DETEKSI VIRUS MENGGUNAKAN ANALISA GENOMIK DAN...
Transcript of DETEKSI VIRUS MENGGUNAKAN ANALISA GENOMIK DAN...
-
DETEKSI VIRUS MENGGUNAKAN ANALISA GENOMIK DAN PROTEOMIK
Bambang SugihartoLaboratorium Biologi Molekul dan Bioteknologi
UPT. Laboratorium Terpadudan Sentra Inovasi-Teknologi CDAST
UNIVERSITAS JEMBERJl. Kalimantan No. 37 Jember, 68121 Email : [email protected]
-
Kenampakan gejala penyakit akibat infeksi virus
Sugarcane mosaic virus?
Ringspot Virus ?
Infeksi pada hewan
Analisa Laboratorium ?
-
PENDAHULUAN :
BIOLOGI – BIOLOGI MOLEKUL – NANO BIOLOGIHubungan antara objek biologi dan ukuranya
nano scale micro scale milli scale
-
Helical Polyhedral Spherical Complex
TIPE MORFOLOGI VIRUS
Virus tidak mempunyai alat reproduksi
-
Virus Ebola
STRUKTUR MOLEKUL VIRUS
Partikel virus (virion) tersusun:1. Nukleotida DNA atau RNA 2. Protein dan Enzyme3. Membrane envelope
SCMV
Virus Corona
-
ANALISA LABORATORIUM Deteksi molekul virus
✓ Pesatnya perkembangan ilmu pengetahuandan teknologi
✓ Analisa biologi dilakukan pada tataranmolekul, reaksi biokimia dan nano-struktur
✓ Sel tersusun oleh makro molekul DNA, RNA dan protein
✓ Setiap molekul DNA atau protein adaperbedaan yang mencirikan organisma
✓ Perbedaan antar molekul dapat digunakanuntuk deteksi organisma yang lebih tepatdan akurat
Analisa molekul organisma
-
DETEKSI VIRUS
Analisis Genomik(identifikasi, pengukuran ekspresi, perbandingan struktur DNA pada tingkat genome)
Analisis Proteomik(identifikasi dan kuantifikasiprotein pada system biologi )
Berbasis reaksi polymerasePCR (polymerase chain reaction)RT-PCR, Reverse Transcriptase-PCRReal-Time PCR (qPCR, quantitative)
Berbasis hybridisasi DNASouthern Blot, Analisa DNANouthern Blot, Analisa RNA
Sequencing DNAAnalisa lain
Berbasis Reaksi Serologi denganpelacak (probe) antibodi
Immunobloting, Analisa kualititatif
ELISA (Enzyme-linked aimmunosorbent assay)Analisa kuantitatif
Rapid TestDeteksi IgG/IgMDeteksi protein virus
-
ANALISA PCR DAN RT-PCR – PRINSIP DASAR(Reaksi polimerisasi/replikasi DNA yang diulang-ulang)5’ 3’
5’3’
5’ 3’
5’3’5’ 3’
5’3’
5’ 3’
5’3’
5’ 3’
5’3’5’
5’
3’
3’
5’ 3’
5’3’
5’3’5’3’
denaturation (94 oC)
primer annealing (50-70 oC)
primer extension (72 oC)
Next round…..
5’ 3’AAAAAnTTTTTn
5’ 3’AAAAAnTTTTTn
first-strand cDNA synthesis by RT
5’3’
TTTTTn 5’3’5’
TTTTTn3’ 5’ AAAAAn
RNase treatment;primer annealing (50-70 oC)
primer extension (72 oC)
mRNA
TTTTTn3’
5’
5’
AAAAAn
TTTTTnAAAAAn
Next round…..
