etanol.

Azeotrop adalah kesetimbangan uap-cair campuran etanol dengan air, sehingga etanol

sulit dipisahkan sempurna, atau hanya dapat dipisahkan melalui destilasi dengan

perlakuan tertentu.

Sebanyak 20 ml ekstrak enzim kitinase digestive gland dari Achatina fulica

ditambahkan ke dalam aseton yang sudah bersuhu -20oC diaduk menggunakan

pengaduk magnet selama 8 menit. Volume aseton yang ditambahkan bergantung pada

prosentase fraksinasi yang diinginkan, sesuai dengan tabel fraksinasi Scopes. Suhu

harus tetap dijaga selama proses fraksinasi agar tidak di atas 0oC. Hal tersebut

dilakukan dengan cara selama proses frakasinasi gelas harus tetap berada di dalam

penangas es. Adapun dry es digunakan sebagai penangas es karena dapat menjaga

suhu hingga -20oC daripada es batu biasa yang hanya dapat menjaga suhu hingga 0oC

dan tidak stabil.

Kemudian campuran ekstrak dan aseton disentrifugasi pada suhu -10oC

selama 20 menit untuk memisahkan endapan dari supernatannya. Sebelum

digunakan, alat sentrifuga di-treatment terlebih dahulu dengan mengeset suhu di



34

dalam alat menjadi -10oC selama 20 menit. Hal tersebut dilakukan agar alat dapat

menyesuaikan suhu, sebelum dilakukan proses sentrifugasi. Karena pengondisian

suhu alat butuh waktu cukup lama. Apabila pengondisian suhu terjadi pada saat

campuran ekstrak enzim dan aseton sudah dimasukkan, maka sudah dipastikan enzim

akan rusak. Endapan dan supernatan kemudian dipisahkan. Pada saat aseton diaduk

bersama dengan enzim, molekul air yang berada di sekitar area hidrofob pada

permukaan enzim didesak oleh aseton, sehingga tetapan dielektrik air menurun. Hal

tersebut menyebabkan muatan-muatan molekul enzim berada mendekati permukaan

enzim sehingga terjadi gaya tarik-menarik elektrostatik muatan yang berlawanan

pada permukaan enzim satu dan yang lain. Tarik-menarik muatan yang berbeda

tersebut menyebabkan terjadinya agregasi molekul-molekul enzim. Molekul-molekul

enzim yang mengendap merupakan enzim yang sudah dimurnikan secara parsial.

Supernatan digunakan untuk fraksinasi selanjutnya. Sedangkan endapan

digunakan untuk uji aktivitas kitinase. Sebelum diuji aktivitasnya, endapan harus

benar-benar terbebas dari aseton yang tersisa. Aseton yang tersisa dihilangkan dengan

cara mengangin-anginkan di suhu ruangan, tetapi masih dalam lingkungan yang

steril. Pada permukaan endapan masih terdapat aseton sisa. Untuk

menghilangkannya, diserap dengan kertas saring yang sudah disterilkan.

Penghilangan aseton dimaksudkan untuk meminimalisasi denaturasi enzim pada

permukaan endapan. Endapan yang terbentuk dilarutkan dengan akuades hingga tepat

larut.



35

4.7 Penentuan Kadar Protein

Dalam penelitian ini digunakan metode Lowry., yang merupakan salah satu

metode pilihan untuk mementukan kadar protein dalam suatu bahan. Dalam keadaan

basa, ion tembaga divalen (Cu2+) membentuk suatu kompleks dengan ikatan peptida

yang mereduksi Cu2+ menjadi tembaga monovalen Cu+ . Ion Cu+ dan gugus radikal

dari tirosin, triptofan, dan sistein bereaksi dengan pereaksi Folin-Ciocalteau

membentuk senyawa kompleks yang berwarna. Pembentukan warna tersebut

disebabkan adanya reaksi antara basa tembaga dengan sampel protein yang diuji.

