vii

ABSTRAK

PEMBERIAN RECOMBINANT RAT PLATELET DERIVED GROWTH

FACTOR BB MENSTIMULASI PEMBENTUKAN BRIDGING CALLUS

PADA FRESH FROZEN ALLOGRAFT PASCA PEMBEDAHAN

REKONSTRUKSI DEFEK TULANG LUAS FEMUR TIKUS WISTAR

MELALUI PENINGKATAN EKSPRESI VASCULAR ENDOTHELIAL

GROWTH FACTOR, BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 2 DAN

OSTEOCALCIN

Defek tulang yang luas dapat disebabkan karena trauma dan non trauma

(pasca eksisi tumor). Salah satu tatalaksana pada defek tulang luas adalah

pembedahan rekonstruksi dengan menggunakan allografts. Komplikasi yang sering

terjadi pada penggunaan allograft ini adalah terjadinya nonunion, fraktur pada

graft-nya, dan infeksi. Penyebab utama terjadinya komplikasi di atas adalah karena

vaskularisasi dari graft bed yang tidak baik. Untuk mengatasi komplikasi tersebut,

dikembangkan metode bone tissue engineering yang menggunakan faktor

pertumbuhan sebagai stimulator vaskularisasi (angiogenic growth factors). Growth

factor yang sangat penting dalam penyembuhan tulang adalah Platelet Derived

Growth Factor BB.

Rancangan penelitian ini adalah Post Test Only Control Group Design

dengan sampel penelitian adalah tikus Wistar berjumlah 32 dan dibagi menjadi dua

kelompok yaitu kelompok perlakuan dengan pemberian rrPDGF BB konsentrasi 40

µg/ml dan kelompok kontrol tanpa pemberian rrPDGF BB. Setelah 4 minggu

diperiksa ekspresi VEGF, BMP 2 dan Osteocalcin pada allograft menggunakan

tehnik imunohistokimia. Untuk bridging callus diperiksa histopatologinya dengan

metode pengecatan hematoxylin eosin.

Pemberian PDGF BB pada fresh frozen allograft pasca pembedahan

rekonstruksi defek tulang luas femur tikus mengekspresikan VEGF, BMP 2 dan

Osteocalcin lebih tinggi pada kelompok perlakuan dibandingkan kontrol yang

secara statistik berbeda bermakna (p=0,000) dengan p<0,05. Penelitian ini juga

menunjukkan terbentuknya bridging callus pada fresh frozen allograft yang

berbeda bermakna secara statistik (p=0,003) dengan p<0,05.

Dapat disimpulkan bahwa pemberian Recombinant rat PDGF BB secara

signifikan menstimulasi pembentukan tulang baru melalui peningkatan ekspresi

VEGF, BMP 2 dan osteocalcin.

Kata kunci: PDGF BB, VEGF, BMP 2, Osteocalcin, Allograft, Bridging Callus

viii

ABSTRACT

THE ADMINISTRATION OF RECOMBINANT RAT PLATELET

DERIVED GROWTH FACTOR BB STIMULATE THE FORMATION OF

BRIDGING CALLUS ON FRESH FROZEN ALLOGRAFT AFTER

RECONSTRUCTIVE SURGERY OF LARGE FEMORAL BONE DEFECT

ON WISTAR RAT THROUGH THE INCREASED EXPRESSION OF

VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR, BONE

MORPHOGENETIC PROTEIN 2 AND OSTEOCALCIN.

Large bone defects could be due to traumatic and non-traumatic causes (post

tumor excision). One way to manage such cases is with reconstructive surgery by

using allografts. Complications that often accompanied the use of allografts are

nonunion, graft fracture and infection. These are most often due to poor

vascularization of the graft bed. To overcome this, bone tissue engineering method

has been developed that uses growth factor as an angiogenic stimulator (angiogenic

growth factor). The most important growth factor that is responsible for bone

healing is the platelet derived growth factor BB (PDGF BB).

This study employed a Post Test Only Control Group Design using 32

Wistar rats divided into 2 groups: a treatment group receiving 40 ng/ml recombinant

rat PDGF BB (rrPDGF BB) and a control group without administration of rrPDGF

BB. Four weeks after treatment, vascular endothelial growth factor (VEGF), bone

morphogenetic protein-2 (BMP 2) and osteocalcin expressions were identified and

quantified using immunohistochemistry. The presence of bridging callus was

assessed histopathologically using hematoxylin eosin (HE) staining.

The administration of rrPDGF BB on fresh frozen allograft post

reconstructive surgery of large bone defects on Wistar rats showed a statistically

significant higher expression of VEGF, BMP 2 and osteocalcin as compared to the

control group (p=0.000). The presence of bridging callus on the fresh frozen

allograft was also showed to be statistically significant (p=0.003).