DNA
2n DNA Reaksi PCR
-
Hasil PCR dan visualisasi agarose gel elektroforesis (AGE)
M P+ WT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 WT
PCR
RT-PCR
DNA Sequencer
DNA sequence chart
AGEPCR & RT-PCR GelDoc
Deteksi tanaman transgenik
Deteksi DNA SCMV
-
Deteksi Real Time-PCR
Baseline – Siklus PCR permulaan sebelum signal flourescent dapat dideteksiThreshold – Tingkatan dimana flourescent mulai dapat terdeteksi
CT – (cycle threshold) Jumlah siklus PCR dimana jumlah hasil PCR melewati threshold
Rn- Reported signal flourescence
Rn – (Rn-baseline) Reported signal dikurangi Baseline
NTC – no template control
Log
fluor
esce
nce
(Rn)
Kurva eksponensialperbanyakan (amplifikasi) DNA hasil PCR
-
SYBR® green
Amplification Plot Amplification Plot of Standard
76
54
32
Real Time PCR / qPCR (quantitative PCR)
Digunakan penentuan jumlah DNA secara Absolut atau Relative
Menggunakan senyawa flourescense:1. SYBR - EVA Green 2. Primer Probe
-
Real Time PCR atau qPCR – Fluorescence Primer Probe
SYBR Green VS Flourescense Primer 1. Pertimbangan BIAYA2. Spesifisitas, Probe lebih spesifik3. Jumlah target DNA – sedikit atau
banyak
RNA
DNA
Primer probe
Reporter fluorescen
-
Contoh analisis Real Time PCR dengan kit seegene
-
ANALISIS PROTEOMIK – Serological Test(Analisis berdasarkan reaksi antigen dengan antibody)
Pemisahan dan visualisasi protein menggunakan gel elektroforesis
Elektroforesis vertikal
SDS-PAGE 2D elektroferesis
Pemisahanprotein Ecolidan pengecatandengan CBB
Organisma – sel – tersusun oleh banyak macam protein
-
TEST SEROLOGI(Analisis berdasarkan reaksi antigen-protein dengan antibody)
Teori dasar reaksi antara antibodi dan antigen
Visualisasi aglutinasi akibat adanya reaksi antibody dan antigen
Double immunodiffusion
Single radial immunodiffusion Test aglutinasi
-
Immuoblotting – Western Blot(deteksi protein menggunakan pemisahan elektroforesis dan reaksi antibodi)
Ekstraksiprotein daritarget seldengan lysis
Pemisahan protein Transfer ke membran Deteksi protein target
kDa
48
35
75
25
HpSCMVCp – 35S CaMV (DR)
M Ps881(+) 7.11 7.12 7.13 7.15 7.16 7.17 7.18
Deteksi1. Colorimetry2. Chemiluminesscence
Deteksi SCMV menggunakanimmunoblot dg antobodi coat protein
Pertimbangan:1. Sensifitas tinggi2. Bisa melihat ukuran protein target3. Semi-kuantitatif4. Waktu 1 – 2 hari /20 sample5. Perlu training
(Thermo Fisher Scientific)
-
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)(deteksi protein target secara langsung menggunakan reaksi antigen-antibodi)
Absorbansi pada Plate Reader
Tipe ELISA
Pertimbangan:1. Analisa kuantitatif2. Efisien3. Waktu 1–2 hari /96 sample 4. Perlu training
-
Rapid Diagnostic Test (RDT)(test cepat dan mudah berbasis antibody)
Pertimbangan :1. Test cepat bisa 20 min selesai2. Analisa kualitatif3. Bisa dikerjakan kebanyakan masyarakat tidak perlu training4. Sensitifitas rendah, bisa terjadi false negative/positive5. Sering hanya digunakan untuk skrening awal
-
Pembuatan antibodi menggunakan protein recombinant(cara cepat produksi antibodi)
Konstruk
PlasmidTransformasi
Produksi
ProteinPurifikasi
Kontruksi
sintetik DNA
ke vektor
ekspresi
Transformasi
vektor
ekspresi ke
bakteri E.coli
Produksi
protein
rekombinan
skala besar
Pemurnian
protein
menggunakan
resin NiNTA
Induksi
Antibodi
Produksi
AntibodiOuchterlony Western Blot
Injeksi antigen
ke hewan cobaUji reaksi
antara antigen
dan antibodi
Uji sensifitas
antibody
menggunakan
western blot
Pengambilan
antibodi dari
serum darah
hewan coba
Outline pembuatan rekombinan antibodi
Produksidan purifikasirekombinan
Immunoblot - Deteksiinfeksi SCMV denganrekombinan antibodi
-
Mekanisma ketahanan virus pada tanaman transgenik
Protein Base ResistanceCP-MR
RNA Base ResistanceRNAi— Knock down
BAGIMANA DENGAN KETAHANAN VIRUS PADA MANUSIA ???
-
TERIMAKASIHMatur Suwun … Matur Sakalangkung….
The picture was taken after cultivation of GM sugarcane in Confined Field Trial (LUT), 2018