Intensitas warna yang terbentuk tergantung pada jumlah asam aromatik yang berbeda

untuk setiap jenis protein (Bintang,2009)

Data kadar protein diperlukan untuk menentukan besar aktivitas spesifik suatu

enzim. Kadar protein dari ekstrak dan enzim hasil setiap fraksinasi diukur. Semakin

besar kadar protein yang terukur, berbanding dengan jumlah protein selain enzim

yang masih ikut terlarut dalam larutan enzim.

4.8 Uji Aktivitas Enzim Kitinase Aseton Setiap Fraksi Hasil Fraksinasi

Kitinase merupakan enzim yang dapat menghidrolisis kitin menjadi

monomernya yaitu N-asetilglukosamin. Untuk perhitungan aktivitas kitinase, satu

unit aktivitas didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghidrolisis kitin 0,01%

(b/v) per menit per ml dalam kondisi percobaan.



36

Metode pengukuran yang digunakan adalah menghitung jumlah susbtrat yang

terhidrolisis berdasarkan substrat sisa. Hasil OD (Optical Density) kontrol dikurangi

dengan OD kitin yang tersisa menghasilkan OD (Optical Density) yang kemudian

dikonversi ke dalam persamaan garis y= 1.422x + 0.060 untuk menghitung kadar

kitin.

Jumlah kitin yang terhidrolisis berbanding lurus dengan aktivitas enzim

kitinase. Semakin tinggi aktivitas enzim kitinase, maka semakin banyak jumlah kitin

yang terhidrolisis. Sejumlah 200 μl enzim ditambah 800 μl koloidal kitin, diinkubasi

selama 20 menit pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi, enzim dipanaskan. Tujuan

pemanasan adalah untuk menghentikan reaksi enzim. Selama proses inkubasi

tersebut, terjadi reaksi pengikatan sisi katalitik kitinase terhadap kitin sehingga kitin

terhidrolisis. Uji aktivitas kitinase berhubungan erat dengan setiap fraksinasi karena

dapat memberikan informasi seberapa murni enzim yang dihasilkan.

Ekstrak enzim terlebih dahulu diuji aktivitas spesifiknya. Data ini digunakan

untuk mengetahui peningkatan aktivitas spesifik kitinase sebelum dan sesudah

N-asetil-β-glukoamidase Kitinbiosidase

Endokitinase dan lisosim

Gambar 4.3 Mekanisme kerja enzim kitinase terhadap polimer N-asetilglukosamin



37

dimurnikan. Untuk mendapatkan fraksi aseton yang dapat terkumpul sebanyak

mungkin aktivitas spesifik kitinase, dilakukan beberapa percobaan fraksinasi.

Percobaan pertama, fraksinasi dilakukan pada prosentase aseton 0-50 dan 50-70.

Dipilih prosentase aseton 0-50 dan 50-70 untuk fraksinasi karena pada umumnya

protein sitoplasma mengendap pada kisaran prosentase aseton tersebut.

Tabel 4.1 Uji aktivitas kitinase hasil fraksinasi percobaan 1

Aktivitas spesifik banyak terkumpul di fraksi 50-70, yaitu sebesar 6,68.

Namun pada percobaan 1 (Tabel 4.1) aktivitas spesifik kitinase masih menyebar pada

fraksi 0-50, yaitu sebesar 5,37. Dengan harapan aktivitas kitinase dapat dikumpulkan

lebih banyak lagi dalam satu fraksi, Percobaan pertama aktivitas spesifik pada fraksi

0-50 ditarik ke fraksi ke-dua, yaitu dengan menambahkan aseton hingga fraksi kedua

menjadi 40-75 (sesuai dengan tabel Scopes). Data percobaan fraksinasi pertama

digunakan sebagai acuan fraksinasi ke-dua.