It can be concluded that the application of recombinant rat PDGF BB

significantly enhances the formation of new bone through increased expression of

VEGF, BMP 2 and osteocalcin.

Keyword: PDGF BB, VEGF, BMP 2, Osteocalcin, Allograft, Bridging Callus

ix

RINGKASAN

PEMBERIAN RECOMBINANT RAT PLATELET DERIVED GROWTH

FACTOR BB MENSTIMULASI PEMBENTUKAN BRIDGING CALLUS

PADA FRESH FROZEN ALLOGRAFT PASCA PEMBEDAHAN

REKONSTRUKSI DEFEK TULANG LUAS FEMUR TIKUS WISTAR

MELALUI PENINGKATAN EKSPRESI VASCULAR ENDOTHELIAL

GROWTH FACTOR, BONE MORPHOGENETIC PROTEIN 2 DAN

OSTEOCALCIN

Defek tulang yang luas dapat disebabkan karena trauma dan non trauma

(pasca eksisi tumor). Salah satu tatalaksana pada defek tulang luas adalah

pembedahan rekonstruksi dengan bone grafting menggunakan intercalary

allografts. Fresh frozen allograft adalah jenis allograft yang sering digunakan

untuk pembedahan rekonstruksi defek tulang luas karena masih memiliki kekuatan

biomekanik yang mendekati tulang normal, imunogenisitas yang rendah dan

ukurannya dapat disesuaikan dengan defek yang diperlukan (Shukla et al., 2003).

Komplikasi penggunaan allograft untuk rekonstruksi defek tulang luas

adalah nonunion, fraktur pada graft dan infeksi (Ogura et al., 2015). Penyebab

utama terjadinya komplikasi di atas adalah karena vaskularisasi dari graft bed yang

tidak baik. Untuk mengatasi komplikasi tersebut, dikembangkan metode bone

tissue engineering yang menggunakan faktor pertumbuhan sebagai stimulator

vaskularisasi (angiogenic growth factors) (Ami R Amini et al., 2012). Growth

factors yang sering dipakai sebagai stimulator inkorporasi allograft yaitu VEGF,

Fibroblast Growth Factor (FGF-2) dan Platelet Derived Growth Factor (PDGF)

(Frohlich et al., 2008).

PDGF adalah salah satu faktor pertumbuhan yang saat ini masih belum

banyak diteliti dalam perannya terhadap inkorporasi allograft khususnya fresh

frozen allograft. Platelet Derived Growth Factor BB (PDGF BB) bersifat

kemotaktik dan mitogenik untuk osteoblas sehingga dapat berfungsi sebagai faktor

yang dapat meningkatkan penyembuhan fraktur dengan cara menarik sel

osteoprogenitor ke lokasi fraktur dan meningkatkan jumlah mitogenesis, serta

bersifat proangiogenic dan melakukan up-regulating VEGF untuk menstimulasi

angiogenesis (Hollinger et al., 2008). Penelitian menggunakan recombinant human

platelet derived growth factor (rhPDGF) untuk regenerasi defek periodontal dengan

dengan allograft tulang memberikan hasil regenerasi yang sangat baik (Nevins et

al., 2003). Sampai saat ini masih belum diketahui apakah pemberian PDGF pada

fresh frozen allograft yang ditanamkan pada defek tulang luas femur tikus dapat

meningkatkan penyembuhan tulang dari allograft yang ditandai dengan ekspresi

VEGF, BMP 2 dan osteocalcin yang lebih tinggi

Tujuan penelitian ini adalah untuk memperkuat teori penyembuhan tulang

pada allograft setelah pemberian rrPDGF BB pasca pembedahan rekonstruksi defek

tulang luas melalui peran VEGF, BMP 2, dan osteocalcin.

x

Penelitian ini dilakukan dengan rancangan post test only control group

design. Sampel penelitian ini adalah tikus Wistar jantan berusia 12 minggu yang

dilakukan pembedahan rekonstruksi defek tulang luas (1 cm), menggunakan fresh

frozen allograft yang fiksasi dengan Kirschner Wire 1,2 mm. Masing-masing

kelompok, baik kelompok perlakuan yang mendapatkan rrPDGF BB dengan dosis

100 µL dengan kosentrasi 40 ng/ml, maupun kelompok kontrol adalah berjumlah

16 tikus, sehingga total didapatkan 32 sampel. Adapun kriteria inklusi adalah tikus

jantan, usia 12 minggu, berat 200-250 gram, sehat, dan ditandai gerakan aktif.

Sedangkan kriteria eksklusi adalah tikus sakit (gerakan tidak aktif) atau tidak mau

makan saat penelitian.