Fraksi OD λ660 Kadar kitin terhidrolisis

(%b/v)

Aktivitas (U/ml)

Kadar protein (mg/ml)

Aktivitas spesifik (U/mg)

0

0,0989 0,02735 2,47 4,12675x10-1 5,985

0-50 0,0999 0,0281 1,53 2,8485 x10-1 5,37

50-70 0,2079 0,1041 1,17 1,75129x10-1 6,68



38

Tabel 4.2 Uji aktivitas hasil fraksinasi percobaan 2

Pada percobaan ke-dua, fraksinasi dimulai pada prosentase aseton 0-40 dan

dilanjutkan prosentase aseton 40-75. Pada percobaan ini diperoleh aktivitas spesifik

kitinase paling banyak berada pada fraksi 40-75, yaitu sebesar 9,6. Namun masih

tampak ada penyebaran aktivitas spesifik pada fraksi lain. Maka perlu dilakukan

percobaan selanjutnya untuk mencari fraksi terbaik yang dapat mengumpulkan

aktivitas spesifik kitinase.



(%b/v)

Aktivitas (U/ml)



0

0,0989 0,02735 2,47 4,12675x10-1 5,985

0-40 0,2773 0,1528 2,865 3,2642 x10-1 8,8

40-60 0,4872 0,3004 9,39 4,2594 x10-1 22

60-80 0,2926 0,1636 0,818 8,0200 x10-1 10


(%b/v)

Aktivitas (U/ml)



0

0,0989 0,02735 2,47 4,12675x10-1 5,985

0-40 0,0958 0,0252 1,82 2,9435 x10-1 6,1

40-75 0,2558 0,1377 4,13 4,2918 x10-1 9,6



39

Pada percobaan ke-tiga dimulai dari fraksi 0-40, didapatkan aktivitas spesifik,

yaitu sebesar 8,8. Fraksinasi dilanjutkan pada fraksi 40-60, didapatkan aktivitas

spesifik, yaitu sebesar 22. Kemudian, fraksinasi berakhir pada fraksi 60-80,

didapatkan aktivitas spesifik, yaitu sebesar 10. Pada percobaan ini, aktivitas spesifik

kitinase terkumpul paling banyak pada fraksi 40-60. Namun, masih tampak aktivitas

spesifik kitinase yang tersebar pada fraksi 0-40 dan 60-80. Maka perlu dilakukan

percobaan selanjutnya untuk mencari prosentase aseton untuk fraksi terbaik yang

dapat mengumpulkan aktivitas spesifik kitinase.


Percobaan ke-empat dilakukan berdasarkan hasil dari percobaan ke-tiga dengan

menaikkan prosentase aseton untuk fraksi ke-dua pada percobaan ini, yaitu 45-70.

Diperoleh aktivitas spesifik kitinase paling banyak terkumpul pada fraksi 45-70, yaitu

sebesar 38,6. Pada fraksi 70-80 aktivitas spesifik kitinase sangat rendah.. Namun

begitu, masih terdapat aktivitas spesifik yang menyebar di fraksi 0-45.


(%b/v)

Aktivitas (U/ml)



0

0,0989 0,02735 2,47 4,12675x10-1 5,985

0-45 0,3114 0,1999 1,8785 1,3634 x10-1 13,7

45-70 0,5275 0,3288 9,864 2,6706x10-1 38,6

70-80 0,0970 0,0260 0,09375 1,0407 x10-1 0,9



40

Pada percobaan ke-empat didapat fraksinasi terbaik, akan tetapi aktivitas spesifik

tersebar pada fraksi lain. Hasil ini diduga pada ekstrak enzim kitinase dari Achatina

fulica terdapat isozim. Isozim adalah enzim yang berbeda dalam sifat fisika, transpot

ion dan transpot asam basa dan sejumlah proses metabolisme (Tufts, 2006).

4.9 Karakterisasi Enzim Kitinase

4.9.1 Suhu optimum

Salah satu faktor yang mempengaruhi enzim, dalam hal ini enzim kitinase,

adalah suhu. Pada penelitian, aktivitas enzim kitinase terhadap pengaruh suhu diamati

pada suhu 30oC, 37oC, 45oC, dan 50oC. Suhu mempengaruhi energi yang diperlukan

oleh enzim untuk melakukan reaksi. Peningkatan suhu, akan meningkatan energi

kinetik enzim. Jika suhu rendah, maka enzim tidak memiliki cukup energi untuk

melakukan reaksi, sehingga tidak dapat bekerja secara optimal. Sedangkan jika pada

suhu tinggi, enzim akan terdenaturasi. Pada suhu optimumnya energi yang diperoleh

untuk enzim bereaksi dengan optimal tanpa denaturasi (Champe dan Harvey, 1994).