Hasil penelitian menunjukkan median ekspresi VEGF pada allograft pada

kelompok perlakuan dengan pemberian rrPDGF BB adalah sebesar 9,00 dengan

interquartile range 0,38, sedangkan pada kelompok kontrol adalah sebesar 5,00

dengan interquartile range 2,75 yang secara statistik berbeda bermakna dengan

nilai p = 0,00 (p < 0,05). Pada kelompok perlakuan dengan pemberian rrPDGF BB

dan kontrol menunjukkan ekspresi BMP 2, tetapi pada kelompok perlakuan

ditemukan ekspresi BMP 2 dengan intensitas tinggi (56,2%), sedang (37,5%) dan

ringan (6,3%), sedangkan pada kelompok kontrol hanya ditemukan ekspresi BMP

2 dengan intensitas ringan (31,3%) dan sedang (68,7%). Hail ini secara statistik

berbeda bermakna dengan p = 0,001 (p<0,05). Median ekspresi osteocalcin pada

kelompok perlakuan dengan pemberian rrPDGF BB adalah sebesar 28,00 dengan

interquartile range 8,75, sedangkan pada kelompok kontrol adalah sebesar 15,00

dengan interquartile range 2,00 yang secara statistik berbeda bermakna dengan

nilai p = 0,000 (p < 0,05). Jumlah sampel yang menunjukkan pembentukan bridging

callus pada allograft kelompok perlakuan sebanyak 43,8%, sedangkan pada

kelompok kontrol tidak ditemukan bridging callus yang secara statistik berbeda

bermakna dengan nilai p = 0,003 (p<0,005).

rrPDGF BB secara tidak langsung berpengaruh terhadap peningkatan

ekspresi osteocalcin, tetapi melalui peningkatan ekspresi VEGF dan BMP 2 yang

merangsang pembentukan sel osteoblas dari sel mesenkim. Osteocalcin yang

terbentuk menyebabkan terjadinya mineralisasi sampai pada bagian tengah tulang

femur sehingga terbentuk bridging callus sampai kebagian tengah tulang femur

yang berbeda bermakna dengan kontrol.

Kebaharuan dari penelitian ini adalah recombinant Rat PDGF BB yang

diberikan pada fresh frozen allograft menghasilkan pembentukan bridging callus

dari bagian proksimal, tengah dan distal allograft pasca pembedahan rekonstruksi

defek tulang luas femur tikus.

Dari data di atas dapat disimpulkan bahwa pemberian recombinant rat

PDGF BB secara signifikan dapat meningkatkan pembentukan tulang baru dan

mineralisasi tulang sehingga menginisiasi proses union pada defek tulang luas

femur tikus melalui peningkatan ekspresi VEGF, BMP 2 dan osteocalcin.

xi

DAFTAR ISI

Halaman

SAMPUL DEPAN

SAMPUL DALAM .................................................................................................. i

PERSYARATAN GELAR ..................................................................................... ii

PERSETUJUAN PROMOTOR DAN KOPROMOTOR ...................................... iii

PENETAPAN PANITIA PENGUJI ...................................................................... iv

SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIARISME .............................................. v

UCAPAN TERIMA KASIH .................................................................................. vi

ABSTRAK ............................................................................................................ vii

ABSTRACT ........................................................................................................... viii

RINGKASAN ........................................................................................................ ix

DAFTAR ISI .......................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ................................................................................................. xv

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xvi

DAFTAR SINGKATAN .................................................................................... xvii

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xx

BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang Masalah ................................................................................ 1

1.2 Rumusan Masalah ......................................................................................... 6

1.3 Tujuan Penelitian .......................................................................................... 6

1.3.1 Tujuan Umum ........................................................................................ 6

1.3.2 Tujuan khusus ........................................................................................ 7

1.4 Manfaat Penelitian ........................................................................................ 7

1.4.1 Manfaat Akademik/Ilmiah ..................................................................... 7

1.4.2 Manfaat praktis....................................................................................... 8

BAB II KAJIAN PUSTAKA ................................................................................. 9

2.1 Anatomi Dan Histologi Dari Tulang ............................................................. 9

xii

2.1.1 Osteoklas .............................................................................................. 13

2.1.2 Osteoblas .............................................................................................. 15

2.1.3 Osteosit ................................................................................................. 17

2.1.4 Matriks ekstraseluler tulang ................................................................. 20

2.2 Proses Penyembuhan Tulang ...................................................................... 21

2.2.1 Osifikasi intramembran ........................................................................ 21

2.2.2 Osifikasi endokondral .......................................................................... 24

2.2.3 Penyembuhan tulang pada allograft .................................................... 29

2.3. Pembedahan Rekonstruksi Defek Tulang Luas Dengan Fresh Frozen

Allograft ............................................................................................................ 31

2.3.1 Pembedahan rekonstruksi defek tulang luas ........................................ 35

2.3.2 Allograft ............................................................................................... 37

2.4 Platelet Derived Growth Factor (PDGF) ................................................... 42

2.4.1 Peran PDGF pada remodeling vaskular ............................................... 46

2.4.2 Peran PDGF pada Proses Penyembuhan Tulang ................................. 47

2.5 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) ........................................... 51

2.5.1 Pengaruh VEGF pada sel tulang .......................................................... 52

2.5.2 Pengaruh VEGF pada osteoblas ........................................................... 53

2.5.3 Pengaruh VEGF pada osteoklas ........................................................... 53

2.5.4 Pengaruh VEGF pada osifikasi endokondral ....................................... 55

2.5.5 Pengaruh VEGF pada osifikasi intramembran ..................................... 56

2.6 Bone Morphogenetic Protein-2 ................................................................... 57

2.6.1 Bone morphogenetic protein dan penyembuhan tulang ....................... 60

2.6.2 Bone morphogenetic protein dan allograft .......................................... 61

2.7 Biologi Molekuler Proses Osteogenesis ..................................................... 66

xiii

BAB III KERANGKA BERPIKIR, KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS 69

3.1 Kerangka Berpikir ....................................................................................... 69

3.2 Kerangka Konsep ........................................................................................ 76

3.3 Hipotesis ...................................................................................................... 77

BAB IV METODE PENELITIAN ...................................................................... 78

4.1 Rancangan Penelitian .................................................................................. 78

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian ...................................................................... 79

4.3 Penentuan Sumber Data .............................................................................. 79

4.3.1 Populasi ................................................................................................ 79

4.3.2 Sampel penelitian dan cara pengambilan sampel................................. 79

4.3.3 Kriteria eksklusi dan drop-out ............................................................. 79

4.3.4 Besar Sampel ........................................................................................ 79

4.3.5 Teknik penentuan sampel ..................................................................... 80

4.4 Variabel Penelitian ...................................................................................... 80

4.4.1 Klasifikasi variabel............................................................................... 80

4.4.2 Definisi Operasional Variabel .............................................................. 81

4.5 Alat dan Bahan ............................................................................................ 82

4.5.1 Alat ....................................................................................................... 82

4.5.2 Bahan ................................................................................................... 83

4.6 Prosedur Penelitian...................................................................................... 83

4.7 Alur Penelitian ............................................................................................ 85

4.8 Analisis Data Penelitian .............................................................................. 86

BAB V HASIL PENELITIAN ............................................................................ 87

5.1 Karakteristik Subjek Penelitian ................................................................... 87

5.2 Pengaruh Pemberian rrPDGF BB Terhadap Ekspresi VEGF ..................... 87

5.3 Pengaruh Pemberian rrPDGF BB Terhadap Ekspresi BMP 2 .................... 88

xiv

5.4 Pengaruh Pemberian rrPDGF BB Terhadap Ekspresi Osteocalcin ............ 90

5.5 Pengaruh Pemberian rrPDGF BB Terhadap Pembentukan Bridging Callus

........................................................................................................................... 91

5.6 Pengaruh Pemberian rrPDGF BB Dengan Ekspresi VEGF, BMP 2,

Osteocalcin dan Bridging Callus ...................................................................... 93

BAB VI PEMBAHASAN .................................................................................... 95

6.1 Pengaruh rrPDGF BB Terhadap Ekspresi VEGF ....................................... 95

6.2 Pengaruh rrPDGF BB Terhadap BMP 2 ..................................................... 99

6.3 Pengaruh rrPDGF BB Terhadap Ekspresi Osteocalcin ............................ 100

6.4 Pengaruh rrPDGF BB Terhadap Bridging Callus ..................................... 103

6.5 Pengaruh rrPDGF BB Terhadap Pembentukan Bridging Callus Melalui

Ekspresi VEGF, BMP 2 dan Osteocalcin. ...................................................... 105

6.6 Novelty....................................................................................................... 106

BAB VII SIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 107

7.1 Simpulan ................................................................................................... 107

7.2 Saran .......................................................................................................... 108

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 109

LAMPIRAN ........................................................................................................ 117

xv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 5.1 Hasil uji komparabilitas data ekspresi VEGF pada kelompok perlakuan

dan kontrol dengan uji Mann-Whitney U .............................................................. 88

Tabel 5.2 Hasil uji komparabilitas ekspresi BMP 2 pada kelompok perlakuan dan

kontrol ................................................................................................................... 89

Tabel 5.3 Hasil uji komparabilitas ekspresi osteocalcin pada kelompok perlakuan

dan kontrol ............................................................................................................ 91