Gambar 4.3 Suhu optimum fraksi 45-70

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

20 30 40 50 60

Kad

ar k

itin

ter

hid

rolis

is (

%b

/v)

Suhu



41

Kadar kitin terhidrolisis bertamabah dimulai dari suhu 30 oC dan 37oC.

Kemudian terjadi penurunan di suhu 45, 50oC.. Hal ini berarti terjadi penurunan

aktivitas dari enzim kitinase. Terjadi penurunan aktivitas karena atom-atom dalam

molekul enzim memiliki energi yang besar untuk bergerak yang disebabkan oleh

perubahan bentuk struktur enzim akibat meningkatnya getaran termal komponen

atom-atomnya, sehingga enzim terdenaturasi (Lehninger, 1997).

Diperoleh suhu optimum enzim kitinase hasil pemurnian parsial fraksi 45-70

yaitu pada suhu 37oC. Pada suhu ini, konformasi enzim dalam keadaan paling sesuai

untuk berikatan dengan substrat, sehingga enzim lebih aktif dalam mengkatalisis

reaksi.

4.9.2 pH optimum

Faktor lain yang penting mempengaruhi aktivitas enzim kitinase adalah pH.

Setiap enzim memiliki pH optimum, karena pH berhubungan dengan struktur enzim

yang berupa asam amino. Profil aktivitas pH enzim menunjukkan pH pada saat gugus

fungsi yang penting pada sisi katalitik berada pada tingkat ionisasi yang diinginkan.



42

Gambar 4.4 pH optimum enzim kitinase fraksi 45-70

Nilai pH optimum pada fraksi 45-70 adalah pH 7. Sesuai dengan kurva pada

Gambar 4.4, jumlah kitin terhidrolisis meningkat dari pH 5 hingga pH7. jumlah kitin

terhidrolisis menurun secara signifikan dari pH7 ke pH 8. Dengan adanya perubahan

pH maka akan mempengaruhi perubahan ionisasi gugus fungsi asam amino enzim

ataupun substrat. Sehingga konformasi enzim dapat berubah dan dapat

mengakibatkan penurunan aktivitas enzim yang disebabkan konformasi enzim tidak

sama dengan konformasi substrat (Lehninger, 1997).

0.150.160.170.180.19

0.20.210.220.230.24

5 6 7 8 9

Kit

in t

erh

idro

lisis

(%

b/v

)

pH



43

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan yang telah diuraikan, dapat disimpulkan.

1. Fraksi aseton 45-70 merupakan fraksi optimum dari fraksinasi aseton,

yang memiliki aktivitas spesifik sebesar 38,6.

2. Peningkatan kemurnian enzim kitinase setelah fraksinasi aseton sebesar

6,45 kali.

3. Enzim kitinase dalam keadaan murni parsial memiliki pH optimum 7 dan

suhu optimum 37 oC.

5.2 Saran

Berdasarkan hasil aktivitas spesifik kitinase yang masih menyebar dalam

pemurnian parsial menggunakan fraksinasi aseton, dimungkinkan adanya isozim

dalam ekstrak enzim kitinase. Oleh karena itu diperlukan penelitian lebih lanjut untuk

mengetahui ada tidaknya isozim dalam ekstrak enzim kitinase.



44

DAFTAR PUSTAKA

A.J. Esbaugh , B.L. Tufts, 2006, The Structure And Function of Carbonic Anhydrase Isozymes In The Respiratory System Of Vertebrate,Respiratory, Physiology & Neurobiology, 154, 185–198

Bartnicki-Garcia, S., 1989, The Biotcheical Cytology of Chitin and Chitosan Synthesis in Fungi, Dalam G. Skjak, B. T. Anthonsen and P.A. Sanford (Eds). Procedings of the 4th International Conferenceon Chitin and Chitosan. Elsevier. Applied Science,Barking-UK

Bintang, Maria, 2010, Teknik Penelitian Biokimia, Erlangga, Bogor Brurberg, May B., Ingolf F., Nesl dan Eijsink, Vincent G.,1996, Comparative studies

of chitinases A and B from Serratia marcescens, Microbiology, 142, 1581-1 589

Bondanzsky M., 1998, Kimia Peptida, Alih bahasa prof. Dr. Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB Bandung, hal 46-47.