Tabel 5.4 Hasil uji komparabilitas pembentukan bridging callus pada kelompok

perlakuan dan kontrol. ........................................................................................... 92

Tabel 5.5 Path analysis pemberian PDGF terhadap bridging callus ................... 94

xvi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Struktur osteon. ................................................................................. 12

Gambar 2.2 Diagram ilustrasi skematik transisi osteoblas menjadi osteosit ........ 18

Gambar 2.3 Peran PDGF pada Proses Pembentukan Tulang ............................... 49

Gambar 2.4 Proses penyembuhan tulang melibatkan PDGF ................................ 49

Gambar 2.5 Skema efek VEGF pada angiogenesis dan osteogenesis .................. 54

Gambar 2.6 Aktivitas osteogenik BMP ................................................................ 59

Gambar 2.7 Struktur kimia osteocalsin ................................................................. 62

Gambar 2.8 Sekresi dan post-translasional modifikasi osteocalcin ...................... 64

Gambar 2.9 Growth Factor Signaling Pathways yang memediasi proliferasi sel –

sel stromal multipotensial ..................................................................................... 66

Gambar 2.10 Target molekuler potensial pada prekursor sel osteogenik dan

osteoklas yang diinduksi oleh inhibisi proteosome ............................................... 67

Gambar 2.11 Regulasi diferensiasi osteoblas dan kondrosit oleh Runx-2 ............ 68

Bagan 3.1 Kerangka Berpikir Penelitian ............................................................... 75

Bagan 3.2 Kerangka Konsep Penelitian ................................................................ 76

Gambar 4.1 Skema Rancangan Penelitian ............................................................ 78

Gambar 4.2 Alur Penelitian.................................................................................. 85

Bagan 5.1 Path Analysis dengan fitting target model. .......................................... 93

Bagan 6.1 Hubungan kerangka teori dengan Path analysis ................................ 106

xvii

DAFTAR SINGKATAN

BMP-2 : Bone Morphogenetic Protein-2

BMP-4 : Bone Morphogenetic Protein-4

BMP-7 : Bone Morphogenetic Protein-7

Cbfal : Core binding factor α 1

CCL2 : C-C chemokine 2

COX-2 : Cyclooxygenase-2

DBM : Demineralized Bone Matrix

DBMIM : Demineralized Bone Matrix Intramembranous

EC : Endotelial cells

ECM : Extracellular Matrix

FDA : Food and Drug Association

FGF-2 : Fibroblast Growth Factor-2

FGFs : Fibroblast Growth Factors

FLK-1 : Fetal Liver Kinase-1

GAGs : Glycosaminoglycans

GF : Growth Factor

Gla : Gamma Linolenic acid

HA : Hyaluronic Acid

HIF : Hypoxia Inducible Factor

HIV : Human Immunodeficiency Virus

IGF : Insulin-like Growth Factor

IL-1 : Interleukin-1

xviii

KDR : Kinase insert Domain Receptor

M-CSF : Macrophage- Colony Stimulating Factor

MMP-9 : Matrix Metallopeptidase-9

mRNA : messenger Ribonucleic Acid

MSC : Mesenchymal Stem Cells

NO : Nitric Oxide

OCP : Osteoclast Precursor

OP-1 : Osteogenetic Protein-1

OPG : Osteoprotregin

OPN : Osteopontin

OSCAR : Osteoclast-associated receptor

PDGF : Platelet-derived Growth Factor

PDGF-AA : Platelet-derived Growth Factor-AA

PDGF-AB : Platelet-derived Growth Factor-AB

PDGF-BB : Platelet-derived Growth Factor-BB

PDGF-CC : Platelet-derived Growth Factor-CC

PDGF-DD : Platelet-derived Growth Factor-DD

PDGFR : Platelet-derived Growth Factor Receptor

PDLLA : Poly-D, L-Lactide

PRGF : Plasma-rich Growth Factor

PRP : Platelet-rich Plasma

PTH : Parathyroid Hormone

RA : Rheumathoid Arthritis

xix

RANKL : Receptor Activatorof Nuclear Factor k-B Ligand

rhBMP-7 : Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-7

rhPDGF : Recombinant Human Platelet-derived Growth Factor

rrPDGF-BB : Recombinant Rat Platelet-derived Growth Factor-BB

Runx-2 : Runt-related transcription factor 2

SOS : Son of Sevenless

TCP : Tricalcium Phosphate

TGF - β : Transforming Growth Factor β

TNF : Tumor Necrosis Factor

TREM-2 : Trigerring Receptor Expressed in Myeloid Cells-2

VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor

VEGF-A : Vascular Endothelial Growth Factor-A

VEGF-B : Vascular Endothelial Growth Factor-B

VEGF-C : Vascular Endothelial Growth Factor-C

VEGF-D : Vascular Endothelial Growth Factor-D

VEGFR : Vascular Endhotelial Growth Factor Receptor

VEGFR-1 : Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1

xx

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan Kelaikan Etik ..................................................... 117

Lampiran 2. Surat Persetujuan Pelaksanaan Penelitian ...................................... 119

Lampiran 3. Hasil Pemeriksaan Histopatologi dan Imunohistokimia ................ 123

Lampiran 4. Pemeriksaan VEGF ........................................................................ 128

Lampiran 5. Pemeriksaan BMP-2 ....................................................................... 130

Lampiran 6. Pemeriksaan Osteocalcin ................................................................ 132

Lampiran 7. Pemeriksaan Bridging Callus ......................................................... 134

Lampiran 8. Data Analisis SPSS ......................................................................... 135

Lampiran 9. Foto Dokumentasi Penelitian.......................................................... 153

1

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Defek tulang luas dapat disebabkan karena trauma dan non trauma (pasca eksisi

tumor). Salah satu tatalaksana pada defek tulang luas adalah pembedahan

rekonstruksi. Pada tindakan pembedahan rekonstruksi memerlukan prosedur bone

grafting untuk mengisi defek tulang. Sumber tulang dapat berasal dari autograft,

allograft, xenograft dan allograft prosthesis composite (APC). Allograft saat ini

menjadi pilihan karena memiliki kekuatan biomekanik yang lebih baik dan tidak

terjadi morbiditas pada lokasi donor dibandingkan dengan autograft. Komplikasi

penggunaan allograft untuk rekonstruksi defek tulang luas adalah nonunion, fraktur

pada graft dan infeksi. Untuk mengurangi risiko terjadinya komplikasi tersebut

diatas, maka saat ini dikembangkan bone tissue engineering dengan menggunakan

allograft dan growth factor yang dapat menstimulasi pembentukan bridging callus

melalui mekanisme VEGF, BMP 2 dan osteocalcin.

Allograft termasuk graft yang paling sering digunakan sebagai alternatif

pengganti autograft. Allograft memiliki beberapa keunggulan dibandingkan

autograft, yaitu mengurangi morbiditas lokasi donor dan perdarahan serta

ketersediaan tulang yang lebih banyak. Fresh frozen allograft adalah jenis allograft

yang sering digunakan untuk pembedahan rekonstruksi defek tulang luas karena

memiliki kekuatan biomekanik mendekati tulang normal, imunogenitas rendah dan

ukurannya dapat disesuaikan dengan defek yang diperlukan (Shukla et al., 2003).

2

Fresh frozen allograft juga memiliki kemampuan osteoinduktif dimana

mengandung Bone Morphogenetic Proteins (BMPs). Selain itu fresh frozen

allograft juga mengandung VEGF pada matriks yang tidak terkalsifikasi, meskipun

dalam jumlah yang tidak banyak (Rodella et al., 2010). Fresh frozen Allograft yang

digunakan sebagai salah satu metode rekonstruksi defek luas tulang, biasanya

disebut intercalary allografts. Komplikasi yang sering terjadi pada penggunaan

fresh frozen allograft ini adalah peningkatan risiko terjadinya nonunion (12-57%),

fraktur (17-30%) dan infeksi (10-15%) (Ogura et al., 2015). Pada studi lain,

dilaporkan insiden terjadinya infeksi juga dilaporkan bervariasi dari 6% - 13%

(Delloye et al., 2007). Pada penelitian lain juga disebutkan bahwa insiden nonunion

sebesar 11% pada penggunaan massive fresh frozen allograft (Vander Griend,

1994). Penyebab utama dari terjadinya nonunion adalah karena vaskularisasi dari

graft bed yang kurang baik (Shukla et al., 2003). Hal ini yang mendorong peneliti

untuk terus mengembangkan metode yang optimal dalam mengatasi risiko-risiko

tersebut diatas salah satunya adalah dengan bone tissue engineering.

Dalam perkembangannya, prosedur bone tissue engineering menggunakan

faktor pertumbuhan sebagai bahan yang berfungsi sebagai stimulator vaskularisasi

(angiogenic growth factors) (Amini et al., 2012). Growth factors yang sering

dipakai sebagai stimulator inkorporasi allograft yaitu VEGF, Fibroblast Growth

Factor (FGF-2) dan Platelet Derived Growth Factor (PDGF) (Frohlich et al.,

2008).

Platelet Derived Growth Factor adalah salah satu faktor pertumbuhan yang

saat ini masih belum banyak diteliti dalam perannya terhadap inkorporasi allograft

3

khususnya fresh frozen allograft. Beberapa penelitian menggunakan recombinant

human platelet derived growth factor (rhPDGF) pada kasus regenerasi defek

periodontal dimana dikombinasi dengan allograft tulang dan memberikan hasil

regenerasi yang sangat baik (Nevins et al., 2003).