Cabib, E. 1987. The Synthesis and Degradation of Chitin. Dalam A. Meister (Ed)

Advances in Enzymology. Vol. An Interscience Publication John Willey and Sons Inc., New York, 59, 59 – 101

Carlile, M. J. dan S.C. Watkinson, 1994, The Fungi, Academis Press, Harcourt Brace

and Company Publishers, London Chernin, L., Z. Ismailo, S. Haran dan I. Chet, 1995, Chitinolytic Enterobacter

Agglomerans Antagonistic to Fungal Plant Pathogens. Appl. Environ.

Microbiol., 61 :1720 – 1726

Champe, P.C and Ricard, A. Harvey, 1994, Biochemistry, Second edition, Lippicott Company, Piladelphia.

Cohen-Kupiec R, Chet I., 1998, The Molecular Biology of Chitin Digestion, Curr Opinion, Biotechnol., 9, 270-277

Deputi Menegristek Bidang Pendayagunaan dan Pemasyarakatan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi, 2000, Budidaya Bekicot (Achanita spp.), BPP Teknologi, Jakarta

Douglas, L.J., dan M.A. Al-fattani, 2006, Biofilm Matrix of Candida albicans and Candida tropicalis: Chemical Composition and Role in Drug Resistance, Journal of Medical Microbiology, Glasgow



45

Eisenthal, Robert dan Danson, Michael.J., 2002, Enzyme Assays, Second edition, Oxford University Press, New York

FAO, 1989, Data sheet on the Giant African Snail, www.ecoport.org, 21 November 2011

Flach, J., Pilet, P. E., dan Jolles, P., 1992, What’s New in Chitinase Research?,

(Reviews) Experientia, 48, 701-716

Fleuri, Luciana F., Kawaguti, Haroldo Y., Sato, Helia H., 2009, Production, Purification and Application of Extracellular Chitinase from Cellulosimicrobium cellulans, Brazilian journal of Microbiology, Brasil

Gabriel, B., Frankowski, F., dan Bani, H., 1999, Microbiology, University of

Rostock, German Gabriel, Miroslav dan Marie Kopecka, 1987, Studies on Cell Division In

Regenerating Protoplasts of the Yeast Schizosaccharomyces Japonicus,

Department of Biology, Faculty of Medicine, J . E. Purkyne' University, Czechoslovakia

Herdyastuti, Nuniek., Raharjo, Tri Joko dan Mudasir, Matsjeh., Sabirin, 2009,

Chitinase and Chitinolytic Microorganism : Isolation, Characterization and Potential, Indo. J.Chem, 9 (1), 37-47

Harman, G. E., C.K. Hayes, M. Lorito, R. M. Broadway, A. Di Pietro, C. Peterbauer dan A. Tronsmo, 1993, Chitinolytic Enzymes of Trichoderma harzianum : Purification of Chitobiosidase and Endochitinase. Phytopathology, 83, 313-318

Jeaniaux, C, 1966, Chitinases, Dalam E, F. Neufeld and V. Ginburg (Eds.) Complex

Carbohydrates, Methods in Enzymology, Academic Press, New York, Vol. VII, 644 – 650

Kamiliyah, Hikmatul, 2011, Peningkatan Daya Antifungi Ekstrak Kayu Manis

(Cinnamomum Burmannii L.) Terhadap Candida albicans dengan Konsorsium Enzim Siput (Achatina Fulica), Skripsi, Program S-1 Kimia, Universitas Airlangga, Surabaya

Kay, Alison, 1986, The Conversation Biology of Molluscs, IUCN Publishing, Gland, Switzerland