Platelet Derived Growth Factor adalah suatu kelompok protein yang terdiri

dari PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD yang diproduksi

oleh platelet saat terjadi fraktur. Platelet Derived Growth Factor BB bersifat

kemotaktik dan mitogenik untuk osteoblas sehingga dapat berfungsi sebagai faktor

yang dapat meningkatkan penyembuhan fraktur dengan cara menarik sel

osteoprogenitor ke lokasi fraktur dan meningkatkan jumlah mitogenesis. Selain itu,

PDGF-BB bersifat proangiogenik, yang melakukan up-regulating VEGF untuk

menstimulasi pertumbuhan pembuluh darah kapiler baru. Platelet Derived Growth

Factor juga meningkatkan ekspresi VEGF yang merupakan molekul kunci dalam

proses regenerasi tulang. Administrasi lokal dari PDGF meningkatkan

penyembuhan tulang pada kelinci yang dilakukan osteotomy. Pemberian

recombinant human platelet derived growth factor (rhPDGF-BB) juga dapat

meningkatkan densitas tulang dan kekuatan biomekanik pada tulang tikus yang

osteoporosis (Hollinger et al., 2008). Pada studi serial kasus, pemberian rhPDGF-

BB dengan dikombinasikan beta TCP memberikan hasil yang secara signifikan

mengecilnya defek pada infrabony gigi (Thakare et al., 2013). Penelitian yang

dilakukan untuk mengetahui peran PDGF sebagai terapi potensial dalam

pembentukan tulang dan penyembuhan fraktur memberikan hasil yang positif

(Graham et al., 2009). Pemberian PDGF lokal pada biodegradable poly-D, L-

4

Lactide (PDLLA)-coated implants secara signifikan meningkatkan kecepatan

pertumbuhan tulang tibia tikus (Bordei, 2011). Penelitian lain yang dilakukan pada

manusia, dimana dilakukan ankle arthrodesis, dan dikombinasikan dengan

pemberian rrPDGF-BB/ beta-tricalcium phosphate (beta-TCP) memberikan hasil

keluhan nyeri yang lebih kecil (Hollinger et al., 2008).

Vascular Endothelial Growth Factor adalah mitogen khusus untuk sel endotel

vaskular. Pertama kali diidentifikasi sebagai faktor pertumbuhan endotel dari sel-

sel folikel hipofisis sapi oleh Ferrara dan Davis Symth (Yang et al., 2012). VEGF

juga berfungsi untuk mempromosikan kemotaksis mesenchymal stem cell (MSC).

Periosteum, otot, jaringan adiposa, dan sumsum tulang merupakan sumber yang

kaya MSC yang mampu berdeferensiasi menjadi osteoblas, dan juga menyediakan

sel progenitor endotel yang mendukung postnatal vasculogenesis. Vaskulogenesis

dan angiogenesis dipicu oleh peningkatan kadar VEGF lokal dan sistemik, sehingga

memungkinkan mobilisasi substrat osteogenik, stem cell pericyte, dan MSC yang

mampu berdiferensiasi menjadi tambahan osteoblas. Proses ini memberi umpan

balik positif antara osteoblas dan sel endotel (Beamer et al., 2010).

BMP merupakan sitokin multifungsi yang mempengaruhi diferensiasi

berbagai tipe sel. Hampir semua efek BMP 2 tergantung pada waktu dan

konsentrasi (Steinert et al., 2008). BMP 2 memiliki sifat kemotaktik terhadap

monosit manusia dan menstimulasi ekspresi sitokin angiogenesis TGF-β1. Monosit

dalam sirkulasi meninggalkan aliran darah dan memasuki jaringan, dimana akan

terjadi diferensiasi menjadi makrofag, yang dapat mensekresikan sitokin yang

mempromosikan respon angiogenik (Raida et al., 2005). Osteocalcin berperan serta

5

dalam mineralisasi tulang, berfungsi sebagai kemoantraktan dari monosit, sel

mesenkim, dan sel resorpsi seperti osteoklas (Patti et al., 2013).