Kosim, Mukhamad dan Putra, Surya Rosa, Pengaruh Suhu Pada Bacillus Subtilis, Prosiding Skripsi Semester Genap 2009-2010, ITS, Surabaya



http://www.ecoport.org/

46

Lehninger, Albert, 1998, Dasar-dasar biokimia, jilid 1, Airlangga, Jakarta Marks, B. Dawn, 1996, Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah Pendekatan Klinis, alih

Bahasa: Brahm U, EGC, Jakarta Marti´nez, Jose, P. M. Luisa Gil, Jose´ L. Lo´ Pez-Ribot, dan W. Lajean Chaffin3.,

1998, Serologic Response to Cell Wall Mannoproteins and Proteins of Candida albicans, Clinical Microbiology Reviews, American Society for Microbiology

Mead, A.R, 1979, Economic Malacology with Particular Reference to Achatina

fulica. In V. Fretter & Peake, J. (eds.), The Pulmonates, Academic Press, New York, Vol. 2B

Ottoway JH, Appa DK., 1984, Biochemistry, Edisi ke-4 Cambrige: ELBS.

Poedjiadi, Anna, 1994, Dasar-Daasr Biokimia, UI-Press, Jakarta

Rajarathanam, S., M. N. J. Shashirekha dan Z. Bano. 1998. Biodegradative and Biosinthetic Capacities of Mushrooms : Present and Future Strategies. Crit. Rev. in Biotechnol., 18, 91 – 236

Rochima, E., 2006, Pemurnian dan Karakterisasi Kitin Deasetilase Termostabil dari Bacillus papandayan Asal Kawah Kamojang Jawa Barat, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelauatan universitas Padjajaran, Jatinangor, Bandung 8, 193-209

Sahai , A. S. dan M. S. Manocha, 1993, Chitinases of Fungi and Plants : Their

Involvement in Morphogenesis and Host-Parasite Interaction. FEMS

Microbiol., Rev. 11 : 317 – 338 Santoso, H.B., 1989, Budidaya Bekicot, Kanisisus,Jakarta Scopes, R. K. 1994. Protein Purification, Principles and Practice, Third edition,

Springer-Verlag, New York.

Stryer, Lubert, Berg, Jeremy M., Tymoczko, John L., 2002, Biochemistry, Fifth edition, W. H. Freeman and Company, New York



47

Thermo Fisher Scientific, 2009, Pierce Biotechnology, www.thermo.com/pierce 12 November 2011

Toharisman, Aris. 2007. Peluang Pemanfaatan Enzim Kitinase di Industri Gula

Voet, Donald dan Judith G. Voet, 2004, Biochemistry Volume I, J. Wiley and Sons, Canada

Wang, Y., Kausch, A.P., Chandlee, J.M., Luo, H., dan Ruemmele, B.A., 2003, Plant

Sci., 165, 497-506

Wallace, R.L., 2002, Invertebrate Zoology, Prentica Hall. Inc, United State of America

Wheel, B.P. Van, 1961, The Comparative Physiologi of Digestion in Molluscs, AM. Zoologis, Department of Zoology and Entomology, University of Hawaii, USA

Yong, Tao et al .2005. Purification and Characterization Extracellular Chitinase

Produced by Bacterium C4. Annals of Microbiology, 55 (3)

Yurnaliza, 2002, Senyawa Khitin dan Kajian Aktivitas Enzim Mikrobial Pendegradasinya. Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam, Program Studi Biologi Universitas Sumatera Utara



http://www.thermo.com/pierce

Lampiran 1. Pembuatan reagen

A. Pembuatan larutan bufer fosfat

Larutan stok A NaH2PO4 0,2 M dibuat dengan cara menimbang 3,12 g NaH2PO4.2H2O,

kemudian dilarutkan dengan akuades. Larutan tersebut diencerkan dalam labu ukur 100 ml

hingga tanda batas. Larutan stok B 0,2 M dibuat dengan cara menimbang 3,56 g

Na2HPO4.2H2O, kemudian dilarutkan dengan akuades. Larutan tercebut diencerkan dalam labu

ukur 100 ml hingga tanda batas. Besarnya pH bufer diukur pada pH-meter. Adapun komposisi

larutan stok A dan B untuk memperoleh bufer fosfat pH 6, 7, dan 8 adalah sebagai berikut :

Larutan stok A (ml) Larutan stok B (ml) Larutan bufer fosfat pH

43,85 6,15 6

19,5 30,5 7

2,65 47,35 8

B. Pembuatan larutan bufer fosfat sitrat

Dibuat larutan stok A asam sitrat 0,1 M dengan cara menimbang 1,9121 gram asam sitrat,

kemudian dilarutkan dalam akuades. Larutan tersebut diencerkan ke dalam labu ukur 100 ml,

hingga tanda batas. Larutan stok B Na2HPO4.2H2O 0,2 M dibuat dengan cara menimbang 3,56

gram Na2HPO4.2H2O, kemudian dilarutkan dengan akuades. Larutan tersebut diencerkan dalam

labu ukur 100 ml hingga tanda batas. Larutan bufer fosfat sitrat memiliki pH 4-7 sebanyak 100

ml. Besarnya pH bufer diukur pada pH-meter. Adapun komposisi larutan stok A dan B untuk

memperoleh larutan bufer fosfat sitrat pH 4, 5, 6, dan 7 sebagai berikut :



Larutan stok A Larutan stok B pH

24,3 25,7 5

17,9 32,1 6

6,5 43,6 7

Lampiran 3. Pembuatan larutan NaOH 10 N

Larutan NaOH 10N dibuat dari 40 gram NaOH yang dilarutkan dengan akuades. Setelah

itu, larutan diencerkan dalam labu ukur 100 ml.

Lampiran 4. Pembuatan larutan HCl 10 N

Sebanyak 83,3 ml larutan HCl 12 N, diencerkan dalam labu uku 100 ml.



Lampiran 5. Tabel prosentase aseton (ml) yang ditambahkan ke dalam 1 liter enzim



Lampiran 6. Perhitungan aktivitas kitinase

U = x x x

Percobaan Fraksi Volume yang diperlukan untuk tepat larut

Perhitungan aktivitas unit/ ml

1 0-50

18 ml U = x x = 0,70

50-70

9 ml U = x x x = 20,79

2 0-40

14 ml U = 0.0252 x x x = 0.0260

40-75

24 ml U = 0.1377x x x = 0.0344

3 0-40

15 ml U = 0.1528 x x x = 0.0382

40-60

25 ml U = 0.3004 x x x = 0.0751

60-80

4 ml U = 0.1636 x x x = 0.0409

4 0-45

8,5 ml U =0.1999 x x x = 0.0442

45-70

24 ml U = 0.3288 x x x = 0.0822

70-80

7,5 ml U = 0.0260 x x x = 0.0065



Lampiran 7. Data Primer

A. OD koloidal kitin dan OD protein hasil fraksinasi percobaan 1-4

B. ODλ750 BSA (Bovine Serum Albumin)

Konsentrasi BSA (μg/ml)

ODλ750

100 0.4439

200 0.8337

300 1.317

400 1.6609

y = 0.004x + 0.030R² = 0.996

0

0.5

1

1.5

2

0 200 400 600

OD

λ75

0

Kadar protein

Kurva standar BSA

Percobaan Fraksi ODλ660 kontrol ODλ660 kitin OD λ750 protein

0 0 0,6112 0,5123 1,6807 1

0-50 0,6311 0.5312 1,4760

50-70 0,6312 0.4233 1,5867 0-40 0.5330 0.0959 1,7120 2 40-75 0.3754 0.2558 1,4606 0-40 0.6 216 0.3443 1.7709 3 40-60 0.6521 0.1649 1.6370 60-80 0.6358 0.3432 1.3939 4 0-45 0.6557 0.3443 1.3132 45-70 0.6365 0.2090 0.9202

70-80 0.6254 0.5284 1.1401



ADLN Perpustakaan Universitas Airlanggarepository.unair.ac.id/25773/1/MPK 86 - 12 Nin p.pdf ·...

Documents

Transcript of ADLN Perpustakaan Universitas Airlanggarepository.unair.ac.id/25773/1/MPK 86 - 12 Nin p.pdf ·...