PDGF meningkatkan konsentrasi VEGF dengan cara merangsang sel

pericytes menghasilkan VEGF. Penigkatan VEGF ini akan mempercepat proses

pembentukan pembuluh darah baru atau angiogenesis pada daerah cedera dengan

menstimulasi proliferasi sel endotel pembuluh darah (Hollinger et al., 2008). PDGF

ini juga merangsang proliferasi sel mesenkim menjadi osteoblas yang berperan

dalam proses pembentukan tulang baru. Sel osteoblas matur yang terbentuk akan

mengeluarkan BMP 2 dan selanjutnya merangsang diferensiasi sel mesenkim

menjadi sel osteoblas (Scarfì, 2016). Osteoblas yang terbentuk akan memproduksi

osteocalcin yang berperan dalam mineralisasi tulang dan sebagai kemoantraktan

monosit, sel mesenkim serta osteoklas. Hal ini dibuktikan dengan ditemukannya

osteocalcin pada tulang dengan aktifitas mineralisasi yang tinggi (Patti et al., 2013).

Hasil akhir dari adanya peningkatan pembentukan pembuluh darah baru dan

peningkatan pembentukan sel osteoblas dewasa akibat stimulasi PDGF BB adalah

terbentuknya kalus pada bagian tulang yang mengalami defek.

Sampai saat ini masih belum diketahui apakah pemberian PDGF pada fresh

frozen allograft yang ditanamkan pada defek tulang luas femur tikus dapat

meningkatkan penyembuhan tulang dari allograft yang ditandai dengan

terbentuknya bridging callus melalui ekspresi VEGF, BMP 2 dan osteocalcin yang

lebih tinggi.

6

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah yang diuraikan diatas, untuk membuktikan

adanya ekspresi VEGF, BMP-2 dan osteocalcin yang lebih tinggi pada fresh frozen

allograft, maka disusun rumusan masalah sebagai berikut:

1. Apakah ekspresi VEGF pada fresh frozen allograft yang diberikan rrPDGF

BB lebih tinggi daripada fresh frozen allograft tanpa pemberian rrPDGF

BB pasca pembedahan rekonstruksi defek tulang luas femur tikus?

2. Apakah ekspresi BMP-2 pada fresh frozen allograft yang diberikan rrPDGF

BB lebih tinggi daripada fresh frozen allograft tanpa pemberian rrPDGF BB

pasca pembedahan rekonstruksi defek tulang luas femur tikus?

3. Apakah ekspresi osteocalcin pada fresh frozen allograft yang diberikan

rrPDGF BB lebih tinggi daripada fresh frozen allograft tanpa pemberian

rrPDGF BB pasca pembedahan rekonstruksi defek tulang luas femur tikus?

4. Apakah terdapat perbedaan pembentukan bridging callus pada fresh frozen

allograft yang diberikan rrPDGF BB dibandingkan tanpa pemberian

rrPDGF BB pasca pembedahan rekonstruksi defek tulang luas femur tikus

wistar?

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Untuk memperkuat teori penyembuhan tulang pada allograft setelah pemberian

rrPDGF BB pasca pembedahan rekonstruksi defek tulang luas melalui peran VEGF,

BMP 2, dan osteocalcin.

7

1.3.2 Tujuan khusus

1. Untuk membuktikan ekspresi VEGF pada fresh frozen allograft yang

diberikan rrPDGF BB lebih tinggi daripada fresh frozen allograft tanpa

pemberian rrPDGF BB pasca pembedahan rekonstruksi defek tulang luas

femur tikus.

2. Untuk membuktikan ekspresi BMP 2 pada fresh frozen allograft yang

diberikan rrPDGF BB lebih tinggi daripada fresh frozen allograft tanpa

pemberian rrPDGF BB pasca pembedahan rekonstruksi defek tulang luas

femur tikus.

3. Untuk membuktikan ekspresi osteocalcin pada fresh frozen allograft yang

diberikan rrPDGF BB lebih tinggi daripada fresh frozen allograft tanpa

pemberian rrPDGF BB pasca pembedahan rekonstruksi defek tulang luas

femur tikus.

4. Untuk membuktikan terdapat perbedaan pembentukan bridging callus pada

fresh frozen allograft yang diberikan rrPDGF BB dibandingkan tanpa

pemberian rrPDGF BB pasca pembedahan rekonstruksi defek tulang luas

femur tikus wistar

1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat Akademik/Ilmiah

Apabila penelitian ini terbukti, diharapkan hasilnya dapat menambah ilmu

pengetahuan tentang teori rrPDGF BB dalam penyembuhan tulang pada fresh

8

frozen allograft melalui peran VEGF, BMP 2 dan osteocalcin setelah pembedahan

rekonstruksi defek tulang luas.

1.4.2 Manfaat praktis

Apabila penelitian ini terbukti dapat dipergunakan sebagai data penelitian

lebih lanjut untuk penelitian klinis tentang rrPDGF BB dalam penyembuhan tulang

pada fresh frozen allograft sehingga komplikasi yang sering terjadi pada

pembedahan rekonstruksi defek luas dengan fresh frozen allograft yaitu terjadinya

nonunion dan fraktur dapat dicegah.